Acylated Phenylethanoid Oligoglycosides Ak Aktivite Hepatoprotective Soti nan Plant Dezè Cistanche Tubulosa
Mar 15, 2022
pou plis enfòmasyon:Ali.ma@wecistanche.com
Toshio Morikawa et al
Résumé
Ekstrè nan metanolik soti nan tij fre nanCistanche tubulosa(Orobanchaceae) te jwenn pou montre efè hepatoprotective kont D-galactosamine (D-GalN)/lipopolysaccharide (LPS)-induit fwa injuryin sourit. Soti nan ekstrè a, twa nouvofeniletanoidoligoglikozid, kankanosid H1 (1), H2 (2), ak I (3), yo te izole ansanm ak 16glikozid feniletanoid(4-19) ak de oligosugar acylate (20,21). Estrikti 1-3 yo te detèmine sou baz pwopriyete espektroskopik ak prèv chimik. Pami izola yo, echinakozid (4, IC50=10.2 lM), akteozid (5, 4.6 lM), izoakteozid (6,5.3 lM), 20-acetylacteoside (8, 4.8 lM), ak tubuloside. Yon (10, 8.6 lM) inibit lanmò D-GalN-induit ofhepatocytes. Senk izolat sa yo, 4 (31.1 lM), 5 (17.8 lM), 6 (22.7 lM), 8 (25.7 lM), ak 10 (23.2 lM), ak cistantubuloside B1 (11, 21.4 lM) tou redwi TNF-a- pwovoke sitotoksisite nan selil L929. Anplis de sa, eleman prensipal yo (4-6) te ekspoze efè epatoprotective in vivo nan dòz 25-100 mg / kg, PO.
Klike sou efè segondè cistanche ak pwodwi Cistanche
1. Entwodiksyon
Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) se plant parazit atènèl k ap grandi sou rasin Salvadora oswa Calotropisspecies, epi distribye nan Afrik Dinò, Arabi, ak peyi Azyatik.Cistanche tubulosaak asistans salsa ak Cistanche deserticola te tradisyonèlman te itilize pou tretman enpotans, esterilite, lonbago, ak feblès kò osi byen ke yon ajan pwomosyon nan sikilasyon san.2,3 Anvan sa, plizyèfeniletanoids, iridoids, monoterpenes, ak lignans te izole nan Chinwa ak PakistanCistanche tubulosa.2,4–9 Nan etid karakterizasyon nou yo sou konstitiyan byoaktif nan medikaman natirèl sa a, nou te deja rapòte ke senk iridoid, kankanosid A–D ak kankanol, yon monoterpeneglycoside, kankanoside E, de.feniletanoidoligoglikozid, kankanosid F ak G (23), ak yon sik oligo acylated, kankanose (21), yo te izole nan ekstrè nan metanolik nan tij sèk nanCistanche tubulosa.10,11 Anplis de sa, ekstrè nan metanolik ak plizyè izolat tankou echinacoside (4), acteoside (5), cistanoside F (20), 21, ak kankanoside F yo te jwenn yo montre efè vasorelaxant, sa vle di, efè inhibition kont kontraksyon pwovoke. pa noradrenalin nan izole rat thoracic aorta.11 Nan etid k ap kontinye nou yo sou elektè nan plant la, yon ekstrè metanolik nan tij fre nanCistanche tubules teyo te jwenn yo montre yon efè pwoteksyon sou blesi fwa pwovoke pa D-galactosamine (D-GalN) / lipopolysaccharide (LPS) nan sourit. Soti nan ekstrè metanolik la, nou te izole twa nouvofeniletanoidoligoglikozid yo te rele kankanosid H1 (1), H2 (2), ak I (3) ansanm ak 16 glikozid feniletanoid (4-19) ak de oligosik acylate (20, 21). Papye sa a fè fas ak izolasyon ak elisid estriktirèl nouvo sa yofeniletanoidoligoglikozid (1-3). Yo diskite sou egzijans estriktirèl glikozid feniletanoid pou aktivite epatopwotektif (figi 1).
2. Rezilta ak diskisyon
2.1. Efè pwoteksyon nan ekstrè metanolik soti nan tij nanCistanche tubulosasou blesi fwa pwovoke pa D-GalN / LPS nan sourit
Tij fre nanCistanche tubulosa(Kiltive nan Urumqi, XinjiangProvince, Lachin) yo te ekstrè ak metanol anba jwèt rflu yon ekstrè metanolik (8.36 pousan soti nan tij yo fre). Jan yo montre nan Tablo 1, nan dòz 250-500 mg / kg, PO, ekstrè metanolik la te montre yon efè inhibition sou ogmantasyon nan serom aspartate amino transaminase (sAST) ak alanine aminotransaminase (sALT), makè nan blesi fwa, pwovoke pa D- GalN/LPS nan sourit.
