2.6. Ekspresyon Caspase-3 ak Caspase-6

Glycoside nan cistanche ka ogmante tou aktivite SOD nan kè ak tisi fwa, ak siyifikativman redwi kontni an nan lipofuscin ak MDA nan chak tisi, efektivman scavenging divès kalite radikal oksijèn reyaktif (OH-, H₂O₂, elatriye) ak pwoteje kont domaj ADN ki te koze. pa OH-radikal. Cistanche phenylethanoid glikozid gen yon gwo kapasite scavenging nan radikal gratis, yon pi wo kapasite diminye pase vitamin C, amelyore aktivite a nan SOD nan sispansyon espèm, redwi kontni an nan MDA, epi yo gen yon sèten efè pwoteksyon sou fonksyon manbràn espèm. Cistanche polisakarid ka amelyore aktivite SOD ak GSH-Px nan eritrosit ak tisi nan poumon nan sourit senesan eksperimantal ki te koze pa D-galaktoz, osi byen ke diminye kontni an nan MDA ak kolagen an nan poumon ak plasma, ak ogmante kontni an nan elastin, gen yon bon efè scavenging sou DPPH, pwolonje tan an nan ipoksi nan sourit senesan, amelyore aktivite a nan SOD nan serom, ak retade koripsyon fizyolojik nan poumon nan sourit senesan eksperimantal Avèk koripsyon selilè mòfolojik, eksperyans yo te montre ke Cistanche gen bon kapasite antioksidan. epi li gen potansyèl pou yo dwe yon dwòg pou anpeche ak trete maladi po aje. An menm tan an, echinacoside nan Cistanche gen yon kapasite enpòtan pou elimine radikal gratis DPPH epi li gen kapasite pou elimine espès oksijèn reyaktif epi anpeche degradasyon kolagen an radikal gratis, epi tou li gen yon efè reparasyon bon sou domaj anyon radikal gratis timin.

Klike La a Pou Konnen Cistanche Tubulosa Pou Antioksidan

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Sourit TgAPP te montre yon ogmantasyon nan ekspresyon jèn caspase {{0}} (Figi 8C1, H1), ki te enpòtan ak pi gran pase 30 pousan konpare ak ipokanpi yo nan sourit WT (Figi 8H1; p <0.05). Kòm pou ekspresyon caspase -6, pa gen okenn diferans obsève ant sourit transjenik ak sourit ki pa transjenik (Figi 8C2, H2).

Tretman quercetin ak rutin yo te kapab bese nivo caspase{{0}} mRNA nan ipokanp la nan yon fason estatistik enpòtan (Figi 8H1; p <{9}}.05), ak pousantaj anpèchman anviwon 17 pousan. ak 27 pousan pou sourit fi ak gason, respektivman. Nan cortical serebral la, diferans enpòtan yo te obsève sèlman nan tretman ak rutin nan gason (Figi 8C1; p <0.05).

Konsènan tretman kaspas-6, quercetin ak rutin yo pa t fè okenn efè estatistik enpòtan nan cortical a oswa nan ipokanp la (Figi 8C2, H2), menm si nan lèt la Caspase-6 nan gason TgAPP te montre yon tandans pou diminye (Figi 8H2).

2.7. Makè enflamasyon

Rezilta yo jwenn pou ekspresyon jèn nan medyatè enflamatwa IL-1, TNF-, ak IFN- yo montre nan Figi 9.

Nan TgAPP a, te gen yon ogmantasyon enpòtan nan ekspresyon jèn IL{{0}} anviwon 20 pousan nan cortical a ak ipokanp nan tou de sèks konpare ak sourit WT (Figi 9C1, H1; p <0.05). Konsènan TNF-, byenke pi wo nivo mRNA yo montre nan TgAPP, yo pa estatistik enpòtan nan sourit WT (Figi 9C2, H2). Konsènan IFN-, te gen yon ogmantasyon anviwon 30 pousan nan ekspresyon li nan gason, ki te sèlman estatistik enpòtan nan cortical a (Figi 9C3; p <0.05).

Tretman ak quercetin ak rutin, tou de nan fi ak gason, yo te kapab diminye ekspresyon IL{{{0}} nan cortical serebral la ak ipokanp an konparezon ak kontwole sourit TgAPP (Figi 9C1, H1; p < {{8) }}.05), jwenn valè ki sanble ak sa yo ki sourit WT, ak patikilyèman pi ba nan ipokanpi yo nan sourit gason (Figi 9H1; p <0.05).

Efè jeneral tou de tretman flavonoid sou ekspresyon IL{{0}} pa te obsève ak TNF- ni ak INF-. Kidonk, gason TgAPP, sou tretman quercetin, te sibi yon diminisyon enpòtan nan ipokanp TNF- (Figi 9H2; p <0.05) ak nan ekspresyon kortik IFN- (Figi 9C3; p <0.05).

