Yon Dab1 omozigòt -// se yon potansyèl nouvo kòz anomali otozomal resesif konjenital sourit ren ak aparèy urin.
Feb 28, 2022
Entwodiksyon
Yotari mutan sourit, ki te jwenn pa akizisyon espontane nan yon mitasyon nan jèn Dab1, montre anomali istolojik nan sistèm nève santral la [1,2], trè menm jan ak sourit reeler (reelin//), sijere ke reelin ak DAB1 fè pati. menm chemen siyal la [1–4]. Yo rapòte aberasyon yo nan chemen reelin/DAB1 yo asosye ak divès maladi sikyatrik [5-7]. Enteresan, san konte sistèm nève santral la, prezans DAB1 ak pwoteyin reelin yo te konfime tou nan sistèm nève periferik la ak kèk tisi ekstraneural. Yo te jwenn prezans DAB1 nan podosit sourit [8] ak fetis imenren[9] pandan ke yo te rapòte ekspresyon reelin pandan devlopman fetis la sourit ak imen, osi byen ke nan kèk selil andothelial ansanm veso sangen nan sourit adilt la [9-11]. Kanonik reelin/DAB1 chemen an ka deklanche pwoteyin en distenk, ki gen ladan reseptè NOTCH2, ki jwe wòl enpòtan nan desizyon selil-so ak diferansyasyon pandanrendevlopman [12–14]. Reseptè NOTCH2 yo oblije fòme tubul proximal ak podosit [13], men yon fwa yo rive nan spirasyon nefwon, wout sa a sitou silans [15]. Nan kondisyon egimaladi ren,ekspresyon ogmante nan NOTCH2 ka potansyèlman kontribye nan rejenerasyon, pandan y ap ekspresyon soutni se kozatif ki asosye ak fibwoz entèrstisyèl ak glomerulosclerosis [15]. Downregulation nan siyal NOTCH ka anpil diminye otofaji ak lakòz podocyte diferansyasyon andikap pandan devlopman [16].
Kontinwe, podosit disfonksyonèl jwe yon wòl enpòtan nan maladi glomerulèr, espesyalman nan sendwòm nefrotik moun idyopatik [17,18] ak nan sendwòm nefrotik chanjman minimòm (MCNS) [19]. Pakonsekan, otofaji kenbe omeyostazi selilè nan kondisyon fizyolojik nòmal, tandiske nan kondisyon patolojik, li ka pwogrese nan lanmò otofajik [20]. Yon biomarker otofaji lajman itilize se LC3B, yon pwoteyin estriktirèl nan manbràn otofagosomal [21]. Konplèks crosstalk ant otofaji ak apoptoz tou kontribye nan antretyen an nan balans omeostatik kòm yon repons a mikwo-anviwònman selil la. Li se byen li te ye ke evènman apoptotik ogmante nan kantite pandanrendevlopman [22] ak anpil diminye yon fwa spirasyon fini, eksepte nan kondisyon deblesi nan ren[23]. San nye, apoptoz se yon mekanis konplèks reglemante atravè entèaksyon plizyè chemen men sitou fini ak aktivasyon caspase3 (CASP3), ki gen aktivasyon se youn nan makè ki pi souvan itilize pou deteksyon apoptoz [23].
Nan rapò sa a, nou te vize analize ki jan Dab1 jèn fonksyon silans enfliyansrenmòfoloji ak ekspresyon ak lokalizasyon reelin, NOTCH2, LC3B, ak pwoteyin CASP3 kwoke nan sourit apre akouchman.ren. Nou sipoze ke pwoteyin sa yo eksprime nan sourit apre akouchman anren,ak entèraksyon fonksyonèl yo kontribye nan antretyen nan estrikti yo ak fonksyon yo. Anplis de sa, kòm prezans nan DAB1 te konfime pandan fetis imenrendevlopman [9], li ta ka sipoze ke inaktivasyon li yo ka lakòz twoub nan yon pakèt domèn anomali konjenital nanrenak aparèy urin (CAKUT).
