Dinamik transkripsyon alkòl espesifik nan rekonsolidasyon memwa ak rplonje Pati 4

Anplis Arc, nou te jwenn ke nivo mRNA nan Egr1, men pa Bdnf, yo te ogmante nan DH a ak mPFC pa rekiperasyon memwa alkòl.

Kòm tan ap pase, moun piti piti jwenn yon nouvo konpreyansyon sou mistè a nan bliye. Nan pwosesis sa a, yon nouvo teknoloji rekipere memwa te piti piti vin yon otspo rechèch.

Se konsa, èske gen yon relasyon ant rekipere memwa alkòl ak pèfòmans memwa? Vin gade kounye a! Premye a tout, nou bezwen klè: Rekipere memwa alkòl se pa yon teknoloji separe. Li se yon teknoloji ki afekte newòn nan sèvo atravè alkòl. Pwosesis sa a ka aktive kèk souvni "dòmi" nan sèvo a, ki pèmèt nou rafrechi souvni sa yo.

Dezyèmman, nou bezwen konnen ke amelyore memwa pa senpleman pèmèt nou "sonje" plis bagay, men se yon pwosesis pou rekipere ak rekonstwi memwa nan diferan fason. Pwosesis sa a ka ede nou pi byen konsolide ak konprann konesans nou te aprann yo, kidonk amelyore memwa nou an.

Se poutèt sa, nou ka konkli ke gen yon relasyon ant rekipere memwa alkòl ak pèfòmans memwa. Lè nou itilize teknoloji sa a pou re-ekstrè memwa anvan yo apre nou fin bwè alkòl, nou ap sibi yon pwosesis pou rekonsolide memwa sa yo, kidonk amelyore memwa nou nan yon sèten mezi.

Natirèlman, nou dwe sonje tou ke rekipere memwa alkòl se pa yon teknik ki dire lontan ak serye pou amelyore memwa. Si nou vle gen yon memwa ekselan pou yon tan long, nou bezwen kontinyèlman konsolide ak amelyore memwa nou atravè etid chak jou ak lavi, konbine avèk lòt teknik fòmasyon memwa.

Nan pwosesis sa a, nou bezwen kenbe yon atitid optimis tout tan, pi byen ankouraje motivasyon aprantisaj nou yo ak potansyèl memwa. Se poutèt sa, se pou nou fè fas ak fòmasyon memwa aktivman, dwe tèt nou san rete, epi avanse avèk kouraj sou wout la nan kontinyèlman amelyore memwa! Li ka wè ke nou bezwen amelyore memwa, ak Cistanche deserticola ka siyifikativman amelyore memwa, paske Cistanche deserticola kapab tou kontwole balans nan nerotransmeteur, tankou ogmante nivo yo nan asetilkolin ak faktè kwasans. Sibstans sa yo trè enpòtan pou memwa ak aprantisaj. Anplis de sa, Vyann kapab tou amelyore sikilasyon san ak ankouraje livrezon oksijèn, sa ki ka asire ke sèvo a resevwa ase eleman nitritif ak enèji, kidonk amelyore vitalite nan sèvo ak andirans.

Klike kounye a pou amelyore memwa a kout tèm

Ogmantasyon ekspresyon Egr1 mRNA te deja te enplike nan rekonsolidasyon souvni laperèz ak dwòg [19, 21, 48, 61], ogmante posiblite pou faktè transcription sa a tou jwe yon wòl nan rekonsolidasyon souvni alkòl.

Lè nou konsidere ke wòl Bdnf nan rekonsolidasyon memwa rete kontwovèsyal [19, 49], yo konnen endiksyon Bdnf enpòtan anpil pou akizisyon memwa ak aprantisaj disparisyon [19, 62]. Kidonk, mank chanjman nan ekspresyon Bdnf nan etid nou an ta ka sijere ke pwosedi rekiperasyon memwa nou an pa t kòmanse aprantisaj disparisyon an paralèl ak rekipere memwa.