2.2. Konstitiyan chimik soti nan tij nanCistanche tubulosa
Yon ekstrè metanolik soti nan tij yo fre nanCistanche tubulosate sibi Diaion HP-20 kolòn chromatography (H2O?MeOH) pou bay fraksyon H2O- ak MeOH-elye (5.63 pousan ak 2.73 pousan, respektivman). Yo te sibi fraksyon nan MeOH-eluye a SiO2 ak ODScolumn kwomatografi epi finalman HPLC bay twa nouvo.feniletanoidoligoglikozid, kankanosid H1 (1, 0.0{008 pousan ), H2 (2, 0.0001 pousan ), ak I (3, 0.0007 pousan ) ansanm ak 16glikozid feniletanoid, echinacoside2,11 (4, 0.45 pousan ), acteoside2,11 (5, 0.28 pousan ), isoacteoside2,11 (6, 0.0 41 pousan), cis-acteoside12,13 (7, 0.0007 pousan), 20-acetylactoside2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 pousan), dekafeoilakteozid14 (9, 0.0002 pousan ), tubulo bò A2,11 (10, 0.013 pousan ), cistantubuloside B19 (11, 0.0020 pousan ), B29 (12,0.0003 pousan ), arenarioside15 (13, 0.0006 pousan ), wiedemanninoside C16 (14,0.0008 pousan), cistantubuloside A9 (15, 0.0009 pousan), syringalide A 30-OaL rhamnopyranoside4 (16, 0.0017 pousan), campneosides I17,18 (17,0.815) (17,0.815) ak II. , 0.0005 pousan), ak salidroside11 (19, 0.0027 pousan), ak de oligosugar acylated, cistanoside F11 (20, 0.0004 pousan) ak kankanose11 (21, 0.0004 pousan).
2.3. Estrikti kankanosid H1 (1), H2 (2), ak I (3)
Kankanoside H1 (1) te jwenn kòm yon poud blan ak wotasyon negatif optik (½a-24D-45.3 nan MeOH). Spectre IR li yo te montre bann absòpsyon nan 3416, 1736, 1638, 1605, 1{{1{0}}70, ak 1040 cm 1 ki kapab atribiye a idwoksil, karbonil ester, fonksyon etè. ak bag aromat. Pozitif-yo ak negatif-ion FABMSspectra nan 1 te montre pik quasimolecular ion nan m/z 835(M plis Na) plis ak m/z 811 (MH), respektivman, ak fòmil molekilè a te detèmine kòm C37H48O20 pa segondè-rezolisyon pozitif- ion FABMS mezi. Spectres 1H ak 13C NMR nan 1 (CD3OD, Tablo 2 ak 3), ki te plase pa plizyè eksperyans NMR,19 te montre siyal yo ka bay de metilèn [d 2.70(2H, m, H2-7), 3.66. , 4.07 (1H chak, tou de m, H2-8)], ortho-andmeta-kouple ABC-kalite pwoton aromat [d 6.52 (1H, dd, J=1.8,7.8 Hz, H{ {50}}), 6.65 (1H, d, J=1.8 Hz, H{-2), 6.67 (1H, d, J=7.8 Hz, H{{62 }})], de bD-glucopyranosyl fragments [d 4.29 (1H, d, J=7.8 Hz,terminal-Glc-H{-1), 4.54 (1H, d, J {{76 }}.2 Hz, anndan-Glc-H-1)], ak aa-L-rhamnopyranosyl fraction [d 1.06 (3H, d, J=6.0 Hz, Rha-H{{89) }}),4.80 (1H, br s, Rha-H-1)] ansanm ak yon gwoup asetil [d 1.98(3H, s)] ak yon gwoup trans-p-coumaroyl {yon trans-olefin [d 6.34,7.67 (1H chak, tou de d, J=16.0 Hz, H{-8 ak 7)] ak ortho-coupledA2B2-tip pwoton aromat [d 6.80, 7.46 (2H chak , tou de d,J=8.7 Hz, H{-3,5 ak 2,6)]}. Koneksyon ant oligoglikozid ak acil yo nan 1 yo te karakterize pa yon eksperyans HMBC, ki te montre korelasyon alontèm ant pwoton ak pè kabòn sa yo: enteryè-Glc-H-1 ak C-8 (dC71.9). ); nndan-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, dd-like)] ak asetil karbonil kabòn (dC 171.4); nndan-Glc-H-4 [d 5.08 (1H, dd, J=9.6, 9.6 Hz)] ak p-koumaroyl kabònil kabòn (dC 168.2); Rha-H-1 ak anndan-Glc-C-3 (dC 80.5); ak tèminal-Glc-H-1 ak enteryè-Glc-C-6 (dC69.3) (Fig. 2). Finalman, idroliz alkalin nan 1 ak 5 pousan potassiumhydroxide (KOH) libere asid trans-p-coumaric, ki te idantifye pa analiz HPLC, ansanm ak yon pwodwi deacylate. Yo te trete pwodwi deacylated la ak 1.0 M asid idroklorik (HCl) pou libere L-ramnoz ak D-glikoz, ki te idantifye pa analiz HPLC lè l sèvi avèk yon detektè wotasyon optik. }}(3,4-dihydroxy phenyl)etil OaL-ramnopiranosil-(1- 3)-[bD-glucopyranosyl-({1-6)]{-2-O-acetyl{{196 }} O-trans-p-coumaroyl-bD-glucopyranoside (1).
