Yon ekstrè nan kilti selil Oenothera Biennis ki gen yon aktivite anti-aje po amelyore pwopriyete mekanik selilè yo.

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:Po aje se yon pwosesis trè byen koni mete yon tikal vin pi grav nan karakteristik mekanik po akòz yon bès nan pwodiksyon an nan machin nan matris siplemantè-selilè ak yon chanjman konkouran nan pwosesis la kontraksyon. Pou ralanti pwogresyon sa a, li enpòtan pou pwovoke ekspresyon plizyè pwoteyin ki kapab ankouraje fòmasyon fib elastik ak reparasyon tisi. Isit la, Oenothera bi-Ennis selil kilti kilti akeuz ekstrè a te envestige nan yon pwen de vi chimik, ak Lè sa a, li te teste nan vitro, nan selil la, ak nan eksperyans ansyen vivo kòm yon adjuvant nan debat aje po An konsekans, li te montre ke ekstrè Oenothera biennis la te kapab, lè yo ogmante ekspresyon jèn MYLK, ankouraje kontraksyon kolagen an matris, polymerization aktin, ak pwodiksyon pwoteyin ECM esansyèl.

Mo kle:metabolomik; rezo molekilè; ekstrè idrofil nan kilti selil Oenothera biennis; matris kontraksyon kolagen an; aje po

1. Entwodiksyon

Po aje se yon pwosesis trè byen koni pwovoke pa faktè andojèn ak ekzojèn. Pandan senesans, tout fonksyon fizyolojik kutane yo dejenere inexorableman, ak deteryorasyon pwogresif sa a domaje po a [1]. Vreman vre, po a piti piti gout karakteristik mekanik li yo, akòz tou de yon bès nan pwodiksyon an nan pwoteyin matris siplemantè-selilè ak chanjman nan konkouran nan pwosesis la kontraksyon [2]. Konpozan matris ekstra-selilè dèrm ki pi enpòtan yo se pwoteyin tankou kolagen I ak IIl, laminin, periostin, tenascin, elastin, fibronectin, ak proteoglycans, paske kantite relatif yo ak eta plisman jwe yon wòl kle nan entèraksyon ant selil yo ak selil yo. matris, garanti teksti apwopriye nan dèrm la [3]. Pou egzanp, nan espas ekstraselilè a, fibronectin jwe yon wòl kle nan asanble matris kòm li fòme yon pon ant reseptè sifas selil yo (egzanp, entegrin) ak kolagen an, proteoglikan, ak lòt molekil adezyon fokal. Laminin kontribye nan estrikti a nan matris la ekstraselilè ak modile adezyon, diferansyasyon, migrasyon, estabilite nan fenotip, ak rezistans nan direksyon pou apoptoz. Elastin enpòtan tou pou adezyon selilè ak migrasyon selilè, epi li gen kapasite pou patisipe nan siyal selil yo. Fibrilins menm jan an kominike byen ak tropoelastin ak integrins, epi yo enpòtan pou asanble elastins nan fib elastik. Fabulous se byen konekte ak manbràn sousòl, fib elastik, ak lòt konpozan nan matris la ekstraselilè, epi patisipe nan fòmasyon fib elastik. Tenascins yo se glikoprotein polimòfik matris ekstraselilè (ECM) ki medyatè pwosesis fibrotik pou pèmèt reparasyon efikas tisi [4]Anplis de sa, pwosesis kontraksyon po a baze tou sou aksyon fibroblast, selil ki pi abondan nan matris la po; yo mete tansyon an apwopriye nan po a, ankouraje kontak ki genyen ant konpozan matris yo, ki an vire responsab pou konpakte dèrm, dansite, ak rezistans. Nan baz òganizasyon cytoskeleton selilè yo, gen machin aktin-myosin, ki detèmine chanjman potansyèl nan fòm yo ak nan estrikti yo. Vreman vre, obligatwa nan aktin ak myosin pwovoke yon konfòmasyon selilè ki pi kontra enfòmèl ant, pote fib yo pi pre ansanm, garanti devlopman nan tisi ki an sante ak kontra enfòmèl ant, ak anpeche dezentegrasyon fib sa ki lakòz ondilasyon. Sepandan, kapasite fibroblast pou kontra ak detire pasyèlman pèdi sou ane paske selil yo ki gen laj yo pa kapab aji kòrèkteman ak konplètman. Akòz yon fòs mekanik ki pi ba, fibroblast yo ale nan yon mòfoloji ki pi awondi ak defòme pase yon mòfoloji ki long [5]. Gen kèk prèv ki endike ke, pandan aje, sentèz la nan yon pwoteyin ki rele MYLK (Myosin Light Chain Kinase) diminye anpil. MYLK posede yon aktivite kinaz egzèse pa fosforilasyon yon domèn espesifik myosin, yo rele chèn limyè regilasyon myosin, ki kapab pwovoke aktin-obligatwa epi kidonk ankouraje kontraktilite selil [6].bioflavonoidLè yo te detekte yon aktivite ki ba nan pwoteyin sa a, akòz, pou egzanp, yon ekspresyon pwoteyin mwens, yo te mezire yon rediksyon korespondan nan kontraksyon kolagen an matris [7] ak polimerizasyon aktin [8]. Asanble cytoskeleton Actin lye non sèlman nan mouvman selilè ak kapasite nan kontra, men tou ak pwodiksyon an nan pwoteyin matris ECM atravè aktivasyon an nan reseptè TGF-II (TGFBRII) [9]. TGFBRII fè pati TGF-sèlil sifas reseptè konplèks ki, atravè aktivasyon faktè transkripsyon Smad, kontwole ekspresyon anpil jèn ki kode eleman ECM, ki gen ladan kolagen an, laminin, fibronectin, ak proteoglikan [10]. Actin demonte cytoskeleton downregulates reseptè a TGF -Il. Sa a desann-règleman, nan vire, diminye pwodiksyon an nan kolagen an ak lòt pwoteyin ECM, sa ki lakòz yon pèt nan mas po ak frajilite po.