Anplis, dènyèman nou te rapòte ke byenke nivo mRNA Bdnf nan DH a pa ogmante pa rekipere memwa alkòl poukont li, ekspresyon faktè kwasans lan te ogmante lè rekiperasyon an te swiv pa kontrekondisyone aversif ki te anpeche rplonje [44], sa ki sijere yon wòl konplèks nan Bdnf. nan dinamik memwa alkòl.

Konklizyon nou yo endike ke ogmantasyon yo nan ekspresyon IEG yo pa inik nan rekonsolidasyon nan memwa ki gen rapò ak alkòl.

Vreman vre, ARC ak EGR1 te deja enplike nan konsolidasyon plizyè kalite memwa, ki gen ladan fearmemories [19, 46, 47, 62], memwa rekonesans [21], ak memwa ki asosye ak diferan dwòg nan abi [20, 22, 61].

Sepandan, gen prèv k ap grandi tou ke kèk nan mekanis ki kache pou chèche alkòl ka diferan de sa yo ki kontwole k ap chèche rekonpans natirèl [5, 27, 28, 63]. Epitou, gen prèv ke memwa pou diferan rekonpans (ak pou diferan dwòg, an patikilye) yo trete diferan [29-32]. Konklizyon analiz RNAseq nou an tout bon revele siyati transcriptomic inik pwovoke pa rekipere memwa alkòl.

Espesyalman, yo te jwenn 44 jèn nan DH a ak yon seri diferan 9 jèn nan yo PFC, ki te montre chanjman enpòtan apre rekipere memwa alkòl. Apre plis validation done, nou konsantre sou yon jèn nan mPFC (Fkbp5) ak twa jèn nan DH (Adcy8, Scl8a3, ak Neto1) epi nou te jwenn ekspresyon yo pa te afekte pa rekipere souvni ki asosye ak sikwoz.

Sa a sijere ke, kontrèman ak Arc ak Egr1, 4 jèn espesifik sa yo gen anpil chans pa jwe wòl jeneral nan pwosesis la nan memwa rekonpans, men li ka pito jwe wòl selektif nan pwosesis la nan memwa alkòl.

Enteresan, kat jèn sa yo te deja enplike nan maladi itilizasyon alkòl ak aprantisaj ak memwa. Kidonk, Fkbp5 enkode Pwoteyin Obligatwa FK506 5, yon regilatè nan sistèm neuroendokrin estrès [64].

Variants FKBP5 modile gravite sendwòm retrè alkòl [65] epi predi tandans pou gwo bwè nan moun [66-68]. Yo te montre sipresyon Fkbp5 ogmante severite retrè alkòl [65] ak bwè alkòl [67] nan sourit, tandiske anpèchman famasi nan pwoteyin lan redwi konsomasyon alkòl modere, ak retabli CPP nan sourit [69] ak redwi bwè alkòl nan rat gason ki enpresyone [70].

Nivo Adcy8 mRNA, ki kode adenylatecyclase 8 (AC8) ki katalize fòmasyon cAMP an repons a aflu kalsyòm ak dènyèman make kòm yon regilatè posib konsomasyon alkòl [28, 71], yo te diminye nan selil san ki soti nan alkòl abstinan alontèm [72].

Deletion Adcy8 te deja montre diminye bwè alkòl ak ogmante sansiblite nan efè alkòl sa yo nan sourit [73]. Anplis de sa, ekspoze kwonik nan alkòl nan rat te kontwole ekspresyon nan sèvo nan fanmi solute carrier 8 (sodyòm / kalsyòm echanjeur), manm 3 (NCX3), theprotein kode pa Scl8a3 [74, 75].

Konsomasyon alkòl nan rat yo te asosye tou ak ekspresyon Neto1 nan sèvo redwi [76], ki kode neuropilin tolloid-like 1 (NRP1), yon eleman nan konplèks NMDA-reseptè [77].

Pwoteyin sa a patisipe nan reòganizasyon sinaptik ak transmisyon nan ipokanp la [78] epi li nesesè pou aprantisaj espasyal ak memwa [77].