2.8. Evalyasyon newòn dejenere ak pwojeksyon yo

Pa gen okenn siy karakteristik neurodegeneration yo te obsève nan laj kote sourit transjenik TgAPP yo te teste, konpare ak sourit WT, ni tretman ak quercetin ak rutin te montre okenn chanjman pou 4 semèn an konparezon ak TgAPP (Figi S1, Done siplemantè).

2.9. Ekspresyon nan reseptè Glutamate Ionotropik

Pa gen okenn diferans enpòtan yo te jwenn nan ekspresyon reseptè yo, konpare valè yo jwenn pou sourit kontwòl TgAPP yo ak sa yo jwenn pou sourit WT yo. Pa te gen okenn efè remakab tou sou ekspresyon reseptè ionotropik sa yo nan prezans quercetin oswa tretman rutin (Tablo S5, Done siplemantè).

3. Diskisyon

Objektif etid nou an se te evalye enpak de flavonoid, quercetin, ak rutin, nan premye etap yo nan patojèn AD, kèlkeswa efè yo sou neurodegeneration ak / oswa fonksyon mantal. Cortical a ak ipokanp yo te zòn nan sèvo ki anba analiz, paske yo se estrikti nan sèvo ki pi afekte nan AD. Li ta dwe pran an kont ke quercetin ak rutin yo te administre nan yon rejim formul ki gen youn nan de flavonoid yo, imite, nan yon modèl bèt AD, konsomasyon nan yon rejim alimantè moun ki an sante, ki gen yon engredyan aktif.

An patikilye, transgene APPswe nan sourit C57B6 te egzèse yon enpak siyifikatif sou rapò GSH/GSSG, nivo MDA, kapasite anzim antioksidan, ekspresyon APP, aktivite BACE1, ak ekspresyon caspase-3 ak IL-1. Pandan ke mitasyon APP nan imen an jeneralman lakòz AD tipik, yo sitou lye ak patoloji amyloid sèlman nan sourit transjenik APP epi pa gen okenn neurodegeneration aparan [14,15], kòm pa te gen okenn siy karakteristik obsève nan sourit transjenik nou an TgAPP, kontrèman ak sourit WT yo (Done siplemantè, Figi S1). Kontre ak 40 -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nan newòn ipokanp yo te pèmèt nou obsève mòfoloji nikleyè a, paske konpoze sa a se yon lank fliyoresan pou asid nikleyik. Nou pa t 'obsève nwayo fragmenté oswa lobular, tipikman apoptotik; ni nou te obsève okenn diferans remakab konpare seksyon histolojik ipokanp nan liy transjenik kontwòl TgAPP konsènan seksyon WT yo; ni nou te obsève okenn diferans ki genyen ant tretman yo kercetin ak rutin konsènan sourit kontwòl TgAPP yo.

Nan panèl la nan karakteristik byochimik AD yo dwe analize, nou konsantre prensipalman sou detèmine rapò a GSH / GSSG sou youn nan de alimantasyon yo flavonoid, depi rediksyon nan nivo GSH reprezante youn nan makè yo pi enpòtan byochimik bonè nan AD [16,17]. ] e li te obsève pandan patojèn li yo ak pwogresyon maladi. Mezi nan nivo GSH nan sèvo [18] ak, pi resamman, nivo GSH nan san [19] te pwomèt kòm makè dyagnostik pou premye etap yo nan AD. Anplis, efò yo te fè tou pou konplete magazen GSH andojèn poukont yo oswa anvan yo [20-22]. Nan etid nou an, yo te obsève yon bès nan pouvwa rediksyon selilè (GSH/GSSG) nan sourit yo TgAPP konsènan bèt WT, nan tou de gason ak fi, ak nan tou de zòn nan sèvo a. Nan cortical a ak ipokanp tou de sourit WT ak TgAPP, rapò GSH / GSSG te pi ba nan gason pase nan fi. Quercetin ak alimantasyon rutin siyifikativman ogmante rapò GSH / GSSG an konparezon ak sourit TgAPP ki pa trete, ak ogmantasyon sa a te pi pwononse nan ipokanp la. Chanjman yo nan nivo GSH ak GSSG ak rapò GSH/GSSG sou quercetin oswa tretman rutin nan gason, konsènan ogmante pouvwa redox, te pi enpòtan pase nan fi. Rezilta yo nan detèminasyon nou yo ka revele yon baz enpòtan ki kache diferans sèks ki asosye nan sourit Tg2576 nan sansibilite a domaj oksidatif nan makromolekil sou yon bò, depi sistèm nan glutatyon se yon reduktan versatile nan plizyè fonksyon byolojik, ak nan enpak la nan prevansyon. alimantasyon flavonoid nan restore estati fizyolojik li yo nan lòt men an. Kòm nou pral wè nan tout diskisyon sa a, nou mete ogmantasyon nan rapò GSH/GSSG kòm aks prensipal ki ta ka eksplike seri efè yo obsève nan sourit TgAPP yo.