Mo kle:yotari; fonksyon ren; devlopman ren apre akouchman; tach imunoffluoresans; mikwoskopi elektwonik transmisyon
CISTANCHE AP AMELIORE FONKSYON REN/REN
Materyèl ak Metòd
Koleksyon echantiyonKòm Dab1 nil mutan konvansyonèl yo, nou te itilize yotari (Dab1/) sourit deja dekri pa Howell et al. [24]. Jadendanfan PCR yo itilize pou jenotipaj sourit yo te yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT ak CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, kalite sovaj Dab1 locus: GCCCTTCAGCATCACCATGCT ak CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Sourit C57BL/6 N yo te elve ak gwoup-loje nan kaj estanda polikarbonat (ki gen ladan omwen youn nan chak jenotip) ak aksè ad libitum nan manje ak dlo nan yon chanm tanperati kontwole (23 ± 2 ◦C) ak yon limyè 12 h /. sik nwa. Nan jou apre akouchman 4, 11 ak 14 (P4, P11, ak P14), sourit yo te pwofondman anestezi ak pentobarbital ak transcardially perfused pou 1 0 minit ak salin tanpon fosfat (PBS, pH 7.2) ak 4 pousan paraformaldehyde (PFA). ) nan 0.1 M PBS.renyo te retire ak fikse ak 4 pousan PFA nan 0.1 M PBS lannwit lan pou analiz istolojik konvansyonèl (ematoksilin-eozin (H&E), tach imunohistochimik ak imunoffluoresans) ak nan yon melanj 2 pousan PFA plis 2.5 pousan glutaraldehyde (GA). pou egzamen mikwoskòp elèktron. Apre fifixation, tisi yo te prepare pou plis egzamen istolojik, jan nou te dekri deja [25,26].
Imunoffluoresans ak tach imunoperoksidazApre deparafifinizasyon ak reyidratasyon, seksyon yo te chofe pou 20 minit nan tanpon sitrat 0.01 M (pH 6.0) nan yon vapè dlo epi, apre sa, yo refwadi jiska tanperati chanm. Tanpon bloke (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) te aplike pou 30 min pou eskli tach ki pa espesifik. Lè sa a, seksyon yo te enkube nan yon chanm imidite lannwit lan ak antikò prensipal (Tablo 1). Apre lave nan PBS, antikò segondè (Tablo 1) yo te aplike pou yon èdtan epi lave nan PBS ankò. Apre sa, nwayo yo te tache ak 4060 -diamidino-2-phenylindole (DAPI) pou 2 minit, yo te lave yo nan PBS, epi kouvri yo. Nou te fè tès preadsorption pou chak antikò prensipal yo te itilize ak peptide ki koresponn lan epi aplike konbinezon yo nan seksyon yo. Rezilta yo pa montre okenn tach antikò. Anplis de sa, yo te fè kontwòl ak omisyon antikò prensipal la pou detèmine nivo lyezon ki pa espesifik nan antikò segondè yo.
Pou tach imunoperoksidaz, lapen poliklonal anti-CASP3 (1:100 dilution, ab13847, Abcam, Cambridge, UK) te aplike kòm yon antikò prensipal pou yon èdtan nan yon chanm imidite apre tretman an nan seksyon an ak 0.1. pousan H2O2. Apre lave nan PBS, yo te fè deteksyon segondè lè l sèvi avèk lyen an ak streptavidin peroksidaz, chak pou kenz minit (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) ak diaminobenzidine (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), ak anpil atansyon kontwole pou evite. Nwayo yo te tache ak ematoksilin, rense nan dlo tiyo pou 10 minit, dezidrate yon ti tan nan seri solisyon etanòl k ap monte, epi kouvri yo.
Preparasyon tisi pou mikwoskòp elektwonik transmisyon (TEM)Apre fifixation ak yon melanj de 2 pousan PFA ak 2.5 pousan GA nan 0.1 M PBS pou 2 h, echantiyon yo te lave ak PBS ak postfifixed nan yon solisyon akeuz nan 2 pousan tetoksid osmyòm pou 2 h. Tout echantiyon yo te lave de fwa nan PBS, dezidrate nan klas monte nan etanòl ak entegre nan Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Seksyon seri (70 nm nan epesè) yo te koupe sou yon ultramicrotome Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Almay) ak tache ak 1 pousan acetate uranyl ak sitrat plon.
Done akizisyon ak analizAnaliz la te fèt ak yon mikwoskòp epifluoresans (Olympus BX51, Tokyo, Japon) ekipe ak yon kamera dijital DP71 (Olympus), yon mikwoskòp elèktron transmisyon JEM 1400 (JEOL, Tokyo, Japon) ki te opere nan 80 kV ak foto ak yon chaj JEOL- makonnen aparèy (CCD) sistèm kamera (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA) epi anfen, yon mikwoskòp bright-fifield (BX40, Olympus, Tokyo, Japon). Tout imaj analize yo te trete ak lojisyèl ImageJ ak Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). Pou chak gwoup egzamine, nou te itilize twa a kat bèt. Tout kolekterenyo te koupe nan seksyon 5 µm epè, ak maksimòmren length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, ki endike yon akò ekselan [27].