Kankanoside H2 (2) te izole kòm yon poud blan ak wotasyon negatif optik (½a 25 D 52.4 nan MeOH). Yo te jwenn fòmil molekilè li C37H48O20 menm jan ak 1 pa mezi FABMS-ion pozitif-wo rezolisyon. Pwopriyete espektroskopik 2 yo te sanble anpil ak sa yo ki nan 1, eksepte pou siyal akòz gwoup cis-p-coumaroyl [d 5.79, 6.95 (1H chak, tou de d, J=12.8 Hz, H{{ 22}} ak 7), 6.76, 7.73 (2H chak, tou de d, J=8.7 Hz, H-3,5 ak 2,6)]. Anplis de sa, eksperyans HMBC sou 2 a tou revele mòd ki sanble nan korelasyon alontèm tankou sa yo detekte pou 1 ant pè pwoton ak kabòn sa yo: inner-Glc-H-1 [d 4.51 (1H, d, J {{44 }}.8 Hz)] ak C-8 (dC 72.0); nndan-Glc-H-2 [d 4.88 (1H, m)] ak acetyl carbonyl kabòn (dC 171.4); nndan-Glc-H-4 [d 4.98 (1H, dd, J=9.6, 9.7 Hz)] ak p-koumaroyl kabònil kabòn (dC 166.7); Rha-H-1 [d 4.77 (1H, d, J=1.4 Hz, Rha-H{-1)] ak anndan-Glc-C-3 (dC 80.7 ); ak tèminal-Glc-H-1 [d 4.28 (1H, d, J=7.8 Hz)] ak enteryè-Glc-C{-6 (dC 69.4) (Fig. 2) . Dapre etid degradasyon an, 2 te bay asid cis-p-koumarik ak de sik menm jan ak sa yo te jwenn nan ka 1. Konsekans, estrikti kankanozid H2 yo te elisid yo dwe 2-(3,4- dihydroxy phenyl)etil OaL-rhamnopyranosyl-(1-3)-[bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl-4-O-cis-p-coumaroyl- bD-glucopyranoside (2).
Kankanoside I (3) te izole tou kòm yon poud blan ak wotasyon negatif optik (½a- 25D-62.2 nan MeOH). Fòmil molekilè li yo, C35H46O18, te detèmine pa pozitiv- ak negatif-FABMS ak HRFABMS mezi. Pwopriyete espektroskopik 3(CD3OD, Tablo 2 ak 3) te supèrpozab sou sa yo nan echinacoside (4), eksepte pou siyal akòz pati aglycone {{de methylene {d 2.95 (2H, dd, J=7). 3, 7.8 Hz, H2-7), [3.79 (1H, m), 4.10 (1H,dt, J=16.9, 7.3 Hz), H{{32} }]}, pwoton aromat monosubstituted [d7.18 (1H, m, H-4), 7.26–7.28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Alkalinehydrolysis nan 3 ak 5 pousan KOH libere asid trans-kafeik, ak pwodwi thedeacylated te siksesif trete ak 1.0 M HCl libere L-rhamnose ak D-glikoz. Finalman, HMBCexperiment la te klarifye koneksyon akilgroup ak moye sik nan 3, jan yo montre nan Figi 2. Sou baz evidans ki anwo a, yo te elucide estrikti kankanoside mwen yo dwe 2-phenylethyl OaL- rhamnopyranosyl-(1-3)-[bD-glucopyrano-syl-(1-6)]{-4-O-trans-kafeoyl-bD-glucopyranoside (3)
2.4. Efè konstitiyan chimik ki soti nan tij Cistanche tubulosa sou sitotoksisite D-GalN-induit nan epatosit prensipal kiltive sourit
D-GalN/LPS-pwovoke blesi fwa yo rekonèt yo devlope atravè repons iminolojik.19 Yo rapòte kalite blesi fwa sa a rive nan de fòm. Premyèman, D-GalN ogmante sansiblite a TNF-a pa rediksyon ofuridin trifosfat nan epatosit. Dezyèmman, medyatè pro-enflamatwa, tankou NO ak TNF-a, yo libere nan makrofaj aktive LPS (selil Kupffer). Yo rapòte apoptoz epatosit pa TNF-a gen yon wòl enpòtan nan blesi fwa D-GalN/LPS-induit.20
Nan etid anvan nou yo sou konpoze epatopwotektif nan medikaman natirèl, nou te rapòte ke plizyè elektè ki soti nan Hovenia Dulcis,21 Bupleurum scorzonerifolium,22,23 Curcuma zedoaria,24–26Angelica furcijuga,27,28 Betula sativum,30 Salacia reticulata,31 Tilia argentea,332. hierochuntica,33 Panax notoginseng,34 Cyperus longus,35 Erycibe expansa,36Camellia sinensis,37 Sedum sarmentosum,38,39 Sinocrassula indica,40Hedychium coronarium,41 ak Piper chaba42,43 te montre efè hepatoprotective nan liver/LPS DG indual nan liver/Djual. nan sourit ak/oswa platyphylla var. japonica,29 Pisum efè inhibition sou D-GalN-pwovoke cytotoxicity nan prensipal culturedhepatocytes. Depi ekstrè nan metanolik soti nan tij yo nanCistanche tubulosate montre efè hepatoprotective sou D-GalN/LPS-pwovoke blesi fwa nan sourit (vide ante), efè a inhibition nan konstitiyan yo sou D-GalN-pwovoke sitotoksisite nan epatosit prensipal kiltive sourit yo te egzamine lè l sèvi avèk 3-(4,{ {6}}dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolym bromur (MTT) assay. Jan yo montre nan Tablo 4, echinacoside (4, IC 50=10.2 lM), acteoside (5, 4.6 lM), isoaceteoside (6, 5.3 lM), 20-acetylatteoside (8, 4.8 lM), tubulosides A (10,8.6 lM) ak B11 (22, 14.6 lM), ak kankanoside G11 (23, 14.8 lM) te montre gwo aktivite. Aktivite yo te pi gran pase silybin komèsyal (38.8 lM),33–43 kòm yon kontwòl pozitif.44,45 Kondisyon estriktirèl la.glikozid feniletanoid for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM)]; (2) aglikon ki gen 3,4-dihydroxy gwoup la te montre aktivite pi fò pase sa ki gen 4-idwoksi gwoup la (6 > 23); (3) 60- Moyete ObD-glucopyranosyl la redwi aktivite a (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" pati="" 8-obd-glucopyranosyl="" ki="" gen="" 40-="" gwoup="" o-kafeoyl="" la="" te="" montre="" aktivite="" pi="" fò="" pase="" sa="" ki="" gen="" 60-="" gwoup="" o-kafeoyl="" (5="6," 8=""> 22). ); ak (5) entwodiksyon nan 20- O-acetylmoiety a redwi aktivite a (8 5 5, 22 <>
Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, done yo pa montre).Kidonk, yo te jwenn konpoze sa yo ki pa afekte twòp pwodiksyon NO ak TNF-a nan makrofaj aktive LPS.