Kidonk, rezilta nou yo montre ke jis rekipere memwa alkòl, menm san okenn efè famasi alkòl, afekte ekspresyon jèn sa yo. Sepandan, wòl espesifik yo nan rekonsolidasyon memwa alkòl ak rplonje rete yo dwe teste.

Yon limit nan etid prezan an se ke tès RNA-seq la te fèt sou tisi an gwo mPFC ak DH, olye ke sou selil endividyèl aktive pa rekipere memwa. Espesyalman, etid resan yo te sijere ke souvni an jeneral [79, 80], ak espesyalman souvni ki gen rapò ak alkòl [32, 81, 82], yo kode atravè aktivasyon nan ansanbl newòn ki konpoze de yon ti kantite newòn, ki ka idantifye atravè makè neuronalactivation. egzanp, cFOS) [80].

Vreman vre, modèl aktivasyon IEG (cFOS) menm jan an pa rekipere alkòl ak souvni rekonpans dous yo te jwenn nan rejyon mPFC ak lòt mesolimbik nan sèvo rat la [32, 81]. Kidonk, li posib ke fè tès RNA-seq la selektivman sou ansanbl neuronal aktive pa rekipere memwa ta bay rezilta pi egzak.

An rezime, rezilta nou yo sijere ke memwa alkòl rekipere de pwogram transkripsyon paralèl. Yon pwogram, transmèt atravè mekanis molekilè komen nan aprantisaj ak memwa, ki gen ladan IEG yo Arc ak Egr1, angaje nan konsolidasyon memwa, an jeneral.

Lòt pwogram transkripsyon an, ki te lanse pa rekipere memwa alkòl, se kontwole pa jèn ki espesyalman ankouraje konpòtman ki gen rapò ak alkòl. Modèl pwosesis doub sa a pou memwa alkòl ogmante posibilite ke rekonsolidasyon memwa pou memwa diferan ka gen menm mekanis molekilè pwosesis doub, ak kèk konpozan pataje pa memwa miltip, ak lòt inik nan chak kalite memwa.

Modèl ipotetik sa a rete yo dwe evalye bytesting si manipile jèn sa yo afekte rekonsolidasyon alkòl ak sikwoz memwa diferan. Si se konsa, li ta sigjere ke li ka posib pou vize sib espesifik molekilè rekonpans pou trete maladi ki gen rapò ak memwa patojèn, tankou dejwe, olye ke deranje gwo mekanis molekilè esansyèl pou anpil fonksyon pi lwen pase rekonsolidasyon memwa alkòl.

MATERYÈL AK METÒD

Gade Enfòmasyon Siplemantè pou plis detay sou aparèy la, dwòg ak reyaktif, konsepsyon ak preparasyon oligodeoxynucleotide (ODN), analiz Westernblot ak qRT-PCR, ak preparasyon bibliyotèk RNA-seq.

Bèt

Gason ak fi sourit C57BL/JRccHsd (25-30 g), ki te loje 3-4/kaj yo te elve nan Tel-Aviv University Animal Facility (pèp Izrayèl la), epi yo te kenbe anba yon sik limyè-fè nwa 12 h (limyè limen a 7 am), ak manje ak dlo ki disponib adlibitum.

Nan eksperyans ki enplike sikwoz kote-kondisyone, aksè a manje te restriksyon pou 6 èdtan anvan sesyon fòmasyon yo ranfòse motivasyon sourit yo nan kolekte granules sikwoz. Dire kout sa a nan privasyon manje baze sou konklizyon ki fè konnen nan lajounen, yon jèn 2-6 èdtan pa afekte konpòtman manje [83], epi li pa deklanche yon chanjman enpòtan nan makè enmetabolik [84], kidonk minimize efè restriksyon nan manje. .

Sourit yo te peze de fwa pa semèn pou kontwole pèdi pwa. Tout pwotokòl eksperimantal yo te apwouve epi yo te konfòme yo ak direktiv Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan Tel AvivUniversity, ak direktiv NIH (nimero asirans byennèt bèt A5010-01). Tout efò yo te fè pou minimize kantite bèt yo itilize.