Analiz estatistikYo te fè yon tès t de-ke pou analize diferans ki genyen nan dyamèt mwayèn ant PCT, DCT ak G nan bèt sovaj ak yotari. Dyamèt la te prezante kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD). Nivo siyifikasyon an te fikse nan p < 0.05.="" yo="" te="" itilize="" yon="" tès="" anova="" de="" fason="" ki="" te="" swiv="" pa="" tès="" konparezon="" miltip="" tukey="" a="" pou="" egzamine="" diferans="" ki="" genyen="" nan="" pousantaj="" selil="" pozitif="" ant="" pct,="" dct,="" ak="" glomeruli="" nan="" pwen="" tout="" tan.="" pousantaj="" selil="" pozitif="" yo="" te="" eksprime="" kòm="" mwayèn="" ±="" erè="" estanda="" nan="" mwayèn="" (sem).="" nivo="" siyifikasyon="" an="" te="" fikse="" nan="" p=""><0.05. analiz="" la="" te="" fèt="" nan="" lojisyèl="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">
Rezilta yo
Tach Ematoksilin-Eozin (H&E) ak Mezi Dyamèt renH&E tach nan seksyon midsagittal nan larennan tout egzamine timepoints mete aksan sou ti arenfenotip sourit yotari konpare ak kalite sovaj (Figi 1a). Nan 4P vle direndyamèt bèt yotari te anviwon 55 µm pase anviwon 75 µm. Anplis de sa, diferans sa a te aparan nan pwen tan pita akòz kwasans lan pi dousman nanrennan yotari konpare ak kwasans pwogresif la nanrennan bèt ki kalite sovaj. Pou detèmine si rediksyon an an jeneralrengwosè te koze pa yon diminisyon nan gwosè segman nefron, nou fè mwayèn dyamèt PCT, DCT ak G pou chak gwoup. Vreman vre, te gen yon diminisyon nan dyamèt mwayèn G, PCT ak DCT nan gwoup yotari a konpare ak sovaj-tip (Figi 1b, p <{2}}.05). anplis="" de="" sa,="" h="" &="" e="" tach="" revele="" korèks="" mens="">renekstansyon basen nan bèt yotari ak yon ti kras difize DCT dilate nan 14P. Estrikti debaz la ak modèl spirasyon glomerulè yo se menm bagay la tou nan tou de gwoup bèt egzamine yo.
Analiz histolojik deskriptif ki baze sou mikrofotografi TEMSou mikrofotografi jwenn pa TEM, glomeruli nan sourit sovaj yo te montre aparans tipik nan tout pati nan baryè a fifiltrasyon, ki te nòmalman devlope ak rekonèt (Figi 2a). Podosit, pwosesis pye podozit ak pedikul, fant fifiltrasyon, manbràn sousòl glomerulèr, ak lumèn kapilè ak andotelyom fenestrate a te fasil distenge (Figi 2a). Nan lòt men an, nan glomeruli yo nan sourit yotari, yo ka obsève domaj podosit pwogresif ak efasman pwosesis pye ak mank de fant fifiltrasyon (Figi 2b-d). Chanjman ultrastruktural sa yo te obsève nan toutrenegzamine ak enplike pi fò nan glomeruli egzamine yo. Pa gen okenn anomali yo te remake nan PCT oswa DCT sourit yotari pase bèt sovaj (Figi 2e-h). Nan PCT a, koòdone selil yo te defini mal akòz iregilarite nan manbràn selilè ak entèdijitasyon selil ak vwazen yo. Sitoplasm nan te abondan, ki gen nwayo byen distenge, mitokondri long, infoldings fondamantal, ak anpil twou tubulaires ant mikrovilli, ki te fòme yon fwontyè bwòs nan manbràn apical la. Pi wo agrandisman revele sifas apical selil epitelyal PCT ki gen mikrovilli long pou fòme fwontyè bwòs la ak junctions sere ant fwontyè selil luminal selil epitelyal tubulaires vwazen yo (Figi 2e, f). Nan lòt men an, sifas apical nan selil epitelyal DCT genyen kèk mikwovilli kout ak anpil vesik (Figi 2g, h).