2.5. Efè konstitiyan chimik yo sou TNF-a-inducedcytotoxicity nan selil L929
Yo nan lòd yo klarifye efè yo nan elektè yo sou sansiblite nan epatosit nan TNF-a, TNF-a-induit diminisyon nan viabilite nan selil L929, yon liy selil TNF-a-sansib,48 te egzamine lè l sèvi avèk tès MTT la. San echantiyon tès yo, viabilite selil la te redwi a ca. 60 pousan apre enkubasyon selil yo ak 20 ng/mL TNF-a pou 44 èdtan konpare ak ka a san TNF-a. Jan yo montre nan Tablo 5, echinacoside (4, IC 50=31.1 lM), acteoside (5, 17.8 lM), isoaceteoside (6, 22.7 lM), 20- acetylacteoside (8, 25.7 lM), tubuloside A (10,23.2 lM), ak cistantubuloside B1 (11, 21.4 lM) anpeche diminisyon nan viabilite selil la, epi yo te jwenn aktivite yo pi gran pase sa yo ki nan piperine42,43 ak silybin. Kondisyon estriktirèl laglikozid feniletanoid for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; ak (5) entwodiksyon de 20- O-acetyl la diminye aktivite a (8 < 5,="" 22="">< 6).="" kondisyon="" sa="" yo="" te="" jwenn="" menm="" jan="" ak="" sa="" yo="" obsève="" nan="" chapit="" anvan="" an="" konsènan="" efè="" inhibition="" sou="" d-galn-pwovoke="" sitotoksisite="" nan="" epatosit="" sourit="" prensipal="">
Konklizyon sa yo in vitro sijere mekanis posib aksyon sa yo pou efè epatopwotektif eleman yo nan tij yo.Cistanche tubulosa: (i) diminye sitototoksisite D-GalN-induced (4-6, 8, 10, 22, ak 23), ak (ii) diminye TNF-a-inducedcytotoxicity (4-6, 8, 10, ak 11) .
2.6. Efè pwoteksyon echinacoside (4), acteoside (5), andisoacteoside (6) kont blesi fwa pwovoke pa D-GalN/LPS inmice ak mòd aksyon yo.
Finalman, nou te egzamine efè direktè lekòl laglikozid feniletanoid, echinacoside (4), acteoside (5), ak isoacteoside (6) sou blesi fwa D-GalN/LPS-induit nan sourit. Jan yo montre nan Tablo 6 ak 4-6 siyifikativman anpeche ogmantasyon nan sAST ak SALT induced by D-GalN / LPS nan sourit nan dòz 25-100 mg / kg, PO. Nan lòt men an, 4-6 pa te afekte twòp pwodiksyon TNF-a nan makrofaj aktive LPS. Anplis de sa, 4-6 siyifikativman anpeche lanmò nan selil L929 ki te koze pa TNF-a, ki endike yon diminisyon nan sansiblite nan selil L929 nan TNF-a (vide ante). Konklizyon sa yo sijere ke 4-6 diminye sansiblite selil sa yo nan sitotoksisite TNF-a-induit la. Anpil konpoze ki anpeche lanmò selil D-GalN pwovoke ak pwodiksyon TNF-a yo te rapòte, 24,26,32 men gen kèk konpoze ki te rapòte ke selektivman redwi sansiblite nan epatosit nan TNF-a.42,43,49,50.
An konklizyon, soti nan tij fre nanCistanche tubulosa, twa nouvoglikozid feniletanoid, kankanosid H1 (1), H2 (2), ak mwen (3) ansanm ak 16 li te yeglikozid feniletanoid(4-19) ak twoacylate oligosugars (20, 21) yo te izole. Kondisyon estriktirèl pou efè pwoteksyon yo sou blesi epatosit ki te pwovoke pa D-GalN, ak efè cytoprotective sou selil L929 ki te koze pa TNF-a yo te jan sa a; (1) pati aglikon an te esansyèl pou aktivite a; (2) aglikon ki te gen 3,4-dihydroxy gwoup la te montre aktivite ki pi fò pase sa ki te gen 4-gwoup idwoksi a;(3) 60-ObD-glucopyranosyl fragments redwi aktivite a; (4) pati 8-ObD-glucopyranosyl ki te gen 40-O-kafeoyl gwoup la te montre yon aktivite pi fò pase sa ki te gen 60-O-kafeoyl gwoup la;ak (5) entwodiksyon {{27} }} Moyete O-acetyl redwi aktivite a.Anplis de sa, direktè lekòl laglikozid feniletanoid, echinacoside (4), acteoside (5), ak isoacteoside (6), inibit ogmantasyon insAST ak saLT nan dòz 25-100 mg / kg PO nan D-GalN / LPS-treated sourit, ak efè inhibition sa yo te sijere yo dwe. depann sou sansiblite redwi nan epatosit nan TNF-a. Detaye mekanis aksyon anglikozid feniletanoidta dwe etidye pi lwen.