Pwosedi konpòtman

Mete kondisyone

Alkòl-kondisyone preferans kote (CPP): Tout sourit yo te abitye nan chak jou piki ip saline pou 3 jou.

Tès debaz (jou 1): Nan premye jou a, pòt glisman an te retracte ak sourit yo te pèmèt yo eksplore tout aparèy la pou 30 minit. Kondisyone kote alkòl (jou 2-9): Fòmasyon te kòmanse 24 èdtan apre tès debaz la ak yon sesyon. administre pa jou sou 8 jou, ak pòt glisman fèmen. Nan jou 3, 5, 7, ak 9, sourit yo te resevwa alkòl (1.8 g / kg, 20% v / v; ip) epi yo te imedyatman fèmen nan lòj la pè pou 5 min.

Dòz sa a ak dire kondisyone yo te deja montre pou pwodui CPP alkòl pwovoke [42, 85]. Nan lòt jou yo (sa vle di, jou 2, 4, 6, ak 8), sourit yo te resevwa yon solisyon saline epi yo te fèmen nan lòj ki pa pè pou menm dire ak jou kondisyone alkòl la.

Lòj pè yo te kontrebalance. Mete tès preferans 1 (jou 10): Tès preferans kote yo te dekri pou tès debaz la, epi li te sèvi pou endèks alkòl-CPP [41]. Preferans te defini kòm yon ogmantasyon nan pousan nan tan ki pase nan konpatiman alkòl-pèch la pandan tès preferans plas 1, an konparezon ak tès debaz la.

Rekipere memwa (jou 11): Anvan etap sa a, sourit yo te asiyen nan diferan kondisyon eksperimantal (matche pou nòt CPP ak sèks). Pandan yon sesyon rekiperasyon memwa, sourit yo te fèmen nan konpatiman alkòl la pou 3 minit epi yo te retounen nan kalòj lakay yo. Kontwol yo te okipe yon ti tan.Plase tès preferans 2 (jou 12): Sourit yo te sibi yon tès plas preferans ki idantik ak tès preferans plas 1.

Sucrose CPP: Pre-fòmasyon sikwoz (jou 1-6): Nan jou 1-3, sourit yo te abitye kolekte 5-6 granules sikwoz (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) nan kaj kay. . Nan jou 4-6, sourit yo te fòme pou kolekte 3 granules nan yon bwat plèksiglas vid pandan 30-minit sesyon yo. Sourit ki te kolekte mwens pase sis granules (soti nan yon total de ninpellets pandan 3 jou yo) pandan fòmasyon sikwoz yo te eskli nan eksperyans la (2 sourit sou 32).

Tès debaz (jou 7): Sou setyèm jou a, pòt glisman an nan yon chanm CPP te retracte ak sourit yo te pèmèt yo eksplore tout aparèy la pou 30 minit. Yon aparèy san patipri/apwòch plasman san patipri, jan sa dekri nan pwosedi alkòl-CPP, te tou adopte isit la.Sucrose kote-kondisyone (jou 8-15): Fòmasyon te kòmanse 24 èdtan apre tès debaz la ak yon sesyon pa jou sou 8 jou, ak glisman an. pòt fèmen. Nan jou 9, 11, 13, ak 15, sourit yo te mete nan konpatiman pè a, epi yon minit apre, twa granules sikwoz yo te gaye sou planche a.
Sourit yo te retounen nan kaj lakay yo 15 minit pita. Nan lòt jou yo (sa vle di, jou 8, 10, 12, ak 14), yo te mete sourit yo nan lòj ki pa pè pou 15 minit san entèferans.

Konpartiman pè yo te counterbalanced.Mete tès preferans 1 (jou 16): Tès preferans kote yo te jan sa dekri pou tès debaz la, epi li te sèvi pou endèks sikwoz-CPP. Preferans te defini kòm yon ogmantasyon nan pousantaj tan ki pase nan konpatiman sikwoz-pèch la pandan tès preferans plas 1 a, an konparezon ak tès debaz la. ).