Figi 2. Mikwoskòp elèktron transmisyon (TEM) mikrofoto nan kalite sovaj ak yotariren.Glomeruli nan bèt ki kalite sovaj (a) te montre yon baryè fifiltrasyon nòmalman devlope ak endothelium fenestrated (E) nan kapilè a (C), manbràn sousòl (BM), podocytes (P) ak pedicules (PE), ak fant fifiltrasyon (FS). ). Nanrennan bèt yotari, efasman nan pedikul yo ak mank de fant fifiltrasyon te kapab remake (asterisk, b–d). Pa gen okenn anòmal yo te remake nan tubul proximal convoluted (PCT) oswa distal tubul convoluted (DCT) nan sourit yotari konpare ak bèt sovaj yo (e-h). Nan PCT a, sitoplasm nan te abondan, ki gen nwayo byen distenge (N), mitokondri ki long (M), infoldings fondamantal (BI), ak anpil twou tubulaires (TP) ant mikrovilli, ki te fòme yon fwontyè bwòs (BB) nan la. manbràn apical (e,f). Pi wo agrandisman te revele sifas apical selil epitelyal PCT ki gen mikrovilli long pou fòme fwontyè bwòs la ak junctions sere (TJ) ant fwontyè selil luminal selil epitelyal tubulaires vwazen yo (e,f). Nan lòt men an, sifas apical nan selil epitelyal DCT ki gen kèk mikwovilli kout ak anpil vesik (g, h). Ba echèl la nan imaj (a–d) ak enkadreman (e–h) se 1 µm; ba echèl la nan imaj (e–h) se 2 µm.
Lokalizasyon ak kolokalizasyon Reelin ak DAB1Reelin te fèb eksprime ak reyaksyon modere a modere (Tablo 2) nan glomeruli yo ak DCT nan tout bèt egzamine yo nan tout pwen tan obsève (p <0.05, figi="" 3a).="" se="" sèlman="" nan="" pct="" yotari="" sourit="" yo="" pousantaj="" selil="" pozitif="" siyifikativman="" pi="" wo="" pase="" bèt="" sovaj="" (p=""><0.05, figi="" 3a).="" nan="" selil="" glomerulè="" yo,="" lokalizasyon="" tach="" la="" te="" perinuclear,="" pandan="" y="" ap="" nan="" pct="" ak="" dct,="" li="" te="" gaye="" nan="" tout="" sitoplasm="" nan="" (figi="" a,="">
igure 4. Immunofluorescence tach nan yotari apre akouchmanrenak makè reelin (a) ak doub tach imunofluoresan nan kalite sovaj apre akouchman.renak makè DAB1 ak reelin (b). (a, b) ADN nikleyè DAPI tach fizyone ak DAB1, epi yo montre imunofluoresans reelin an paralèl (fusion). Pwen tan obsève yo te P4, P11, P14. Ekspresyon makè yo egzamine nan glomeruli yo (G), proximal tubul convoluted (PCT) ak distal tubul convoluted (DCT) make ak flèch yo, pandan y ap asteris yo endike ekspresyon de reelin nan matris la ekstraselilè (a). Antre yo montre ekspresyon ki pi enpòtan nan imaj la. DAPI nikleyè tach revele pòv colocalization nan DAB1 ak reelin, sitou nan DCT a (arrowhead). Ba echèl la se 20 µm epi li refere a tout imaj.