3. Eksperimantal
3.1. Jeneral
Yo te itilize enstriman sa yo pou jwenn done espektral ak fizik: wotasyon espesifik, Horiba SEPA-300 polarimèt dijital (l=5 cm); UV spectre, Shimadzu UV-1600 spectrometer; IR spectre, Shimadzu FTIR-8100 spectrometer; 1H ak 13C NMR spectre, JEOLJNM-ECA600 (600 ak 150 MHz) ak JEOL JNM-ECS400 (400 and100 HMz) espektromètr ak tetramethylsilane kòm yon estanda entèn; FABMS ak gwo rezolisyon FABMS, JEOL JMS-SX 102A masspectrometer; Detektè HPLC, Shimadzu RID-10Yon endèks refraktif, Shimadzu SPD-10A UV-vis, ak Shodex OSWA-2 detektè wotasyon optik. Kolòn HPLC, Cosmosil 5C18-MS-II, ak pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4.6 mm id) ak (250 - 20 mm id) kolòn yo te itilize pou rezon analyse ak preparasyon, respektivman.
Kondisyon eksperimantal sa yo te itilize pou kwomatografi: kwomatografi kolòn jèl silica faz nòmal (CC), jèl silica 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63–210 may, esferik, net ); ranvèse-faz silica jèl CC, Diaion HP -20 (NipponRensui) ak Chromatorex ODS DM1 0 20T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100-200 may); nòmal-faz TLC, pre-kouvwi TLC plak withsilica gel 60F254 (Merck, 0.25 mm); TLC ranvèse-faz, plak TLC pre-kouvwi ak jèl silica RP -18 F254S (Merck, 0.25 mm); HPTLC ranvèse-faz, plak TLC pre-kouvwi ak jèl silica RP-18 WF254S (Merck, 0.25 mm), deteksyon an te reyalize pa flite ak 1 pousan Ce (SO4) 2-10 pousan akeuz H2SO4, ki te swiv pa chofaj .
3.2. Materyèl plant
Tij fre nanCistanche tubulosakiltive nan Urumqi, Xinjiang Pwovens, Lachin yo te kolekte nan mwa septanm nan 2007. Materyèl la plant te idantifye pa youn nan otè yo (MY). Yon bon pou plant materyèl la nan dosye nan laboratwa nou an.
3.3. Ekstraksyon ak izolasyon
Tij yo fre nanCistanche tubulosa(2.98 kg) yo te tise byen koupe ak ekstrè twa fwa ak metanol anba rflu pou 3 èdtan. Evaporasyon sòlvan an anba presyon redwi bay yon ekstrè metanolik (249.1 g, 8.36 pousan). Ekstrè metanolik la te sibi Diaion HP 20 CC (5.0 kg, H2O?MeOH) pou bay fraksyon H2O ak MeOH-eluye (167.84 g, 5.63 pousan ak 81.21 g, 2.73 pousan). , respektivman). MeOH-elutedfraction (61.00 g) te sibi nòmal-faz silica jèl CC [1.8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15:3:0.4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] pou bay sèt fraksyon [Fr. 1 (1.12 g), 2 (9.56 g), 3 (0.89 g), 4 (1{0.69 g), 5 (8.84 g), 6 (12.52 g), ak 7 (4.60 g)]. Fraksyon 2 (9.56 g) te separe pa ranvèse-faz jèl silica CC [400 g,MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?asetòn] bay senk fraksyon[Fr. 2-1 (55.9 mg), 2-2 (4.48 g), 2-3 (3.42 g), 2-4 (1.16 g), ak 2-5 (31.9 mg)]. Fraksyon 2–3 (1.0{0 g) te sibi HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (7:93, v/ v)] bay sètfraksyon [Fr. 2-3-1 (66.5 mg), 2-3-2 (20.4 mg), 2-3-3 (26.0 mg), 2-3-4 (136.6) mg), 2-3-5 (38{{300}}.6 mg), 2-3-7 (84.9 mg)]. Fraksyon 2–3–4 (106.6 mg) te pirifye plis pa HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN–1 pousan AcOH akeuz (5:95, v/v)] pou bay salidroside (19,13.7 mg, {{340}}.0{{4{09}}27 pousan). Fraksyon 4 (10.69 g) te separe pa jèl silica CC [500 g, MeOH–H2O (30:7). 