Validasyon Oligodeoxynucleotide (ODN).

Arc antisense ODN (AS-ODN) ak scrambled ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Izrayèl) te swiv direktiv ki te dekri anvan [56, 86].

Arc AS-ODN validation fonksyonèl. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0.5 µl, 0.25 µl/min) te enfuze nan DH a nan yon sèl emisfè, ak SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}}.5 µl, 0.25 µl/min) te enfuze nan lòt emisfè a (sides yo te balanse). De oswa kat èdtan pita, sourit trete yo eksplore yon kontèks abitye (lòj CPP, gade deskripsyon Aparèy, pi wo a) pou 5 minit pou pwovoke ekspresyon ARC ki depann de nouvote. Sourit yo te retabli yon èdtan apre (sa vle di, 3 oswa 5 èdtan apre perfusion ODN), tisi nan sèvo yo te kolekte, ak nivo pwoteyin ARC yo te evalye pa Western blotanalysis (Figi S4).

Operasyon ak microinfusion intra-ipokanp. Operasyon ak microinfusions te fèt jan sa dekri deja [42, 87].

Operasyon. Operasyon estereotaksik yo te fèt anba anestezi izofluran. Yo te mete sourit yo nan yon ankadreman estereyotaksik (RWD Life Science, Shenzhen, Lachin), ak kanul gid bilateral (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) te vize DH a nan kowòdone sa yo (-2mm dèyè bregma, ±1.3 mm mediolateral, -1.45 mm ventral sifas zo bwa tèt la). Kanul yo te sekirize ak Acrylic dantè. Matching dummycannulae (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) yo te antre nan guidecannulae yo ak antèt ak tas pousyè tè kenbe sit la enjekte kouvri ak klè nan debri. Sourit yo te pèmèt yo refè pou 7-10 d anvan fòmasyon alkòl-CPP.

Perfusion intra-ipokanp. Aktinomycin D (4 µg/µl, 0.5 µl pou chak bò, 0.25 µl/min, nan DMSO) [19] oswa yon volim ekivalan nan machin yo te mikwo-enjekte nan DH imedyatman apre rekipere memwa. . Yo te montre perfusion aktinomisin D nan ipokanp la nan yon konsantrasyon menm jan an pou deranje rekonsolidasyon memwa [19]. Arc AS-ODN oswa kontwòl SCR-ODN (2nmol/µl, 0.5 µl/bò, 0.25 µl/min; nan PBS) te microinjected nan DH 4 or 2 h anvan oswa 4 h apre rekipere memwa.

Apre yo fin retire gode pousyè tè a ak kanul enbesil yo, yo te fè mikwo-enfizyon sou 2 minit pou sourit ki rete an reveye, lè l sèvi avèk kanul piki (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) ki pwolonje 0.5 mm pi lwen pase gid la. pwent kanul. Yo te kite kanul piki an plas pou yon lòt 2 min. Apre perfusion, yo te mete kanul egare yo nan kanul gid yo, yo te garanti ak gode pousyè tè a, epi bèt yo te retounen nan kaj lakay yo. Yo te verifye lokalizasyon kanul yo nan seksyon koronèl 30 μm epè nan tisi paraformaldeyid ki fikse tache ak kresyl vyolèt.

Analiz done

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75% nan tan an nan youn nan konpatiman yo pandan tès la Baseline yo te eskli nan etid la (9 soti nan 267). Etablisman CPP te konfime lè yo konpare nòt CPP ant tès debaz ak CPP 1 epi yo te analize pa yon tès t pè. Depi ekspresyon CPP (sa vle di, fòmasyon memwa) obligatwa pou rekipere memwa, done ki soti nan sourit ki pa t montre CPP (yon minimòm 5% ogmantasyon nan preferans ant debaz ak Tès 1) yo te eskli nan eksperyans la (48 sou 258).