Li te dènyèman te pwopoze ke rapò a GSH / GSSG, olye ke tou senpleman fonksyone kòm yon tanpon redox, ta olye opere kòm yon mekanis regilasyon prensipal, ki pèmèt pwoteyin yo atenn konfòmasyon natif natal yo ak fonksyonalite lè yo byen kontwole balans thiol-disulfide selilè a. pwoteòm. Nan ti bout tan, sistèm nan glutatyon rive kòm esansyèl nan prezève yon proteome ki an sante, ki montre ke dezòd nan glutatyon omeyostaz redox (sa vle di, jenetikman oswa farmakolojik) ogmante agrégation pwoteyin akòz twoub nan efikasite nan otofaji [23]. Se poutèt sa, estrateji ki vize a kenbe omeyostaz redox glutatyon ka gen potansyèl terapetik nan maladi ki asosye ak agrégation pwoteyin, tankou AD. Gen rapò ak prezèvasyon proteome a se machin degradasyon ubiquitin-proteasome, ki enplike nan patojèn AD. Proteazom nan oaza degrade plizyè substrats ki enpòtan anpil nan kenbe omeyostazi newòn, ki gen ladan katabolism nan pwoteyin oksidize ak total. BACE1 sibi ubiquitination, epi li te demontre ke bloke wout la ubiquitin-proteasome pral anpeche degradasyon BACE1 ak konsekans mennen nan ogmante pwodiksyon nan aktivite anzimatik BACE1, plis -klivaj pwodwi C99, ak ogmantasyon nan tou de A 1-40 ak A { {8}} nan selil newòn ak selil ki pa newòn [10]. Etid anvan nou yo te jwenn ke tou de flavonoid, quercetin, ak rutin, afekte divès chemen siyal ak rezo molekilè ki asosye ak modulation nan fonksyon proteazòm nan selil neuroblastom [9]. Anplis de sa, li te demontre ke newòn complétée ak redwi glutatyon (GSH) refè aktivite proteazom yo ak diminye fòmasyon total [11] depi fonksyon proteazom nan redox reglemante [24]. Se poutèt sa, ogmantasyon nan rapò a GSH / GSSG ki gen eksperyans pa bèt yo lè yo gen yon rejim quercetin oswa rutin se ki konsistan avèk modulation nan proteazom nan pa quercetin ak rutin, te demontre ansyen viv deja.

Kòm mansyone deja, move balans redox mennen nan pwoteyin trè oksidatif-modifye ki gen tandans akimile ak kreye total ki lakòz pwoblèm proteazòm [25]. Se konsa, bay wòl enpòtan nan estrès oksidatif nan patojèn nan AD, byomarkè nan estrès oksidatif, ki gen ladan peroksidasyon lipid (nivo MDA) ak anzim antioksidan, yo te evalye nan cortical a ak ipokanp nan sourit yo TgAPP ak WT. SOD, CAT, GR, ak GPx yo se anzim antioksidan ki pi enpòtan ki aji kont radikal gratis oksijèn epi kontwole metabolis radikal gratis nan kò a epi jwe yon wòl nan sistèm dekonpozisyon radikal gratis, pwoteje selil yo nan kò a kont peroksidasyon lipid. . Nan etid nou an, kòm yon konsekans ekspresyon APP, yo te obsève yon diminisyon jeneralize nan aktivite anzim antioksidan nan sourit TgAPP konpare ak sourit WT, yo te estatistik enpòtan pou CAT. Konfòm ak nivo redwi GSH, peroksidasyon lipid te ogmante siyifikativman nan sourit TgAPP yo. Pandan ke sous la nan estrès oksidatif nan AD imen an trè konplèks ak miltifaktoryèl, patoloji amiloid la devlope nan sourit sanble ase yo kòmanse pwosesis la patolojik ki mennen nan ogmante estrès oksidatif nan sèvo a [26]. Bèt trete ak rutin te fè eksperyans yon ogmantasyon nan aktivite CAT nan cortical a ak aktivite GR nan ipokanp la, nan tou de gason ak fi. Se sèlman bèt trete ak rutin ki gen eksperyans chanjman nan ekspresyon jèn nan CAT ak GR nan cortical a ak ipokanp nan tou de gason ak fi ak GPx nan ipokanpi yo nan sourit fi. Nan kontèks sa a, yo te montre plizyè konpoze natirèl yo afekte diafonis ki genyen ant règleman proteazòm ak redox. Plis jisteman, quercetin se yon aktivatè Nrf2 li te ye [27] ki montre pwopriyete antioksidan atravè eksitasyon nan fonksyon proteasome, ankouraje ogmante rezistans estrès oksidatif ak konfere lonjevite selil amelyore [28].