Aktyèlman, anpil engredyan kosmetik vize nan estimile sentèz la nan plizyè faktè kle ki responsab pou kenbe konpak kòrèk la nan matris la po ak yon kontraksyon po bon. Nan senaryo sa a, ekstrè ki sòti nan espès Oenothera biennis (Evening Primrose), ki fè pati fanmi Onagraceae yo, gen yon gwo enterè akòz kontni yo nan konpoze bioaktif tankou asid gra, fenol, triterpèn, ak flavonoid, ki te deja. teste nan tretman divès maladi po patolojik [11]. Gen kèk nan metabolit sa yo, nan vire, yo rapòte siprime medyatè enflamasyon tankou interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL{-6), sitokin, ak faktè nekwoz timè (TNF-) [12]. ]. Anplis, ekstrè nan pati ayeryen Oenothera biennis pwoteje selil HaCaT kont domaj ADN H, O,-pwovoke ak lanmò selil lè yo bloke domaj selilè akòz estrès oksidatif atravè yon mekanis ki enplike eliminasyon ROS ak chemen siyal Nrf2/HO-1. 13]. Anplis de sa, lwil oliv Oenothera biennis, ki se moun rich nan lipid, yo te pwopoze kòm yon bon idratan pou pasyan ègzema gras a kapasite li fasil antre nan po a [14]. Malerezman, preparasyon ekstrè nan plant kiltive, angaje nan pwodui kosmetik, ka gen ladan kèk dezavantaj: premye, yo ka kontamine pa sibstans toksik oswa alèjik tankou pestisid, angrè, oswa polyan; Lè sa a, plant yo sijè a estrès enprevizib ak kondisyon sezon oswa varyasyon nan disponiblite eleman nitritif, ki ka pwovoke sentèz la nan metabolit inatandi. Anplis de sa, ekstrè yo ka gen ladan mikwo-òganis patojèn, ki diminye bon jan kalite a nan pwodwi final yo. Tout dezavantaj sa yo, nan vire, konvèje nan risk pou yo gen yon kontni varyab nan metabolit segondè ak repwodibilite ki ba. Pou simonte feblès sa yo, itilizasyon kilti selil plant yo nan pwodui kosmetik ap vin pi popilè ak anpil apresye, paske li genyen batay la anpil nan dezavantaj yo mansyone pi wo a [15].

Tanpri klike la a pou w konnen plis

Nan etid sa a, yon ekstrè idrofil nan kilti selil Oenothera biennis (ObHEx) te konplètman karakterize pa apwòch avanse ki baze sou espektwometrik mas, ede pa byoenfòmatik, ak teste nan plizyè analiz byochimik ak byolojik. Melanj lan gen konpoze byoaktif sitou lignan ak triterpenes, tankou asid arjunolik ak azitik, ki te deja asosye ak pwodiksyon pro-kolagen I nan fibroblast imen [16,17]. Ekstrè a te envestige pou kapasite li pou ogmante ekspresyon MYLK, ankouraje kontraksyon kolagen an matris, polymérisation aktin, ak pwodiksyon pwoteyin ECM TGF-reglemante, ki favorize kontraksyon dèrm la, kidonk ralanti aje po a.

2. Rezilta yo

2.1.Analiz Kalitatif ak Kantitatif nan ekstrè nan dlo-soluble nan kilti selil Oenothera Biennis

Yo te fè analiz UPLC-MS/MS ObHEx epi yo te eksplwate done espektwometrik wo rezolisyon pou karakterizasyon chimik yo lè l sèvi avèk Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), yon sistèm espektometri mas ki baze sou entènèt ki ede nan idantifikasyon ak anotasyon pwodwi natirèl yo. (NPS)[18]. Li gen pou objaktif pou yon baz konesans aksè ouvè pou òganizasyon nan tout kominote a ak pou pataje done espektrometri mas fragmantasyon anvan tout koreksyon, trete oswa anote (MS/MS). Espesyalman, rechèch bibliyotèk espektal GNPS ak yon travay rezo molekilè ki baze sou karakteristik (FBMN) yo te fèt: premye analiz la te pèmèt nou idantifye konpoze natirèl yo, konpare spèkt MS/MS yo ak sa yo ki nan metabolit ki karakterize estriktirèl, dezyèm lan nan gwoup ki gen rapò ak gwoup. NPs nan yon rezo depi menm jan MS / MS fragmantasyon modèl yo te ekspoze pa molekil estriktirèl menm jan [19]. Jan yo montre nan Figi 1 ak Tablo 1, anpil NPS yo te san dout idantifye kòm ki fè pati plizyè klas metabolit segondè, sitou lignans (Salvador sou kote ak liriodendron) ak triterpenes (asid muryatik, asid aurinolik, asid Azyatik, ak hederagenin). Espès chimik ki pa idantifye pa GNPS yo te asiyen kòmsadwa nan literati a.