Prèske pa te gen okenn reyaksyon iminitè DAB1 nan glomeruli ak PCT nan bèt sovaj nan P4, pandan y ap pousantaj selil pozitif ak reyaksyon modere (Tablo 2) ogmante siyifikativman nan P11 ak P14 (p <{6}}.05, figi="" 3b).="" nan="" dct="" a,="" dab1="" te="" eksprime="" sitou="" nan="" pati="" yo="" apical="" ak="" lateral="" nan="" manbràn="" selilè="" (figi="" 4b)="" ak="" reyaksyon="" fò="" (tablo="" 2).="" pousantaj="" nan="" selil="" pozitif="" te="" siyifikativman="" pi="" wo="" pase="" nan="" estrikti="" anvan="" yo,="" alantou="" 60="" pousan="" (figi="" 3b),="" espesyalman="" nan="" macula="" densa="" a="" (figi="" 4b).="" te="" gen="" prèske="" pa="" gen="" okenn="" colocalisation="" nan="" dab1="" ak="" reelin="" eksepte="" nan="" dct="" nan="" bèt="" sovaj="" nan="" p14="" (arrowhead,="" figi="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" nan="" 14="" figi="" 4.="" tach="" imunoflfluoresan="" nan="" yotari="" apre="">renak makè reelin (a) ak doub tach imunoffluoresans nan kalite sovaj apre akouchman.renak makè DAB1 ak reelin (b). (a, b) ADN nikleyè DAPI tach fizyone ak DAB1, epi yo montre imunoflfluoresans reelin an paralèl (fusion). Pwen tan obsève yo te P4, P11, P14. Ekspresyon makè yo egzamine nan glomeruli (G), tubul proximal convoluted (PCT) ak tubul konvoluted distal (DCT) make ak flèch yo, pandan y ap asteris yo endike ekspresyon reelin nan matris la ekstraselilè (a). Antre yo montre ekspresyon ki pi enpòtan nan imaj la. DAPI nikleyè tach revele pòv colocalization nan DAB1 ak reelin, sitou nan DCT a (arrowhead). Ba echèl la se 20 µm epi li refere a tout imaj. Te gen prèske pa gen okenn reyaksyon iminitè DAB1 nan glomeruli ak PCT nan bèt sovaj nan P4, pandan y ap pousantaj nan selil pozitif ak reyaksyon twò grav (Tablo 2) siyifikativman ogmante nan P11 ak P14 (p <0.05, figi="" 3b).="" nan="" dct="" a,="" dab1="" te="" eksprime="" sitou="" nan="" pati="" yo="" apical="" ak="" lateral="" nan="" manbràn="" selilè="" (figi="" 4b)="" ak="" reyaksyon="" fò="" (tablo="" 2).="" pousantaj="" nan="" selil="" pozitif="" te="" siyifikativman="" pi="" wo="" pase="" nan="" estrikti="" anvan="" yo,="" alantou="" 60="" pousan="" (figi="" 3b),="" espesyalman="" nan="" macula="" densa="" a="" (figi="" 4b).="" prèske="" pa="" te="" gen="" okenn="" kolokizasyon="" dab1="" ak="" reelin="" eksepte="" nan="" dct="" bèt="" sovaj="" nan="" p14="" (flèch,="" figi="">
Modèl ekspresyon espasyal ak tanporèl NOTCH2 ak LC3BPousantaj NOTCH{{0}}selil pozitif yo te mwens pase 20 pousan nan glomeruli tou de jenotip bèt yo nan tout pwen tan yo obsève yo. Se sèlman nan P14 pousantaj nan selil pozitif te siyifikativman pi wo nan glomeruli yo nan bèt yotari pase bèt sovaj-kalite (p <0.05, figi="" 3c).="" entansite="" tach="" la="" te="" modere="" a="" modere="" (tablo="" 2),="" sitou="" sitiye="" perinuclearly="" (figi="" 5a-f).="" nan="" pct="" ak="" dct="" nan="" tou="" de="" jenotip="" bèt="" pousantaj="" nan="" selil="" pozitif="" ogmante="" atravè="" tan.="" nan="" p14,="" pousantaj="" selil="" pozitif="" yo="" te="" siyifikativman="" pi="" wo="" nan="" pct="" ak="" dct="" nan="" bèt="" yotari="" pase="" pct="" ak="" dct="" nan="" bèt="" sovaj="" (p=""><0.05, figi="" 3c).="" entansite="" siyal="" nan="" tout="" pwen="" tan="" obsève="" yo="" te="" modere="" a="" modere="" (tablo="" 2)="" ak="" gaye="" nan="" tout="" sitoplasm="" nan="" (figi="" 5a-f).="" figi="" 5.