Alkòl-CPP apre entèferans ak rekonsolidasyon memwa te analize pa yon modèl ANOVA melanje ak yon faktè ant-sijè nan Tretman (Actinomycin D oswa ODN) ak yon faktè nan-sijè nan Tès (CPP tès 1, CPP tès 2). Yon tès post hoc Student-Newman-Keuls te analize entèraksyon enpòtan yo. Dansite yo nan nivo Western blotimmunoreactive ARC pwoteyin yo te nòmalize nan GAPDH sa yo ak analize pa yon ANOVA yon sèl-fason ak yon faktè ant-sijè nan Tretman, ki te swiv pa tès post hoc Dunnett la. Done ekspresyon qRT-PCR mRNA yo te nòmalize nan Gapdh epi yo te eksprime kòm yon pousantaj ekspresyon nan yon gwoup kontwòl.

Done ki soti nan tout jèn pou chak rejyon nan sèvo yo te analize pa yon ANOVA yon sèl-fason ak yon faktè ant-sijè nan Tretman, ki te swiv pa tès Dunnett a pou chak jèn, pou konparezon ak done yo jwenn nan yon gwoup kontwòl (Pa gen Retrieval). Pou RNA-seq, nou rasanble tisi ki soti nan 3 bèt pou chak replike epi prepare kantite replike sa yo: 3 pou ipokanp dorsal (DH)-pa gen okenn rekiperasyon, 2 pou DH-rekipere, 3 pou cortical prefrontal (PFC)-pa gen okenn rekipere, ak 2 pou ( PFC)-rekiperasyon. Apre izolasyon total RNA ak Trizol, bibliyotèk sekans yo te pwodwi lè l sèvi avèk metòd nou devlope [88].

Bibliyotèk yo te sibi 50 bp yon sèl-fen sekans ak IlluminaHiseq 2000. Apre konfime bon jan kalite a nan done sekans pa FastQC, lekti yo te trase nan jenom referans mm9 lè l sèvi avèk Bowtie2 [89] ak anote ak Tophat2 [90].

Lekti ki te trase nan jèn yo te quantifye pa FeatureCounts [91]. Nou eskli Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a, ak kwomozòm temitokondriyo pou evite konte jèn ki twò anplifye ki ta ka twonpe nòmalizasyon bibliyotèk jan yo dekri anvan [92]. Yo te itilize DESeq2 [58] pou idantifye jèn ki eksprime diferan (DEG) nan Retrievalgroup la, konpare ak gwoup kontwòl Pa gen Retrieval, ak yon valè p-ajiste nan siyifikatif koupe (p(adj) < 0.05).

DONE DISPONIBILITÉ Done RNA-seq yo disponib nan NCBI Gene Expression Omnibus nan https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) ak yon token revizatè:knyfwwiorbutvuv.

REFERANS

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, Mas D, Insel TR, Daar AS, et al. Gwo defi sante mantal mondyal. Lanati. 2011;475:27–30.

2. Heilig M, Egli M. Tretman farmakolojik nan depandans alkòl: sentòm sib ak mekanis sib. Pharmacol Therap. 2006;111:855–76.

3. Sinha R. Nouvo konklizyon sou faktè byolojik ki predi vilnerabilite rplonje dejwe. Curr Sikyatri Rep 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Reyaktivite nan stimuli ki gen rapò ak alkòl nan laboratwa a ak nan jaden an: prediktè nan anvi nan alkòl trete. Dejwe.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, et al. Dezòd souvni ki gen rapò ak alkòl pa anpèchman mTORC1 anpeche rplonje. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Bwè, dwòg, ak dezòd: manipilasyon memwa pou tretman dejwe. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. Yon sèl estanda pou memwa: ka a pou rekonsolidasyon. NatRev Neurosci. 2009;10:224–34.

8. Dudai Y. Rekonsolidasyon: avantaj pou yo te rekonsantre. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Rekonsolidasyon memwa apre reaktivasyon li yo. Behav.Brain Res. 1997;84:241–6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Souvni laperèz mande pou sentèz pwoteyin nan theamygdala pou rekonsolidasyon apre rekipere. Lanati. 2000;406:722–6.

For more information:1950477648nn@gmail.com