Ekspresyon tisi-espesifik BACE1 se kritik pou pwosesis nòmal APP, ak ekspresyon disregulation li yo ka jwe yon wòl nan patojèn AD. BACE1 se sitou eksprime nan newòn ipokanp yo, cortical a, ak kouch granulaire serebeleux [10]. Li ta dwe remake ke etid pi bonè yo te montre ke sourit transjenik APP mitasyon Swedish te ogmante siyifikativman nivo nan sèvo A nan yon eta estab [29], ki sijere ke BACE1 jwe yon wòl esansyèl nan chemen an amyloidogenic nan patojèn AD epi li se yon bon sib terapetik. pou tretman AD. Nan etid nou an, nou te obsève yon rediksyon enpòtan nan aktivite BACE1 sou tretman quercetin ak rutin, ki ta ka kontribye nan diminisyon nan depo A nan sourit. Nou diskite ke plis pase sèlman fonksyone kòm inibitè BACE1 nan anzim, quercetin, ak rutin ta ka fè egzèsis yon rediksyon nan aktivite BACE1 ki gen rapò ak yon ogmantasyon nan rapò a GSH / GSSG, ki baze sou ipotèz la nan amelyore rekiperasyon nan aktivite proteasome. Nan sans sa a, li konnen ke vize nan inibitè BACE1 nan sit la -klivaj nan APPswe (Swedish mutation) rive anvan li rive nan manbràn plasma a, tandiske APPwt (Wild-type) trete nan yon endosome bonè ki soti nan sifas selil la. Se poutèt sa, BACE1 ki fende APPwt pafwa mare nan inibitè BACE1 sou sifas selil la anvan pwosesis APP, sepandan, anzim ki trete APPswe se pa [30]. Se pou rezon sa a lokalizasyon an aberan nan pwosesis APPswe ta ka siyifikativman diminye puisans nan quercetin ak rutin kòm inhibiteur BACE1. Se konsa, nou gen plis enkline sipòte ke diminisyon aktivite BACE a nan modèl sa a nan vivo se pa tèlman akòz anpèchman nan anzim la men nan ogmantasyon nan rapò a GSH / GSSG. Nan nenpòt ka, aktivite BACE1 redwi ta ka entèprete kòm yon tantativ sipoze diminye pwodiksyon -amyloid nan sourit TgAPP yo. Kòm pou efè ki pi remakab nan quercetin ak rutin nan ipokanp la sou atenuasyon aktivite BACE1, li vo anyen ke cortical a gen yon dansite newòn siyifikativman pi wo pase ipokanp la [31], ak defisyans selektif nan proteazom nan AD fenotip patolojik fè a. cortical pi vilnerab ak afekte pase ipokanp la [32].

Apre yo fin detèmine efè tretman yo sou aktivite anzim BACE1, nou te enterese nan evalye ekspresyon li yo. Kirye, pa gen okenn diferans enpòtan nan ekspresyon BACE1 yo te jwenn ant sourit TgAPP konpare ak sourit WT, e pa gen okenn chanjman aparan yo te obsève ak tretman quercetin oswa rutin. Se poutèt sa, li sanble ke ogmantasyon nan aktivite anzim BACE1 pa asosye ak yon ogmantasyon nan ekspresyon. Nan kontèks sa a, li remakab ke Apelt et al. [14] te jwenn yon ogmantasyon nan aktivite cortical BACE1 nan sourit Tg2576 ant laj 9 ak 13 mwa pandan y ap nivo ekspresyon pwoteyin BACE1 ak mRNA pa t chanje ak laj. Anplis de sa, yo te jwenn prèv ki sipòte ke amiloid fibrilè A 1-42., olye ke amiloyid soluble A 1-42, ka ogmante ekspresyon pwoteyin BACE1, e konsa ti modifikasyon nan rapò a nan izoform amiloid ka modile konfòmasyon total amiloid ak domaj selilè. 33]. Kidonk, absans chanjman nan ekspresyon BACE1 sou yon ogmantasyon nan aktivite li ke nou te jwenn ka kont pou prévalence de amyloid soluble A 1-42 sou amiloid fibrilar A 1-42 izoform nan modèl sourit nou an TgAPP.