="" tach="" imunofluoresan="" nan="" kalite="" sovaj="" apre="" akouchman="" ak="">renak makè NOTCH2 ak LC3B ak tach imunoperoksidaz ak makè cleaved caspase3 (CASP3). (a–f) ADN nikleyè DAPI tach fizyone ak NOTCH2 ak LC3B. Pwen tan obsève yo te P4, P11, P14. Ekspresyon makè NOTCH2 ak LC3B yo nan glomeruli (G), tubul proximal convoluted (PCT) ak tubul konvoluted distal (DCT) make ak flèch yo. Espesyalman fò reyaksyon LC3B ka obsève nan kapsil Bowman nan glomeruli pouri (asterisk, e). Antre yo montre ekspresyon ki pi enpòtan nan imaj la. CASP3 te mal eksprime nan tout pwen tan obsève yo. Sèl ekspresyon enpòtan an te nan glomeruli yotari sourit yo sou P14 (flèch). Ba echèl la se 20 µm epi li refere a tout imaj. Biomolekil 2021, 11, 609 9 nan 14 3.4. Modèl ekspresyon espasyal ak tanporèl NOTCH2 ak LC3B Pousantaj selil pozitif NOTCH2-yo te mwens pase 20 pousan nan glomeruli tou de jenotip bèt yo nan tout pwen tan yo obsève yo. Se sèlman nan P14 pousantaj nan selil pozitif te siyifikativman pi wo nan glomeruli yo nan bèt yotari pase bèt sovaj-kalite (p <0.05, figi="" 3c).="" entansite="" tach="" la="" te="" modere="" a="" modere="" (tablo="" 2),="" sitou="" sitiye="" perinuclearly="" (figi="" 5a-f).="" nan="" pct="" ak="" dct="" nan="" tou="" de="" jenotip="" bèt="" pousantaj="" nan="" selil="" pozitif="" ogmante="" atravè="" tan.="" nan="" p14,="" pousantaj="" selil="" pozitif="" yo="" te="" siyifikativman="" pi="" wo="" nan="" pct="" ak="" dct="" nan="" bèt="" yotari="" pase="" pct="" ak="" dct="" nan="" bèt="" sovaj="" (p=""><0.05, figi="" 3c).="" entansite="" siyal="" nan="" tout="" pwen="" tan="" obsève="" yo="" te="" modere="" a="" modere="" (tablo="" 2)="" ak="" gaye="" nan="" tout="" sitoplasm="" nan="" (figi="">
Figi 5. Tach imunoflfluoresans nan kalite sovaj apre akouchman ak yotarirenak makè NOTCH2 ak LC3B ak tach imunoperoksidaz ak makè cleaved caspase3 (CASP3). (a–f) ADN nikleyè DAPI tach fizyone ak NOTCH2 ak LC3B. Pwen tan obsève yo te P4, P11, P14. Ekspresyon makè NOTCH2 ak LC3B yo nan glomeruli (G), tubul proximal convoluted (PCT) ak tubul konvoluted distal (DCT) make ak flèch yo. Espesyalman fò reyaksyon LC3B ka obsève nan kapsil Bowman nan glomeruli pouri (asterisk, e). Antre yo montre ekspresyon ki pi enpòtan nan imaj la. CASP3 te mal eksprime nan tout pwen tan obsève yo. Sèl ekspresyon enpòtan an te nan glomeruli yotari sourit yo sou P14 (flèch yo). Ba echèl la se 20 µm epi li refere a tout imaj.
Nan glomeruli ak DCT tou de jenotip bèt yo, pousantaj selil LC3B-pozitif yo te ogmante atravè tan an (p < 0.05,="" figi="" 3d).="" nan="" p11="" ak="" p14,="" pousantaj="" selil="" pozitif="" yo="" te="" siyifikativman="" pi="" wo="" nan="" glomeruli="" bèt="" yotari="" pase="" glomeruli="" bèt="" sovaj="" yo="" (p="">< 0.05,="" figi="" 3d).="" nan="" glomeruli="" bèt="" yotari,="" entansite="" tach="" yo="" te="" sitou="" modere="" ak="" fò="" (tablo="" 2)="" ki="" sitiye="" nan="" espas="" perinkleyè="" ak="" nikleyè="" (figi="" 5a–f),="" nan="" tout="" pwen="" tan="" obsève="" yo,="" pandan="" y="" ap="" nan="" glomeruli="" yo="" nan="" sourit="" sovaj,="" entansite="" a="" te.="" sitou="" modere="" (tablo="" 2).="" pct="" nan="" bèt="" yotari="" ak="" kalite="" sovaj="" ki="" genyen="" anviwon="" 20="" pousan="" nan="" selil="" pozitif="" nan="" tout="" pwen="" tan="" obsève="" (p=""><0.05, figi="">
Ekspresyon CASP-3 fennenPrèske pa te gen okenn ekspresyon CASP aktive-3 nanrennan bèt sovaj nan tout pwen tan obsève yo. Nan PCT ak DCT sourit yotari, plizyè selil endividyèl yo te CASP-3-pozitif (Figi 3e). Se sèlman nan glomerul yo nan ren yotari nan P14 (Figi 5e), pousantaj la nan selil pozitif ogmante siyifikativman konpare akrennan sourit sovaj (p <0.05, Figi 3e).