Kòm yon egzanp itilizasyon GNPS, rezo ki sòti nan analiz FBMN yo te rapòte nan Figi 2a, ki montre ke ObHEx te genyen anpil lòt triterpenes ki pa karakterize ki gen rapò ak asid muriatik (18, m/z 503.3389, RT 21.89 min: idantifikasyon asid muriatik gen). te konfime atravè yon konparezon ak estanda analyse li yo). Pou egzanp, divès espès ki te deja pa karakterize nan m/z 701 ak 665 yo te idantifye kòm fòm glikozile ki gen rapò ak asid muriatik oswa izomè li yo, respektivman idrate oswa pa avèk de molekil HO.

Anplis de sa, rapòte iyon nan m/z 729, 703, 699,687,685, 683 ki sòti respektivman nan glikozilasyon an plis de molekil H, O nan espès nan m/z531, 505,501, 489,487, ak 485: men yo pa te reyalize idantifikasyon univocal, yo tout yo sipoze triterpèn, yo te gen rapò ak asid muriatik oswa konjèn li yo, akòz chemen fragmantasyon MSMS yo. yo te elisid sou baz done espektroskopik, kidonk byen korelasyon ak rezilta nou yo [20].

Cistanche ka anti-aje

Analiz FBMN tou te bay enfòmasyon sou metabolit yo nan m/z 617.3862 (MS2 iyon nan m/z 453,145 ak 119) prezan nan rezo molekilè yo montre nan Figi 2b epi yo pa rapòte nan literati a pou espès Oenothera. Valè m/z sa a ak fwagmantasyon li yo matche ak 2-OEp-coumaroyl asid apostolik oswa izomè li yo, ki pwouve, omwen, prezans nan triterpene coumaroyl ak tou ester kafeyil nan ekstrè a. Vreman vre, MS- spectre nan espès nan m / z 649 (RT 25.72 ak 27.19) te montre prezans nan iyon nan m / z 179, 161, ak 135 akòz klivaj la nan asid kafeyik mwatye, tandiske MS2 espèk yo nan lòt espès yo. rapòte nan Figi 2b nan m/z 633 (RT 26.88,27.20,28.12 ak 28.43), 649 (RT24.18,24.65,24.83), ak 661 (RT 30.28) te montre iyon nan m/z 145, ki te karakteristik 119. pou mwatye cumaroyl.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911)nan ranje yo teste yo. Anplis, limit deteksyon (LOD) ak limit quantification (LOO) endike ke metòd yo itilize yo te distenge pa gwo sansiblite. Rezilta yo te jwenn nan analiz quantitative a (Tablo 3) te montre ke liriodendron ak hederagenin te reprezante prensipal lignan ak triterpene, respektivman.

2.3.Analiz ekspresyon jen MYLK nan HDF

Aktivite ObHEx te teste nan HDF sou ekspresyon jèn MYLK, ki kode pou kinaz ki responsab fosforilasyon chèn limyè myosin (Figi 3a). Rezilta yo endike ke tretman an ak ekstrè nan tou de konsantrasyon ogmante ekspresyon jèn MYLK pa apeprè 50 pousan, menm jan ak kontwòl pozitif TGF-.

2.4. Analiz kapasite kontraksyon yon matris kolagen an

Pou evalye aktivite ObHEx sou kapasite kontraksyon fib kolagen an, nou te itilize HDF ki gaye nan disk jèl kolagen an [21]. Jan yo montre nan Figi 3b, ekstrè a, nan konsantrasyon ki pi ba a, pwovoke yon ogmantasyon siyifikatif nan kontraksyon disk kolagen an, sijere yon efè potansyèl sou determinasyon kolagen an. Tretman ak ML7(1-(5-yodonaftalèn-1-sulfonyl)-1H-hexahydro-1,4-diazepine), yon inibitè MYLK, aboli ogmantasyon sa a, ki endike ke tou de ekstrè a ak TGF- aji nan MYLK pou kontraksyon disk kolagen an.

2.5.Mezi nan Nivo Polymerization Actin

Kapasite ObHEx pou ankouraje polymérisation actin te envestige pa mezire nivo polymerized actin nan selil yo, trete ak ekstrè a ak kontwòl pozitif TGF-, pou kont li ak nan prezans ML7. Jan yo montre nan Figi 3c, tretman an ak tou de konsantrasyon ekstrè yo bay yon ogmantasyon nan kantite aktin polymère pa apeprè 50 pousan, konpare ak 33 pousan nan TGF-.achte cistancheYon fwa ankò, pre-enkubasyon an ak ML7com-konplètman aboli efè sa a, sijere patisipasyon nan MYLK nan polymerisation nan filaman aktin.

2.6. Analiz de TGF RII/SMAD Pathway nan HDF

Pou verifye si ogmantasyon nan polymérisation aktin ak kontraksyon kolagen an nan selil trete ak ObHEx te asosye tou ak aktivasyon nan chemen transduction siyal medyatè pa TGF RII, nou te premye obsève ekspresyon jèn TGF RII la ak Lè sa a, transfekte HDF ak SMAD{{ 0}}plasmid repòtè luciferase ak evalye ogmantasyon nan aktivite luciferase an repons a tretman ObHEx. Rezilta yo, rapòte nan Figi 3d,e, te endike ke tretman an ak ObHEx nan 0.002 pousan ak 0.006 pousan ogmante ekspresyon TGF RII nan yon fason ki sanble ak TGF- yo itilize kòm kontwòl pozitif epi, paralèlman, aktivite luciferase ki lye ak SMAD te ogmante pa 80 ak 40 pousan, respektivman. Yo te jwenn yon rediksyon siyal enpòtan lè selil yo te trete ak ML7, ki montre tou ke aktivite sa a te lye ak MYLK.