0,v/v)?MeOH?asetòn] pou bay kat fraksyon [Fr. 4-1 (878.2 mg), 4-2 (7.0 6 g), 4-3 (1.57 g), ak 4-4 (792.8 mg)]. Fraksyon 4–2(1.5{{560}} g) te sibi HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 pousan AcOH akeuz (2{{57{{586} }}}:80, v/v)] pou bay senk fraksyon {Fr. 4–2–1(42.9 mg), 4–2–2 [= kanneozid I (17, 67.0 mg, 0.014 pousan )], 4–2– 3 [= acteoside (5, 1.21 g, 0.26 pousan )], 4-2-4 (41.6 mg), ak 4-2-5 (181.3 mg)}. Fraksyon 4–2–4 (41.6 mg) te pirifye plis pa HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 pousan akeo AcOH (18:82, v/v)] pou bay isoacteoside (6, 19.1 mg, 0.0040 pousan) ak cis-acteoside. (7,3.4 mg, 0.0007 pousan). Fraksyon 4-3 (1.57 g) te pirifye pa HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (20:80, v/v)] bay 11 fraksyon [Fr. 4-3-1 (30.4 mg), 4-3-2 (55.2 mg), 4-3-3 (= 17, 22.1 mg, 0.0010 pousan), 4-3-4 (= 5 , 224.6 mg, 0.010 pousan), 4-3-5 (27.4 mg), 4-3-6 (43.6 mg), 4-3-7 (= 6, 825.0 mg, 0.037 pousan), 4-3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-rhamnopyranoside (16, 37.6 mg, 0.0017 pousan )], 4–3–9 (39.8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetylatteoside (8, 85.4 mg, 0.0038 pousan)], and4-3-11 (64.6 mg)]. Fraksyon 4–3–6 (43.6 mg) te pirifye plis pa HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (18:82,v/v)] pou bay kankanosid H1 (1, 17.0 mg, 0.0008 pousan) ak H2 (2,3.3 mg, 0.0001 pousan). Fraksyon 4-3-9 (39.8 mg) te pirifye plis pa HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (18:82, v/v)] pou bay kankanoside I (3, 15.4 mg, 0.0007 pousan) ak 6 ( 3.1 mg, 0.0001 pousan ).Fraksyon 5 (8.84 g) te separe pa ranvèse-faz silica gelCC [400 g, MeOH–H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?acetone] togive sèt fraksyon [Fr. 5-1 (870.2 mg), 5-2 (478.9 mg), 5-3 (3.72 g), 5-4 (979.9 mg), 5-5 (1.19 g), 5-6 (1.27 g), ak 5 –7 (130.1 mg)]. Fraksyon 5-1 (870.2 mg) te pirifye pa HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (5:95, v / v)] bay decaffeoy lakteozid (9, 5.1 mg, 0.0002 pousan) ak cistanoside F ( 20, 8.1 mg, 0.0004 pousan). Fraksyon 5-3 (3.72 g) te pirifye pa HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (15:85, v/v)] pou bay sis fraksyon [Fr. 5-3-1 (128.6 mg), 5-3-2 [= kankanoz (21, 9.4 mg, 0.0004 pousan )], 5-3-3 (64.6 mg), 5-3-4 (72.3) mg), 5-3-5 [= bò echinaco (4, 2.54 g, 0.11 pousan), ak 5-3-6 (318.5 mg)]. Fraksyon 5-3-4 (72.3 mg) te pirifye plis pa HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 pousan akeuz AcOH (10:90, v / v)] bay campneoside II (18,10.6 mg, 0.0005 pousan). Fraksyon 5-4 (979.9 mg) te pirifye pa HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (15:85, v/v)] nan fraksyon bayin [Fr. 5–4–1 (28.6 mg), 5–4–2 (90.5 mg), 5–4–3 (99.7 mg), 5–4–4 (= 4, 25.7 mg, 0.0012 pousan), 5 –4–5 (16.4 mg), 5–4–6 (318.5 mg), 5–4–7 (21.6 mg), 5–4–8 (= 5, 204.4 mg, 0.0091 pousan), ak5– 4–9 (134.7 mg)]. Fraksyon 5–4–6 (318.5 mg) te pirifye pa HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (15:85, v/v)] pou bay cistantubuloside B1 (11, 44.9 mg, 0.0020 pousan), B2 (12). , 7.6 mg, 0.0003 pousan ), ak A (15, 21.1 mg, 0.0009 pousan ) ak wiedemanninoside C (14, 17.2 mg, 0.0008 pousan ). Fraksyon 5-5 (1.19 g) te pirifye pa HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (18:82, v/v)] pou bay tubuloside A (10, 300.3 mg, 0.013 pousan) ak arenarioside (13,5.8 mg, 0.0006 pousan). Fraksyon 6 (12.52 g) te separe pa ranvèse-faz silica gel CC [600 g, MeOH–H2O (20:80?30:70,v/v)?MeOH?acetone] bay kat fraksyon [Fr. 6-1 (553.8 mg), 6-2 (10.69 g), 6-3 (1.40 g), ak 6-4 (17.8 mg)]. Fraksyon 6–2 (500.0 mg) te pirifye pa HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (25:75, v/v)] pou bay 4 (353.1 mg, 0.34 pousan). ).
3.3.1. Kankanoside H1 (1)
Yon poud blan, ½a{0}D -45.3 (c 1.06, MeOH). High-rezolisyon pozitif-ion FABMS: Calcd pou C37H48O20Na (M plis Na) plis: 835.2637.Found: 835.2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4.33), 293 (sh,4.36), 317 (4.52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: yo bay nan Tablo 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: yo bay nan Tablo 3. Pozitif-ion FABMS: m/z 835 (M plis Na) plis. Negatif-ion FABMS: m/z 811 (MH)-.