Apre detèminasyon ekspresyon jèn nan anzim ki enplike nan pwosesis APP, nou evalye efè quercetin ak rutin sou anzim-sekretaz ki enplike nan pwosesis ki pa amyloidogenic nan APP. Nou konsantre sou ADAM10 paske li se izofòm konstititif fizyolojik ki pi enpòtan nan -sekretaz. ADAM10 kontrekare jenerasyon plak oligomerik A nan fende APP nan domèn A pou pwodui sAPP ak fragman C-tèminal (-CTF) [34,35]. Malgre ke chanjman yo nan ekspresyon ADAM10 yo te jwenn nan etid nou an pa te estatistik siyifikatif, yo te obsève yon ti diminisyon nan ekspresyon ADAM10 nan sourit TgAPP parapò ak sourit WT. Predominanman, tretman rutin te montre yon tandans ogmante ekspresyon jèn ADAM10 nan tou de zòn nan sèvo anba etid. Postina et al. [36] te montre ke moute-règleman ADAM10 sovaj nan ipokanp nan yon modèl AD sourit medyatè sekresyon sAPP, ki mennen ale nan anpèchman nan jenerasyon plak A. Yo te etidye efè quercetin nan yon modèl rat AD ki te pwovoke klori aliminyòm ki montre yon amelyorasyon siyifikatif nan sekretase a (ADAM10 ak ADAM17) nan ipokanp la konpare ak moun ki pa trete. Sa a endike ke quercetin posede potansyèl pou ogmante chemen ki pa amyloidogenic atravè aktivasyon jèn sekretase [37]. Done preklinik ranfòse ipotèz ke amelyore nivo sAPP nan sèvo se yon estrateji potansyèl pou amelyore sentòm ki gen rapò ak AD ak diminye defisi sinaptik. ADAM10 ak BACE1 konpetisyon pou klivaj APP a, kidonk potansye aktivite ADAM10 ta ka anpeche jenerasyon amiloid nerotoksik la. Anplis, sAPP ka anpeche deklanchman chemen JNK-siyal estrès la, ki mennen nan deklanchman aktivite fosforilasyon NF-κB-induit, ki mennen nan degradasyon proteazòm [38]. Se poutèt sa, fòmasyon ak akimilasyon nan total pwoteyin ki gen rapò ak maladi yo siyifikativman redwi, ak aktivite a proteasome selilè amelyore, kidonk bay prèv pou yon fonksyon nan sAPP nan règleman an nan proteostaz [39]. Anplis de sa, li te demontre ke sAPP espesyalman ogmante sentèz reseptè glutamate AMPA ak trafik li yo [40]. Nan etid nou an, nou te eksplore si ti ogmantasyon nan ekspresyon ADAM10 sou tretman rutin egzèse kèk enfliyans sou transmisyon glutamatergic sinaptik. Jan yo montre nan seksyon an Done siplemantè, pa gen okenn efè enpòtan sou ekspresyon reseptè ionotropik sa a yo te obsève sou alimantasyon quercetin ak rutin, petèt akòz yon ogmantasyon fèb nan ekspresyon ADAM10, ki pa ase pou regilasyon reseptè AMPA a (Done siplemantè). , Figi S2 ak Tablo S5).

Li ta dwe pran an konsiderasyon ke etid in vitro yo te montre yon gran varyete ADAM10 substrats [41], ak Se poutèt sa, efè endezirab yo te jwenn nan ki pa espesifik ADAM10-cible yo ta ka jwenn nan pwopagasyon kansè, adezyon selil, pwomosyon. nan selil T / NK-selil précurseur ak enflamasyon, elatriye [42]. Pou kontourne kontrent sa a, etid nou an sijere yon estrateji ki vize a ankouraje liberasyon an nan sAPP plis fizyolojik. Apwòch sa a ta ka baze sou yon konsomasyon alontèm nan yon engredyan aktif (quercetin oswa rutin), ki konsome atravè yon rejim alimantè moun ki an sante. Sepandan, plis etid yo bezwen pou chèche konnen si ogmantasyon nan ADAM10 depann de dòz flavonoid epi si efè potansyèl benefis yo depase efè segondè yo.

Kòm pou ekspresyon APPswe, byenke ensèsyon transjèn APP imen an nan jenom sourit la garanti ke APPswe overexpressed depi nan nesans, li te rapòte ke APP mRNA ak nivo pwoteyin ipokanp montre siyifikatif fluctuations pandan devlopman bèt, yo te maksimòm lè sourit yo. asymptomatik (1-ki gen yon mwa) ak diminye lè sentòm konplè rive [43]. Malgre pwoblèm sa a, ekspresyon APP tou de nan cortical a ak ipokanp la te siyifikativman pi wo konpare ak sourit WT nan etid nou an. Pli lwen tretman ak quercetin oswa rutin te kapab siyifikativman diminye ekspresyon sa yo pou tou de sourit gason ak fi, nan tou de zòn nan sèvo a. Rezilta sa yo an liy ak sa yo rapòte pa Augustin et al. [44] ki te etidye yon ekstrè estanda nan Ginkgo biloba (Egb761), moun rich nan flavonol tankou quercetin, nan 4-mwa sourit fi TgAPP, jwenn diminye APP mRNA ak nivo pwoteyin. Lè w konsidere ke regilasyon tradiksyon APP nan sourit Tg2576 rive nan etap prodromal ak bonè sentòm [45], li posib ke restorasyon tradiksyon APP pa quercetin oswa rutin te ka fèt nan sourit TgAPP nou yo ak, gen anpil chans, nan yon kòmansman bonè. etap sentòm sentòm, sa ki lakòz yon rediksyon nan nivo kortikal ak ipokanp nan APP, aktivite BACE1, ak aktivasyon kaspas-3.