2.7.Analiz Pro-Collagen I, Tropoelastin, ak Periostin

Kòm yon konsekans aktivasyon transdiksyon siyal TGF RII, nou analize sentèz prensipal pwoteyin matris ekstraselilè tankou procollagen tip I, tropoelastin, ak peryostin nan HDF trete ak ObHEx nan 0.002 pousan. Jan yo montre nan Figi 3f, ObHEx ogmante pwodiksyon pwoteyin ki endike yo pa apeprè 98 pousan, 75 pousan, ak 51 pousan, respektivman, menm jan ak kontwòl pozitif TGF-. Mezi yo te fèt pa tès ELISA, lè l sèvi avèk antikò espesifik kont pro-kolagen I, tropoelastin, ak peryostin.

2.8.Analiz MYLK, Phospho-Myosin, Kolagen I, ak Tropoelastin sou Eksplantasyon Po Ex-Vivo

Jan yo montre nan Figi 4a-c, ObHEx te pwodui yon ogmantasyon siyifikatif nan pwodiksyon MYLK ak fosforil myosin nan eksplant po moun.

Kolagen I ak endiksyon tropoelastin yo te analize tou nan èksplan po ki te pretrete ak ObHEx ak Lè sa a, trete ak idrokortizon pou 8 jou pou simulation kwonolojik aje [22]. Tretman an ak idrokortizon redwi kantite kolagen I ak tropoelastin pa plis pase 100 pousan, ak prezans 0.002 pousan ObHEx retabli kantite tropoelastin pa prèske 91 pousan ak kolagen an pa 120 pousan, konpare ak la. ascorbate itilize kòm yon kontwòl pozitif (Figi 4d-f). Sa a sijere yon efè potansyèl anti-aje ObHEx, patikilyèman efikas nan ogmante determinasyon nan po a pa aji sou eleman yo matris po.

2.9.Mikwoskopi fòs atomik (AFM) nan eksplantasyon po

Yo nan lòd yo kolekte plis enfòmasyon sou pwopriyete yo byomekanik po ankouraje pa tretman an ak ObHEx, nou evalye elastisite, yon pwopriyete mekanik intrinsèques nan echantiyon po an tèm de modil Young yo [23]. Jan sa dekri nan Seksyon 4, pou kalkile modil elastik la, tou de sou echantiyon po trete ak po ki pa trete, nou kolekte koub Fòs ak yon mikwoskòp fòs atomik (AFM) epi adapte yo ak modèl Hertz [24,25]. Jan yo montre nan Figi 5, tretman an nan echantiyon po yo ak ekstrè a te gen pi ba valè modil Young konpare ak echantiyon ki pa trete, sijere yon amelyorasyon nan pwopriyete elastik po. An patikilye, echantiyon po ki pa trete yo te divilge yon valè modil Young vle di 0.37±0.15 GPa, pandan ke echantiyon po yo te trete ak ObHEx te montre yon valè mwayèn ki pi ba 0.{{11 }}7±0.02 GPA. Valè modil Young nan echantiyon po yo te an akò ak literati [26-28].

3. Diskisyon

Kilti selil plant yo konstitye apwòch ki pi pwomèt pou pwodiksyon dirab nan metabolit segondè plant nan enterè komèsyal, ofri yon rezèv kontinyèl nan materyèl pa mwayen kilti gwo echèl ak konstitye yon sistèm dirab ak ekolojik-zanmi [29,30]. Ekstrè ki soti nan kilti selil plant yo te jwenn aplikasyon pwomèt nan swen sante ak sektè kosmetik, paske yo prezante kèk avantaj enpòtan; (i) yo genyen metabolit bio-sentèz nan kondisyon laboratwa kwasans kontwole; (i) yo sòti nan pwosesis pwodiksyon estanda, garanti a. menm karakteristik kalitatif ak quantitative espès yo jwenn yo;(ii) ekstrè yo pa gen kontaminan tankou mikwo-òganis, èbisid, pestisid, ak fonjisid;(iv) yo endepandan de fluctuations jeyografik oswa anviwònman an epi yo ka konsève espès plant yo pou lavni. jenerasyon. Nan konkou sa a, yo te egzamine yon ekstrè akeuz kilti selil Oenothera biennis (ObHEx) kòm yon sous pwomèt nan molekil byoaktif doue ak aktivite anti-aje po. Vreman vre, ObHEx te envestige pa gwo rezolisyon UPLC-MSMS analiz makonnen ak apwòch byoenfòmatik reyalize yon karakterizasyon estriktirèl lajè. Karakterizasyon konpoze yo te reyalize sitou lè l sèvi avèk GNPS pou akselere pwosesis idantifikasyon an, konpare spectre MS/MS yo ak sa yo ki nan metabolit karakterize estriktirèl, epi, Anplis de sa, divilge nouvo espès inatandi, gwoupman NP ki sanble nan yon rezo. Anplis, tan retansyon, mezi egzat mas, ak analiz MS2 yo te konpare tou ak sa yo ki nan estanda, ak tout done yo te matche ak literati a. Bioaktif lignans ak triterpenes, tankou Salvador sou kote, liriodendron, my-anthemic asid, asid arjunolic, asid azi, ak hederagenin yo te idantifye. Liriodendron [31] ak asid muriatik [32] te montre gwo aktivite antioksidan, pandan y ap hederagenin te montre pwopriyete anti-aje po akòz yon rediksyon nan oksidasyon selilè ak aktivasyon an nan fonksyon proteazòm [33]. Sepandan, asid arjunolik ak asid yo te konsidere kòm responsab prensipalman pou kèk nan aktivite tès sa yo, depi yo ankouraje sentèz kolagen an. Vreman vre, li te demontre ke ObHEx amelyore pwopriyete yo byomekanik po, ki sitou depann sou kantite relatif nan diferan eleman nan ECM a ak sou ki jan fibroblast yo kapab kontra ak bay tansyon an dwa nan fib po yo.sistanchAn reyalite, ObHEx fè pwomosyon kontraksyon matris kolagen an ak polimerizasyon aktin nan ogmante ekspresyon jèn MYLK la, amelyore fòs kontraksyon fibroblasts po yo. Asanble cytoskeleton aktin ogmante reseptè TGF-tip II epi, ki konsistan avèk eksitasyon siyal TGF-/Smad, ogmante nivo pwoteyin ECM ki reglemante TGF-. Vreman vre, ObHEx pwovoke pwodiksyon kolagen tip I, peryostin, ak tropoelastin. Se poutèt sa, tout pwopriyete sa yo fè li yon bon engredyan kandida pwomèt yo dwe itilize nan fòmilasyon kosmetik pou konbat pèt laj ki asosye nan determinasyon po ak elastisite. Sipozisyon sa a te sipòte pa rezilta yo te jwenn nan analiz AFM, ki te montre ke tretman an nan tranch po ak ObHEx te pwodwi yon amelyorasyon nan pwopriyete yo mekanik po, detekte kòm yon diminisyon nan modil Young a, ki endike yon rediksyon enpòtan nan rèd po ak frigidité.