3.3.2. Kankanoside
H2 (2)Yon poud blan, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). High-rezolisyon pozitif-ion FABMS: Calcd pou C37H48O20Na (M plis Na) plis: 835.2637. Twouve: 835.2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4.26), 290 (sh, 4.22), 316 (4.37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: bay nan tablo 2. 13C RMN (150 MHz, CD3OD) dC: bay nan tablo 3. FABMS pozitif-ion: m/z 835 (M plis Na) plis .Negatif-ion FABMS : m/z 811 (MH)-.
3.3.3. Kankanoside mwen (3)
Yon poud blan, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). High-rezolisyon pozitif-ion FABMS: Calcd pou C35H46O18Na (M plis Na) plis: 777.2581.Found: 777.2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3.97), 295 (sh,4.04), 334 (4.23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: yo bay nan Tablo 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: yo bay nan Tablo 3. Pozitif-ion FABMS: m/z 777 (M plis Na) plis. Negatif-ion FABMS: m/z 753 (MH)-.
3.4. Asid ak idroliz asid nan 1-3
Solisyon 1, 2, ak 3 (chak 1.5 mg) nan 5 pousan akeuz potasyòm idroksid (KOH, 0.5 mL) yo te brase nan 40 degre pou 1 èdtan. Chak solisyon te netralize ak Dowex HCR W2 (H plis fòm), epi yo te retire résine yo pa filtraj. Evaporasyon sòlvan an anba presyon redwi bay pwodwi deacylate korespondan yo, ki te sibi analiz HPLC [kolòn: Cosmosil pNAP, 250 - 4.6 mm id; faz mobil: CH3CN–1 pousan akeuz AcOH (15:85, v/v); deteksyon: UV (254 nm); to koule: 1.0 mL/min] yo dwe idantifye kòm asid trans-kafeik (tR 9.9 min soti nan 3), asid trans-p-koumarik (tR 17.1 min soti nan 1), ak asid cis-p-koumarik. (tR17.8 min soti nan 2), respektivman. Apre sa, yo fonn yo chak nan 1.0 MHCl (1.{0 mL) epi yo te chofe a 80 C pou 3 èdtan. Apre yo fin refwadi, melanj reyaksyon yo te netralize ak Amberlite IRA-400 (fòm OH), epi yo te retire rezin yo pa filtraj. Apre yo fin retire sòlvan an anba presyon redwi, rezidi a te separe pa kolòn katouch Sep-Pak C18 (H2O?MeOH). H2O-elutedfraction a te sibi analiz HPLC nan kondisyon sa yo: kolòn HPLC, Kaseisorb LC NH 2-60-5, 4.6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Japon); deteksyon, wotasyon optik[Shodex OSWA-2 (Showa Denko Co, Ltd, Tokyo, Japon); faz mobil, CH3CN–H2O (85:15, v/v); to koule 0.8 mL/min]. Idantifikasyon L-ramnose (i) ak D-glikoz (ii) ki te libere nan 1, 2, oswa 3 nan fraksyon H2O-eluye te fèt pa konparezon nan tan retansyon yo ak wotasyon optik ak sa yo ki nan echantiyon natif natal [i, tR 9.9 min. (negatif)] ak [ii, tR 17.9 min (pozitif)].
3.5. Bioessai
3.5.1. Reyaktif
LPS (ki soti nan Salmonella enteritidis), mwayen esansyèl minimòm (MEM), ak mwayen William's E yo te achte nan men Sigma–Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA); serom fetal bovine (FBS) te soti nan Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); ak lòt pwodwi chimik yo te soti nan Wako Pure Chemical Industries, Co, Ltd (Osaka, Japon). 96-Oke mikroplak yo te achte nan men Sumitomo Bakelite Co., Ltd (Tokyo, Japon).
3.5.2. Bèt
Sourit ddY gason yo te achte nan men Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japon). Bèt yo te loje nan yon tanperati konstan nan 23 ± 2 C epi yo te manje yon laboratorychow estanda (MF, Oriental Yeast Co, Ltd, Tokyo, Japon). Tout eksperyans yo te fèt ak sourit konsyan sof si otreman. Pwotokòl eksperimantal la te apwouve pa Komite rechèch bèt eksperimantal nan Kinki University.
3.5.3. Efè pwoteksyon sou D-GalN / LPS-pwovoke inmice blesi fwa
Metòd ki dekri pa Tiegs et al.51 te modifye ak itilize pou eksperyans sa a. Yon ti tan, sourit gason ddY ki peze apeprè 25-30 gfasted pou 20 èdtan anvan eksperyans lan. D-GalN (350 mg/kg) ak LPS (10 lg/kg) ki fonn nan saline yo te enjekte intraperitoneally pou pwodwi blesi fwa. Chak echantiyon tès yo te bay oralman 1 èdtan anvan piki D-GalN/LPS la. Yo te kolekte echantiyon san nan plèks venn enfraorbital 10 èdtan apre piki D-GalN/LPS. Nivo sAST aksALT yo te detèmine lè l sèvi avèk metòd Reitman-Frankel (twos komèsyal, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hydrocortisone te itilize kòm yon konpoze referans. Echantiyon tès yo te sispann ak 5 pousan solisyon jansiv arab, epi yo te administre solisyon an oral nan 10 mL / kg nan chak eksperyans, pandan y ap yo te bay machin nan oral nan 10 mL / kg nan gwoup kontwòl ki koresponn lan.