Diskisyon
renmorfogenesis ak devlopman se pwosesis konplèks ki kowòdone jisteman atravè entèaksyon yon gwo kantite jèn. Anomalie konjenital nanrenak aparèy urin (CAKUT) se domaj nesans ki pi komen ki konstitye 23 pousan nan tout domaj sa yo epi ki reprezante kòz prensipal nan etap final la.maladi rennan timoun [28,29]. Twoub sèl jèn yo ka sous prensipal CAKUT, e jiska prezan, yo idantifye yon mitasyon nan plis pase 20 jèn kòm kòz CAKUT [30]. Kòm travay anvan nou an te montre gwo ekspresyon de DAB1 pandan nòmal fetis imenrendevlopman [9], nou sipoze ke DAB1 ta ka jwe yon wòl enpòtan pandan mamifèrendevlopman. Pou pwouve ipotèz nou an, nou te envestige arenmòfoloji ak modèl ekspresyon reelin, NOTCH2, LC3B, ak aktive CASP3 pwoteyin nan sourit knockout Dab1.
CISTANCHE AP AMELIORE DOULÈ REN/REN
Seksyon nan sourit yotari yorenrevele yon cortical pi mens ak yon siyifikativman pi piti vle direnak dyamèt PCT, DCT ak G konpare ak bèt sovaj. Diminisyon nanrengwosè ki te koze pa dotasyon ensifizan nephron ke yo rekonèt kòmrenipoplazi, youn nan twoub CAKUT ki pi komen, ki predispoze tansyon wo ki kòmanse granmoun ak maladi ren kwonik [31]. Anplis de sa, mikrofoto yo te kaptire ak TEM a te revele ke sourit yotari te ekspoze domaj podocyte enpòtan ak efasman pwosesis pye ak yon mank de fant fifiltrasyon. Apre aksidan an, podosit yo sibi pwosesis efasman kote yo pèdi estrikti yo, ki mennen nan yon rediksyon nan fonksyon baryè fifiltrasyon yo [32]. Tout fòm sendwòm nefrotik, osi byen ke glomerulosclerosis segmental fokal (FSGS), yo karakterize pa domaj nan estrikti podocyte oswa fonksyon [33].
Etid aktyèl nou an te montre ekspresyon ki pi wo nan DAB1 nan pati apical ak lateral nan manbràn selilè DCT a, pandan y ap REELIN te sitou gaye nan tout sitoplasm PCT la. Nan pwen tan envestigasyon yo, pa gen okenn chanjman mòfolojik yo te obsève nan tubuli nan sourit yotari, men plis envestigasyon nesesè yo elicide wòl nan DAB1 nan konpatiman tubulointerstitial. Te gen yon kolokizasyon okazyonèl nan pwoteyin DAB1 ak REELIN, sitou nan DCT la. Konklizyon sa yo ap swiv travay anvan nou an konsènan ekspresyon de pwoteyin sa yo pandan fetis imen anrendevlopman [9]. Sa a ka sijere ke DAB1 ak reelin gen wòl menm jan an nan moun ak souritrenpa aktive kèk nan chemen yo en, tankou Crk, MAPK ak PI3K/Akt/mTOR kaskad siyal [34-36]. Done nou yo tou revele ogmante ekspresyon reelin nan glomeruli yo nan sourit yotari. Enteresan, yon etid anvan te montre ke fosforilasyon DAB1 ak ogmante ekspresyon reelin nan glomeruli yo te akonpaye pa tansyon wo, proteinuria, ak blesi podocyte nan rat yo Ang II-enfuze [10].