4. Materyèl ak Metòd

4.1.Plant Tisi Kilti ak Preparasyon Ekstrè

Plant Oenothera biennis te bay pa GEEL Floricultura ss epi yo te nan orijin Italyen (evite aplikasyon an nan pwotokòl Nagoya). Kilti selilè yo te jwenn nan fèy nan plant Oenothera biennis lè yo pwovoke pwopagasyon selil meristematik sou plak agar solid jiskaske yo jwenn calluses. Selil yo te transfere nan mwayen kwasans likid la (Gamborg B5, complétée ak 24 asid dichlorophenoxyacetic (1 mg / L), adenine (1 mg / L), ak kinetin (0.01 mg / L)). , selil yo te grandi kòm kilti sispansyon anba souke òbital. Yon fwa kilti yo nan apeprè 150 g / L yo te jwenn, selil yo te kolekte epi lysed nan yon tanpon fosfat (PBS) nan pH 7.4 pou prepare yon ekstrè idrosolubl, ki te lyofilize. Poud lan te fonn nan dlo oswa nan medya selilè nan konsantrasyon apwopriye pou tès la.

4.2. UPLC-MSMS analiz pou karakterizasyon chimik

ObHEx(5{{10}} mg/mL) te prepare epi soumèt nan yon butanol/dlo ekstraksyon bifaz. Fraksyon butanol la seche epi li fonn nan metanol (10mg/mL) anvan analiz UPLC-MS/MS. Li te fèt sou yon Q-Exactive Classic Mass Spectrometer ki soti nan Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA) ekipe ak yon sistèm Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC. Tout kous kwomatografik yo te fèt lè l sèvi avèk yon kolòn Phenomenex Luna③C18 100 A （150 × 2.0 mm, gwosè patikil 3 μm） nan 40 degre C ak yon pousantaj koule nan 0.200 mL / min. Volim piki a te 5 μL. Faz mobil la se A (dlo ki soti nan ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK a nan 0.1 pousan asid acetic) ak B (100 pousan acetonitrile soti nan ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) lè l sèvi avèk yon elisyon gradyan. de5 pousan B nan 0-5min,5-14 pousan B nan5-8 min,14-32 pousan B nan 8-11 min, 32-95 pousan Bat {{ 26}}min,95-98 pousan Bat32-33 min, 98 pousan B nan 33-38min,98-5 pousan Bat38-39 min, ak 5 pousan B nan {{ {34}} min. Tout MS ak MSMS analiz yo te pote soti nan mòd ESI negatif ak pousantaj koule gaz djenn nan 30 (inite abitrè), to a koule gaz oksilyè nan 5 (inite abitrè), vòltaj la espre nan 3.2 kV, ak tanperati a kapilè ak tanperati aparèy chofaj gaz oksilyè a 300 degre. Done yo te akeri ak yon mòd Full MS/dd-MS2 (Top5). Full MS paramèt yo te: rezolisyon an nan 70.000, sib AGC nan 1 × 106, maksimòm IT nan 200ms, epi yo ka varye ant 100to 800 m / z.dd-MS2 anviwònman yo te: rezolisyon nan 17.500, sib AGC nan 2 × 105, maksimòm IT nan 65 ms, fenèt izolasyon nan 1.5 m/z ak NCE nan 35.