Anplis de sa, yo te rapòte yon lòt kote ke nan sourit Tg2576 (nan absans pèt newòn) gen yon ogmantasyon nan kaspas -3 aktivasyon nan ipokanp la [46], jan yo jwenn nan etid nou an, nan kòmansman defisyans memwa. , ansanm ak yon rediksyon nan kolòn vètebral dendritik anvan depo amiloid ekstraselilè [46]. Gen prèv ki sipòte wòl ki pa apoptotik pou kaspas nan sistèm nève a san lanmò newòn [47], epi aktivite kaspas-3 te lokalize nan kolòn vètebral dendritik kote li ka elve nivo calcineurin. Nan vire, dephosphorylation nan GluR1 nan reseptè ki tankou AMPA, deklanche pa calcineurin yo panse ki lakòz malfonksyònman postsynaptic. Valè ekspresyon kaspas-3 nou yo, kòm yon konsekans transgenèz, an akò ak lòt chèchè yo te jwenn ki te rapòte yon ogmantasyon nan ekspresyon kaspas-3 nan nivo kolòn vètebral dendritik nan ipokanp sourit TgAPP yo. [48]. Piske APP gen twa sit klivaj distenk pou kaspas-3 nan sekans asid amine li yo, de ladan yo sitiye nan nivo domèn ekstraselilè ak youn nan pòsyon C-tèminal intraselilè nan ke APP [49], idroliz. nan APP pa caspase-3 ka chanje pwosesis pwoteolitik nan APP an favè chemen amyloidogenic [50], ki mennen nan liberasyon an nan yon peptide citotoksik C-tèminal ki sòti nan 31 asid amine nan longè (C31), pou egzanp [51]. Sa a sijere ke, piske kaspas-3 ka medyatè anplifikasyon lage fragman toksik nan APP, bese ekspresyon caspase-3 pa quercetin oswa rutin ka pèmèt clearance nan pwoteyin total. Anplis de sa, jan mansyone pi bonè, nou te eksplore enfliyans nan tou de ogmantasyon ak diminisyon nan ekspresyon kaspas-3 nan transmisyon glutamatergic sinaptik, ki baze sou kapasite nan kaspase kalsineurin aktive-3 pou dephosphorylate subinite GluR1 la. nan reseptè AMPA nan nivo postsinaptik. Modifikasyon molekilè sa yo chanje transmisyon glutamatergic sinaptik ak plastisit newòn nan nivo epin dendritik nan ipokanp la [48]. Teyorikman, anpèchman famasi nan aktivite kaspas-3 nan sourit TgAPP ta ka sove fenotip AD ki sanble ak yon mekanis ki kondwi echèk sinaptik. Sepandan, malgre ogmantasyon nan ekspresyon kaspas-3 nan sourit TgAPP nou an, nou pa jwenn okenn diferans enpòtan nan ekspresyon reseptè AMPA konpare ak sa ki nan sourit WT, jan yo mansyone pi bonè. Li ta ka ke chanjman yo nan ekspresyon caspase -3 yo pa enpòtan ase yo pwodwi modifikasyon enpòtan nan ekspresyon reseptè AMPA (Done siplemantè, Figi S2 ak Tablo S5).

Kòm pou valè ekspresyon caspase-6, pa gen okenn diferans enpòtan yo te jwenn ant sourit TgAPP ak WT. Aktivasyon caspase-6 yo te idantifye kòm yon medyatè enpòtan nan estrès newòn ki fende pwoteyin enpòtan cytoskeletal (Tau ak -tubulin), konsa deranje degradasyon ubiquitin-proteasome nan pwoteyin misfolded, ak plizyè aktin-regleman dansite post-sinaptik. pwoteyin [52]. Ekspresyon ki pa chanje nan caspase -6 nan etid nou an dakò ak absans siy karakteristik neurodegeneration nan laj yo te evalye sourit transjenik sa yo, konpare ak sourit WT yo (Done siplemantè, Figi S1).