3.5.4. Efè pwoteksyon sou sitotoksisite pwovoke pa D-GalN nan epatosit sourit kiltive prensipal yo
Se {{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromur (MTT) detèmine efè epatopwotektif eleman yo. ) tès kolorimetrik lè l sèvi avèk epatosit kiltirèl prensipal yo.33-43 Hepatosit yo te izole nan sourit maleddY (30-35 g) pa metòd la perfusion kolagenaz. Yon sispansyon selilè nan selil 4 - 104 nan 100 ll mwayen William's E ki gen FBS (10 pousan), penisilin G (100 inite/mL), ak streptomycin (100lg/mL) te vaksinen nan yon mikwoplak 96-byen ak pre-kilti pou 4 èdtan nan 37 degre anba yon atmosfè 5 pousan CO2. Mwayen an te ajoute ak 100 lL nan medyòm fre ki gen D-GalN (2 mM) avèk oswa san echantiyon tès la ak epatosit yo te kiltive pou 44 èdtan. Mwayen an te echanje ak 100 lL medyòm fre, epi yo te ajoute 10 lL MTT [5 mg/mL nan fosfat-tampon salin (PBS)] nan mwayen an. Apre 4 èdtan nan enkubasyon, yo te retire mwayen an, epi yo te ajoute 100 ll isopropanol ki gen 0.04 M HCl pou fonn fòmazan ki pwodui nan selil yo. Dansite optik (OD) nan solisyon an formazan te mezire pa yon lektè microplate nan 570 nm (referans: 655 nm). Anpèchman (pousan) te jwenn pa fòmil sa a.
Anpèchman (pousan)=[(OD (echantiyon) - OD (kontwòl))/(OD (nòmal)-OD (kontwòl))] x 100
3.5.5. Efè sou pwodiksyon NO nan macrophages sourit-peritoneal ki ankouraje LPS
Yo te fè yon tès depistaj pou pwodiksyon NO lè l sèvi avèk makrofaj peritoneal sourit TGC pwovoke jan sa dekri anvan an.43,46,
3.5.6. Efè sou pwodiksyon TNF-a nan macrophages sourit-peritoneal ki ankouraje LPS
TNF-a lage nan mwayen an te detèmine jan sa dekri anvan28 ak yon ti modifikasyon. Yon ti tan, yo te kolekte makrofaj peritoneal sourit TGC (5 - 105 selil/byen) nan kavite peritoneal sourit gason ddY yo, sispann nan 100 lLof RPMI 1640 ak 5 pousan FBS, penisilin (100 inite/). mL), ak streptomycin (100 lg/mL), ak pre-kilti nan 96-mikroplak byen nan 37 degre nan 5 pousan CO2 nan lè a pou 1 èdtan. Selil ki pa aderan yo te retire nan lave ak PBS, epi yo te ajoute 100 lL nan medyòm fre ki gen plizyè konsantrasyon nan konpoze tès la.Apre 10 min, 100 lL nan mwayen ki gen 10 lg/mL LPS te ajoute ak enkube pou 4 èdtan. Pwodiksyon TNF-a nan chak pwi te detèmine lè l sèvi avèk yon twous ELISA (Mouse TNF-a ELISA kit, Invitrogen). Chak konpoze tès yo te fonn nan DMSO, epi yo te ajoute solisyon an nan mwayen an (final konsantrasyon DMSO 0.5 pousan)
3.5.7. Efè inhibition sou lanmò selil TNF-a-pwovoke nan selil L929
Selil L929 (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japon) yo te kenbe nan Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma-Aldrich) ki gen 10 pousan FBS, 1 pousan MEM ki pa esansyèl asid amine (Invitrogen), penisilin G (100 inite). /mL), ak streptomycin (100 lg/mL) nan 37 C anba yon atmosfè 5 pousan CO2. Selil yo te inokule nan yon 96-plak kilti tisi byen [3 -104 selil/pou nan 100 lL/pou nan MEM]. Apre 44 èdtan nan enkubasyon nan mwayen TNF-a (20 ng/mL) avèk oswa san echantiyon tès la, yo te evalye viabilite selil yo pa tès kolorimetri MTT (videante).49,50 Chak konpoze tès yo te fonn nan DMSO, ak solisyon an te ajoute nan mwayen an (konsantrasyon final nan DMSO0.5 pousan).
3.6. Estatistik
Valè yo eksprime kòm mwayen ± SEM One-way analiz ofvariance (ANOVA) ki te swiv pa tès Dunnett te itilize pou analiz estatistik. Pwobabilite (p) valè mwens pase 0.05 te konsidere kòm siyifikatif.
Rekonesans
TM, KN, ak OM te sipòte pa yon sibvansyon an èd pou rechèch syantifik ki soti nan 'High-tech Research Center' Pwojè pou inivèsite prive: sibvansyon fon matche ak yon sibvansyon nan èd pou rechèch syantifik nan men Ministè Edikasyon, Kilti. , Espò, Syans ak Teknoloji (MEXT) nan Japon, 2007–2011 epi tou ki te sipòte pa yon Grant-in-Aid pou rechèch syantifik nan men MEXT. MYand HM te sipòte pa 21yèm Pwogram COE, Pwojè Fwontyè Akademik, ak yon Sibvansyon an Èd pou Rechèch Syantifik nan men MEX.
Soti nan: ' Acylatedfeniletanoidoligoglikozid ak aktivite hepatoprotective soti nan plant dezè aCistanche tubulosa'paToshio Morikawa et al
---Bioorganic & Medikal Chimi 18 (2010) 1882–1890.