yo te jwenn yo te verifye manyèlman. Done mzXML yo te trete lè l sèvi avèk Mzmine 2.53 anvan travay la Rezo molekilè ki baze sou karakteristik (FBMN) sou GNPS. Etap deteksyon mas la te fèt lè l sèvi avèk detektè mas santwoyid la pandan y ap kenbe nivo bri a nan 5 × 1{{10}}3. Yo te reyalize bilding chromatogram Automated Data Analysis Pipeline (ADAP) ak paramèt sa yo: min gwosè gwoup nan yon kantite analiz 5, papòt entansite gwoup 5 × 1{{20}}³, min pi wo entansite. nan 5× 10 plis ,m/z tolerans nan 0.01 m/z oswa 10 ppm. Dekonvolusyon kwomatogram la te reyalize lè l sèvi avèk Wavelets (ADAP) kòm yon algorithm, S/N papòt 3, min wotè karakteristik 1 × 105, koyefisyan/zòn papòt 5, pik dire 0.{{ 18}}.00 min, ak RT ranje ondlèt 0.00-0.05. Chromatogram yo te deisotoped lè l sèvi avèk algorithm grouper pik izotopik ak yon tolerans m / z nan 0.001 m / z oswa 5.0 ppm ak yon tolerans RT nan 0.10 min. Travay FBMN te fèt lè l sèvi avèk tolerans mas paran 0.02 Da ak yon tolerans ion fragman MS4 nan 0.02 Da. Bor yo te filtre pou gen yon papòt nòt 0.7 ak yon minimòm de 2 pik matche. Anplis, kantite maksimòm nœuds vwazen pou chak ne te fikse a 10.

4.4. Analiz Kantitatif nan Lignans ak Triterpenes

Menm kondisyon UPLC rapòte pou analiz kalitatif yo te itilize pou analiz quantitative lignans, pandan ke pou triterpenes, yo te optimize pou separe de pè izomè, arjunolic ak asid azi. Analiz la te fèt sou yon Q-Exactive Classic Mass Spectrometer jan sa te dekri deja. Separasyon an te fèt pa yon Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2.1 mm, gwosè patikil 5 μm）. Faz mobil lan te genyen A (5 mM amonyòm asetat solisyon akeuz, pH 9.00 ajiste pa idroksid amonyòm) ak B (100 pousan acetonitrile) lè l sèvi avèk yon elisyon gradyan nan 17-28 pousan B nan 0-18 min, 28-65 pousan B nan 18-22 min, 65-75 pousan B nan 22-26min,75-95 pousan nan {{17 }}, 5min, 95 pousan nan 26,5-30 min, 95-17 pousan nan 30-30,1 min,17 pousan nan 30,1-42 min. Pousantaj koule a te 0.450 mL / min ak volim nan piki te 5 uL. Pou tou de lignans ak triterpenes, done yo te akeri ak yon mòd Full MS-SIM ak PRM. Anviwònman konplè MS-SIM yo te: rezolisyon 70.000, sib AGC 3×106, maksimòm IT 200ms, epi yo ka varye ant 200 ak 800 m/z pou lignan ak ant 400 ak 850 m/z. pou triterpenes. Anviwònman PRM yo te: rezolisyon 70.000, sib AGC nan 2 × 10 degre, maksimòm IT nan 100 ms, fenèt izolasyon nan 1.0 m/z, ak NCE nan 35 nan ka a nan lignan ak 50 nan sa a. nan triterpenes.cistanche OstraliNou te achte Salvador sou kote (#{{0}}XS172930) nan Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Swis), liriodendron (#SMB00181), ak asid arjunolic (#SMB00119) nan Sigma. -Aldrich (St. Louis, MO, USA), asid azi (#0027) soti nan Extrasynthese (Genay, Lyon, Frans) ak hederagenin (#89706) soti nan PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Almay). Asid Myrianthic se te yon kado nan men Prof. Maria Valeria D'Auria, University of Naples. Koub kalibrasyon yo te jwenn nan enjekte solisyon estanda nan seri konsantrasyon 0.25-25 μM pou lignans ak 0.1-25 uM pou triterpenes. Tou de pi Salvador sou kote ak liriodendron te montre de pik LC-MSMS, pwobableman akòz ekilib chimik ki te etabli nan solisyon an. Limit deteksyon (LOD) ak limit quantification (LOO) pou estanda yo te detèmine sou baz rapò siyal-a-bri (S/N).

4.5.Kilti Selil Po ak Eksplantasyon

Fibroblast po imen (HDF) yo te konsève nan Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ak 10 pousan nan serom fetis bovine (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). )nan 95 pousan lè, 5 pousan CO, ak atmosfè imidite a 37 degre. Eksplantasyon po, yo te jwenn nan po donatè fi ki an sante (ki gen laj 44-47) nan sant operasyon Villa Cinzia (Naples, Itali), yo te kiltive nan 24-plak transwell nan DMEM/FBS plis antibyotik nan lè-. kondisyon likid nan 37 degre nan 5 pousan CO2 lè imidite. Tout donatè yo te bay konsantman enfòme ekri yo pou itilize tisi po yo, dapre Deklarasyon èlenki.