Yo te obsève yon ogmantasyon enpòtan nan medyatè neroenflamatwa nan pasyan AD, sitou alantou plak senil [53-55]. Astwosit yo se founisè prensipal GSH nan microglia ak newòn. Pandan enflamasyon kwonik ak estrès oksidatif, astwosit lage medyatè enflamatwa toksik ak radikal gratis, akselere aktivasyon mikroglia ak neurodegeneration [56]. Li se vo anyen ke diminye glutathione intraselilè ki gen rapò ak aktivasyon an nan chemen yo enflamatwa, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-κB, nan mikroglia imen ak astwosit [57]. Nan sans sa a, nou deside quantifier nivo IL-1, IFN-, ak TNF- nan modèl bèt nou an epi detèmine efè quercetin ak rutin sou yo. Kòm li te ye, enflamasyon ankouraje pwosesis ki defektye nan A peptide ak APP, ankouraje A peptide agrégation ak nan vire modifye A reyaktivite [58]. Se konsa, nan etid nou an, nou te obsève ke sourit TgAPP te ogmante nivo mRNA nan medyatè pro-enflamatwa IL-1, TNF- ak IFN-, konpare ak sourit WT, ki montre ke twòp ekspresyon nan APPswe ta ka pwovoke kaskad nero-enflamatwa. deklanche yon seri chemen molekilè nan glia ak newòn, ki ta aktive repons enflamatwa a. Quercetin ak rutin te kapab diminye ekspresyon jèn IL-1 nan tou de gason ak fi ak zòn nan sèvo etidye yo. Plizyè prèv sipòte efè anti-enflamatwa kercetin egzèse nan nivo CNS, paske li ka anpeche deklanchman faktè transkripsyon tankou faktè nikleyè-kappa B (NF-κB) [59], ki enplike nan endiksyon iNOS, ak Se poutèt sa, diminye liberasyon medyatè tankou IL-1, TNF- ak IFN- [60]. Konsènan enpak GSH sou repons enflamatwa a, li ta dwe remake ke GSH patisipe nan antretyen nivo cytokine optimal nan yon fason ke ekspresyon de cytokin pro-enflamatwa (TNF-, IL{28}}, ak IL). -6) yo ogmante akòz rediksyon GSH, tandiske ekspresyon cytokines anti-enflamatwa yo (sa vle di, IL-10) rete san chanjman. Chanjman omeyostaz GSH sa a rive akòz regilasyon nan chemen siyal NF-κB ak JNK ki ta ka chemen apoptotik ki posib nan direksyon lanmò selil newòn [61]. Nan etid nou an, desann-règleman nan NF-κB pa quercetin ak rutin ta ka yon mekanis posib pou refè omeyostazi GSH / GSSG ak Se poutèt sa kòz la nan balans ki genyen ant pro-enflamatwa ak anti-enflamatwa sitokin. Anfen, depi pwomotè BACE1 la gen yon sit obligatwa NF-κB, deklanchman enflamasyon-induit nan NF-κB fasilite upregulation nan ekspresyon BACE1, epi imedyatman ogmante A pwodiksyon [62]. Se konsa, si desann-règleman nan NF-κB rive sou alimantasyon quercetin ak rutin, aktivite BACE1 ta diminye kòm yon rezilta nan règleman an lage nan pro-enflamatwa epi yo pa anti-enflamatwa sitokin.

4. Materyèl ak Metòd

4.1. Bèt eksperimantal

Yo te itilize yon sourit transjenik (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) ki eksprime doub mitasyon Swedish nan pwoteyin précurseur amiloid imen (hAPP) kòm modèl bèt eksperimantal AD [14]. Sourit la se yon liy eterozigòt knock-in ki eksprime izofòm A PP695 imen an ak doub mitasyon Swedish (K670N/M671L; Lys670→Asn ak Met671→Leu) anba kontwòl pwomotè pwoteyin prion amstè [63]. Kòm yon rezilta, sourit sa a montre nivo amyloid-precursor pwoteyin imen (A PP), sis fwa pi gwo pase nivo A PP yon sourit. Anplis de sa, sourit sa a montre nivo ki pi wo nan A 40 ak A 42. Depo A kòmanse nan 9 mwa [63]. Nan ipokanp Tg2576 ak cortical, ekspresyon transjèn APPswe se prensipalman newòn [64].

Kòm yon kontwòl negatif, sourit sovaj (WT) ki soti nan menm koloni [65,66] yo te itilize. Koloni sourit Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) te devlope nan laboratwa nou an soti nan gason etewozigòt Tg2576 ak fi sovaj. Paran transjenik yo te bay Doktè Diana Frechilla nan Divizyon Neurosyans nan Sant pou Rechèch Medikal Aplike nan Inivèsite Navarra (Pamplona, ​​Espay) [67].

Bèt yo te loje nan kaj ayere endividyèlman epi yo te kenbe nan 22-24 ◦C sou yon sik limyè/fè nwa 12-h nan 50-60 pousan imidite. Pwotokòl bèt yo te apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal (IACUC) nan Complutense University of Madrid e yo te an akò konplè ak Ewopeyen Directive 2010/63/sou pwoteksyon bèt yo itilize pou rezon syantifik ak lejislasyon Panyòl sou Byennèt bèt ( Dekrè wayal 53/2013, 1ye fevriye 2013).

4.2. Analiz jenotip nan sourit

Transgenisite te detèmine nan 30 jou apre nesans pa byopsi ke. Genotype analiz bèt yo te pote pa PCR. Lè ou konsidere ke Tg2576 (TgAPP) se yon liy eterozigòt, yo te itilize jèn ensèsyon an (PrP, ki soti nan pwoteyin priyon) kòm yon kontwòl reyaksyon pozitif. ADN jenomik yo te ekstrè nan ke sourit dijere ak proteinaz K (0.1 µg/µL) nan tanpon NID (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50). mM MgCl2, 0.05 pousan jelatin, 0.45 pousan NP-40 ak 0.4 pousan Tween 20) nan 56 ◦C pou 3 èdtan epi souke. Fragman ADN yo te presipite ak izopropanol epi lave ak etanòl 70 pousan. ADN presipite yo te fonn nan 30 µL tanpon TE (10 mM Tris-1 mM EDTA). Pite ak konsantrasyon ADN yo te detèmine nan 260 ak 280 nm.

Jèn PrP ak APP yo te anplifye pa PCR. Sekans premye yo te itilize pou fè tès sourit transjenik yo te jan sa a: PrP pi devan: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP ranvèse: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC; APP ranvèse: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Etap yo nan reyaksyon PCR la te jan sa a: denaturasyon nan 94 ◦C pou 90 s, 39 sik nan 60 ◦C pou 60 s ak 72 ◦C pou 90 s, Lè sa a, ekstansyon final nan 72 ◦C pou 7 min.