Anplis de sa, tach imunofluoresan te revele yon ekspresyon ogmante nan reseptè NOTCH2 nan glomeruli yo nan sourit yotari P14. Li se byen li te ye ke ekspresyon NOTCH2 se downregulated yon fwa nephron spirasyon reyalize, eksepte nan kondisyon yo nanblesi ren,tankou nefropati dyabetik ak FSGS [15,37]. Sourit ki gen sendwòm nefrotik Adriamycin-induced tou te montre ogmante ekspresyon NOTCH2 aktive, ki amelyore fifibroz [38]. Nan pwen tan envestigasyon yo, nou pa t remake ogmante fifibroz, men li rete pou elicide wòl egzak NOTCH2 eksprime nan yotari apre akouchman an.ren.Plis obsèvasyon sou si chanjman fifibrotic rive nan etap pita yo ta nesesè. Sepandan, gen deja kèk rezilta ki sijere efè a kout tèm nan ogmante deklanchman NOTCH2 ki asosye ak yon benefis siviv fò pou podosit blese, ki pèdi nan modèl alontèm, tankou nefropati dyabetik [39].
Pi wo ekspresyon LC3B nan glomeruli yo nan sourit yotari P11 ak P14 pwobableman reflete yon akimilasyon nan otofagosom yo nan podosit yo. Pou montre klèman ke otofaji te akselere. Li nesesè pou analize rapò ekspresyon pwoteyin LC3-II ak LC{3-I. Nan kondisyon nòmal, otofaji nesesè pou nòmalfonksyon ren[40], espesyalman nan podosit. Akòz kapasite limite li pou divizyon selilè ak ranplasman, yo montre yon wo nivo debaz otofaji [41]. Malgre rezilta sa yo, yo te rapòte elevasyon nan ekspresyon LC3B nan plizyè maladi glomerulèr [42-44], sitou an asosyasyon ak efasman pwosesis pye ak devlopman sendwòm nefrotik, jan yo wè nan sourit knockout kondisyonèl reseptè prorenin [45,46]. Tout etid sa yo sijere yon wòl pwoteksyon nan otofaji amelyore nan kondisyon patolojik, plis sipòte pa rezilta yo nan nefropati Adriamycin-induit, kote otofaji yo aktive pou pwoteje kont blesi podosit [43], osi byen ke nan maladi glomerulè ki depann de laj kote li reta. n bès nan fonksyonèl pwogresif nanfonksyon ren[40]. Analiz de mounrenbyopsi te montre tou prèv ogmante otofaji an asosyasyon ak efasman pwosesis pye nan plizyè maladi glomerulèr, ki gen ladan sendwòm nefrotik chanjman minimòm (MCNS), ki se youn nan kòz ki pi komen nan sendwòm nefrotik idyopatik [19]. Nan kondisyon yo nan nefropati dyabetik ak lipopolysaccharide-induit egiblesi nan ren,amelyore otofaji ak kèk terapi atravè anpèchman chemen PI3K/AKT/mTOR amelyore fonksyon ren [47,48]. Tout rezilta sa yo enplike ke otofaji gen yon wòl endispansab cytoprotective pou adaptasyon estrès nanblesi nan ren, ak modulasyon li yo ta ka yon estrateji terapetik pwomèt, byenke, nan kèk sikonstans, otofaji kapab tou danjere ak pwogrè nan lanmò selil.
CISTANCHE AP AMELIORE ENFÒK REN/RENAL
Eksepte pou elevasyon nan otofaji, yon nivo ogmante nan apoptoz ta ka obsève tou nan glomeruli yo nan sourit yotari P14. Otofaji anjeneral anpeche apoptoz, men nan sikonstans patolojik espesifik, li kapab tou gen yon efè opoze sou siviv selil pa amelyore ak ankouraje apoptoz [42]. Apre nesans, apoptoz nanrense anpil diminye, eksepte nan kondisyon yo nanblesi nan ren,tankou sendwòm nefrotik idyopatik kote kontribye nan devlope maladi a [23]. potansyèl roman kòz nan anomali otozomal resesif konjenital nanrenak aparèy urin. Sepandan, wòl prensipal DAB1 pandanrendevlopman rete klè. Anplis de sa, sourit sa yo te parèt anòmal nan pwosesis pye yo ak yon nivo ogmante nan reelin, NOTCH2, LC3B ak pwoteyin CASP3 kwoke nan glomeruli yo ki ka mennen nan blesi glomerulè, tankou sendwòm nefrotik, ki an korelasyon ak ipoplasi, ka yon kòz potansyèl lanmò. nan bèt sa yo pandan peryòd sevraj la. Pou konfime ipotèz sa a, li nesesè pou bay plis enfòmasyon konsènan tansyon ak lòt paramèt klinik-laboratwa, tankou nivo kreyatinin serik, albumin, ak pwoteyin.