4.6. Tès sitotoksisite

Tès sitotoksisite yo te baze sou itilizasyon MTTcompound [{{0}}({45-dimethyl thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolyum-bromide][34]. Selil yo te grandi nan 96-plak byen nan mwayen kilti DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), siplemantè ak 10 pousan serom fetis bovin, pou apeprè 8 èdtan. Apre tretman ak ObHEx ant 0.05 pousan ak 0.0004 pousan (500 ug/mL ak 4 ug/mL) pou 48 èdtan, yo te lave selil yo nan PBS epi yo te enkube ak 100 μL/pi. "tanpon reyaksyon" ki gen ∶ 10 mMof Hepes, 1.3 mM CaCl2, 1mM MgSO, 5 mM glikoz, ak 0.5 mg/mL MTT substrate kolorimetrik nan tanpon PBS nan pH7.4. Apre 3h enkubasyon nan 37 degre C nan 5 pousan CO, yo te ajoute 100 μLof solisyon solubilize ki gen 10 pousan Triton-X100,0.1 N nan HCl nan izopropanol absoli. Apre 16 èdtan enkubasyon, yo te mezire reyaksyon kolorimetrik nan 595 nm ak lektè plak Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

4.7. Analiz de ekspresyon de MYLK ak TGF6RII Gene nan HDF

Pou chak pi, 1 × 10 degre HDF te grandi nan 6-plak byen nan DMEM nan 2 pousan FBS, apre 24 èdtan FBS te dilye plis nan 0.5 pousan, ak la selil yo te trete ak 0.002 pousan ak 0.006 pousan konsantrasyon ObHExand TGF- 2.5ng/mL, ki te swiv pa yon enkubasyon de 2h pou MYLK ak 48 pou TGFRII. Pou fè ekstraksyon RNA, yo te itilize twous "GenEluteM Total RNA Purification" ki te achte pa konpayi Merck (Darmstadt, Almay). Apre tretman ki endike yo, selil yo te lave ak PBS, yo te kolekte nan tanpon lysis, epi yo te sibi pwosedi ekstraksyon jan yo rapòte. Yo te trete echantiyon yo avèk DNase I (Ambion, Austin, TX, USA) nan 37 degre pou 30 minit pou retire kontaminan ADN jenomik la. Soti nan chak echantiyon, 2 μL yo te chaje sou jèl 1 pousan agaroz nan prezans lank chaje denaturasyon nan bi pou yo quantizing kantite RNA an referans a yon makè espesifik pou RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) te itilize kòm lojisyèl pou quantization. Apre sa, yo te transkri 300 ng total de RNA lè l sèvi avèk transkriptaz ranvèse anzim (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Semi-quantitative RT-PCR te fèt lè l sèvi avèk kòm estanda entèn pè primè inivèsèl 18S Jadendanfan/konkiran (Ambion, Austin, TX, USA). Pwodwi PCR yo te separe sou 1.5 pousan jèl agaroz, yo te wè ak zouti Reliance (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), epi analize pa densitometri lè l sèvi avèk lojisyèl Genetools. Sekans primè yo itilize pou anplifikasyon yo se sa ki annapre yo: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8. Analiz kapasite kontraksyon yon matris kolagen an

Konsènan selil HDF yo, 2.0× 10 degre yo te resispann nan mwayen kwasans 5x DMEM (Gibco, Waltham, MA, USA) nan yon plak 24-byen, ak yon 2 mg/ mL solisyon kolagen an soti nan po bovine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) te ajoute nan chak pi. pH solisyon an te ajiste a 7.2. Plak la te enkube a 37 degre C pou 45 min pou pèmèt solidifikasyon jèl kolagen an. DMEM te ajoute ak 10 pousan FBS ak/oswa ML7 25 uM, kòm inibitè MYLKprotein, te ajoute pita. Apre 16 èdtan, ML7 te otorize ak ObHExat konsantrasyon nan 0.002 pousan nan DMEM ak 2 pousan FBS te ajoute. TGF - 2.5 ng/mL te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Diskèt kolagen an ki te fòme te imedyatman detache nan pi a lè l sèvi avèk yon mikwo spatul esteril yo nan lòd yo ankouraje kontraksyon li yo. Zòn ki genyen nan disk la nan chak tretman yo te mezire nan time0 ak 5 h ak analize lè l sèvi avèk lojisyèl Imaj.

4.9. Analiz de degre nan polimerizasyon aktin

Apre sa, yo te grandi 1.5 × 1 0 degre selil HDF pou chak pi nan yon plak 24-byen epi jou kap vini an te ajoute mwayen an ak 2 pousan FBS ak Cytochalasin B la, ki se yon inibitè aktin. polimerizasyon, nan 2 μM pou 3{{1{{20}}}} min. Apre 30 min, sou selil yo, yo te ajoute ObHEx（0.002 pousan ak 0.006 pousan ） ansanm ak TGF- 2.5 ng/mL, yo itilize kòm yon kontwòl pozitif, ak ML{7 25μM, kòm yon kontwòl negatif MYLKenzyme la. Apre 30 minit nan tretman, selil yo te fiks ak 4 pousan paraformaldehyde (PFA) nan fosfat tanpon pou 30 minit sou glas. Selil yo te lave ak PBS ak pèmeabilize ak yon solisyon nan tanpon fosfat ak Triton-X100 nan 0.2 pousan pou 30 min. Imedyatman, selil yo te enkube ak yon solisyon nan 0.4 μM nan phalloidin konjige ak rhodamine (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) pou 1 èdtan nan fè nwa a.benefis cistancheNan moman 0 ak apre 18h, yo te mezire fliyoresans nan 540/570 nm lè l sèvi avèk lektè plak Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). 4.10.Analiz SMAD2 Pathway

Selil HDF yo te simen nan yon dansite 3 × 103 nan plak 96-byen epi apre 16 èdtan yo te transfekte lè l sèvi avèk X-tremeGeneTM HP ADN reyaktif transfèksyon (Roche Diagnostics, Basel, Swis) ak vektè repòtè Smad2 dapre enstriksyon manifakti a. Apre 24 èdtan, selil yo te trete ak ObHEx oswa TGF- 2.5 ng/mL, poukont yo oswa nan konbinezon ak ML7 25 μM pou 24 èdtan. Nan fen enkubasyon an, selil yo te lave ak PBS epi yo te detèmine aktivite luciferase yo lè l sèvi avèk sistèm tès SteadyGlo Luciferase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) nan Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA). , USA).