Nan tout ka yo, yo te konsidere kontwòl negatif (san mwazi ADN) ak kontwòl pozitif jèn APP. Pwodwi PCR yo te jwenn yo te separe pa elektwoforèz nan 1.5 pousan jèl agaroz nan 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Almay) tanpon nan 70 V (vòltaj konstan) ak Lè sa a, imaj pa tach ak. GelRed (Millipore).

4.3. Tretman bèt

Sourit TgAPP ak konpayon sovaj, tou de ki gen laj 6-7 semèn ak yon premye pwa kò 16.2 ± 0.8 g, yo te randomize nan kat gwoup sa yo (n=8/gwoup): ( a) TgAPP ki pa trete; (b) TgAPP trete quercetin; (c) TgAPP trete ak rutin; epi (d) Kalite sovaj ki pa trete. Depi tou de sourit gason ak fi yo te etidye, de seri gwoup yo te etabli. A laj de 45 semèn, sourit yo te kòmanse trete ak quercetin oswa rutin pou 4 semèn.

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavone) ak idrat rutin (quercetin-3-O-rutinoside idrat) te pi gran pase oswa egal a 95 pousan pi epi yo te achte nan men Sigma-Aldrich. Chak nan flavonoid yo te enkòpore nan yon rejim alimantè estanda (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Espay) nan yon konsantrasyon nan 200 ppm, ki koresponn ak yon konsomasyon nan 30 mg flavonoid / kg pwa kò / jou. Sourit yo ki pa trete yo te resevwa sèlman rejim alimantè estanda san sipleman. Rejim ak dlo yo te bay pou konsomasyon ad libitum.

4.4. Preparasyon tisi nan sèvo pou tès byochimik ak histolojik

Nan fen tretman an, sourit yo te ret san manje lannwit lan, yo te elimine lè l sèvi avèk dislokasyon nan matris, epi yo te retire tout sèvo a byen vit. Yo te rense sèvo a nan saline nan 4 ◦C epi yo te retire manbràn araknoid la ak anpil atansyon. Lè sa a, ipokanp la ak cortical yo te izole. Echantiyon yo te imedyatman estoke nan -80 ◦C jiskaske yo itilize plis.

Sèvo yo tout nan kèk bèt yo te itilize pou jwenn seksyon istolojik, pou ki, yon fwa euthanized lè l sèvi avèk dislokasyon nan matris, sèvo yo te jele pa imèsyon nan izopentan nan -80 ◦C. Touswit apre sa, seksyon koronèl nan sèvo a (30 µm epesè) yo te fè soti nan anpoul olfactif nan serebeleu a, 120 µm apa nan yon kriostat (Leica CM1850, Nussloch, Almay). Tout pwosedi a te fèt nan -20 ◦C. Seksyon istolojik yo te kolekte sou glisad epi yo te kenbe nan -80 ◦C jiskaske analiz (Gade Metòd siplemantè).

4.5. Glutatyon

Pou tès glutatyon, echantiyon cortical serebral ak ipokanp yo te omojènize nan yon tanpon redox-atenn -5 pousan Trichloride asid acetic (RQB-5 pousan TCA) (anvan bulle ak N2 pou 15 min sou glas) nan yon konsantrasyon. nan 25 mg/mL (w/v). Echantiyon yo te resuspend pa sonication pou 10 s, Lè sa a, santrifuje nan 12, 000 × g pou 10 min nan 4 ◦C, ak supernatant yo te kolekte.

Lè sa a, nan supernatant jwenn yo, yo te adopte metòd espektrofluorometrik pou detèmine nivo GSH ak GSSG lè l sèvi avèk metòd o-phthalaldehyde, ki dekri pa Senft et al. [68]. Valè GSH ak GSSG yo te korije pou reyaksyon espontane nan absans yon echantiyon byolojik. Nan de ka yo, supernatant yo te enkube pou 30 minit nan tanperati chanm epi apre sa, yo te mezire fliyoresans lè l sèvi avèk yon lektè mikroplak FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Almay), ak filtè eksitasyon an mete nan 360 nm (bandwidth 5 nm) ak filtè emisyon an mete nan 460 nm (bandwidth 5 nm). Konsantrasyon GSH ak GSSG nan chak echantiyon yo te entèpolye nan estanda GSH li te ye. Konsantrasyon tou de GSH ak GSSG yo te eksprime kòm nmol GSH / mg pwoteyin, ki te pèmèt pou kalkil rapò a glutatyon redox GSH / GSSG.

Granules ki rete yo te toubiyon jiskaske yo fonn nèt nan 240 µL NaOH 0.1 M pou mezire konsantrasyon pwoteyin pa metòd asid bicinchoninic (BCA), lè l sèvi avèk albumin serom bovin kòm yon estanda.

【Pou plis enfòmasyon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】