4.11.Analiz Pro-Collagen I, Tropoelastin, ak Sentèz Peryostin

Pou chak pi, 8× 103 HDF te grandi nan 96-plak byen epi yo te trete ak 0.{002 pousan ObHEx oswa TGF 2.5 ng/mL. Apre 24 èdtan, yo te trete selil yo pou ELISA lè l sèvi avèk antikò prensipal monoklonal anti-prokolagen tip I (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), ki te swiv pa enkubasyon ak antikò segondè anti-sourit ki make. ak peroksidaz (170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA). Supernatant selil yo te kouvwi sou yon lòt plak pou deteksyon tropoelastin ak periostin lè l sèvi avèk antikò lapen anti-tropoelastin (ab21600, Abcam, Cambridge, U oswa antikò sourit anti-periostin (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology). , Dallas, TX, USA), ki te swiv pa enkubasyon ak antikò segondè anti-lapen ki make ak peroksidaz (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA). Yo te devlope reyaksyon kolorimetrik lè yo ajoute 100 μL nan yon solisyon akeuz. OPD (O-phenylenediamine), 0.35 mg/mL nan 50 mM sitrat tanpon, ak 0.012 pousan oksijene idwojèn (H2O2).Apre 30 min, yo te mezire absorbans nan 490 nm lè l sèvi avèk lektè miltip Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

4.12. Tès Ex Vivo

ImmunoHistoFluorescence (IHF) nan MYLK ak fosforil myosin te evalye nan eksplant po donatè {{0}}zan. Eksplantasyon po moun yo te koupe ak kouret byopsi kout pwen 8 mm epi yo te kiltive nan 24-plak byen nan DMEM ak 10 pousan FBS ak antibyotik. Yo te trete pwenson yo jwenn ak 0.002 pousan ak 0.006 pousan ObHEx pou 24 èdtan. Yo te enkube nan 15 pousan sikwoz, Lè sa a, nan 30 pousan sikwoz, epi finalman nan frizè. Apre sa, yo te jwenn seksyon 10 μm lè l sèvi avèk kriostat CM1520 (Leica Microsystems, Wetzlar, Almay). Glisad ak cryosections yo te idrate pou 30 minit nan PBS epi yo mete yo nan yon solisyon "bloke" (6 pousan BSA, 5 pousan serom, 20 mM MgCl,, 0.2 pousan Tween) pou 1 èdtan. Krioseksyon yo te enkube ak antikò prensipal lapen anti-MYLK (1: 100, GeneTex, Irvine, CA, USA) ak antikò prensipal anti-phospho-myosin (1: 100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) pou 16 èdtan nan 4 degre. Glisad yo te lave ak PBS pou 30 minit epi answit enkube ak antikò segondè anti-lapen Alexa-Fluor 546 (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) pou 1 èdtan. Nwayo yo te tache ak DAPI (4',6-5 diamidino-2-phenylindole) 1 ug/mL nan PBS pou 10 min. Imaj yo te akeri ak yon mikwoskòp fliyoresan epi analize ak lojisyèl ImageJ la. Pou IHF tropoelastin ak kolagen I, yo te itilize eksplantasyon po 36-donatè fi ki gen laj. Yo te jwenn byopsi po jan sa dekri pi wo a epi yo te trete davans ak 0.002 pousan ak 0.006 pousan ObHEx pou 24 èdtan. Estrès ak idrokortizon nan 10 ug/mL pou 8 jou te ajoute nan prezans ObHEx. Apre sa, byopsi yo te jele jan sa dekri pi wo a epi seksyon yo te enkube ak antikò prensipal lapen anti-tropoelastin (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, UK) ak anti-kolagen I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Almay) pou 16h nan 4 degre. Glisad yo te analize jan sa dekri pi wo a epi imaj yo te akeri ak analize ak lojisyèl ImageJ la.

4.13. Mikwoskopi fòs atomik (AFM) nan eksplantasyon po

Elastisite echantiyon po ki pa trete ak trete ak ObHEx te evalye asire modil Young yo pa yon metòd nan echèl nanometrik ki baze sou Atomic Force Microscopy (AFM), devlope pa sèlman pou echantiyon byolojik, men tou pou echantiyon inòganik yo. Apwòch sa yo baze sou sipozisyon modèl Hertz yo epi yo konsidere echantiyon an ak cantilever kòm de sous dlo nan yon seri nan yon anviwònman eksperyans AFM. Yon ti tan, po ansyen plant trete ak 0.006 pousan nan ObHEx ak echantiyon po ki pa trete yo te koupe pa kriostat nan tranch 10 um nan epesè. Echantiyon yo te estoke nan 12 degre, Lè sa a, lave ak PBS epi egzamine nan yon tanperati fiks ak imidite relatif nan 22 degre ak 55 pousan, respektivman. Chak echantiyon te envestige pa yon NanoScope IIA AFM nan Force Spectroscopy Single Mode lè l sèvi avèk yon pwent piramidal (RESP-20) ak yon konstan prentan 0.9 N/m. Pou kalkile modil Young, yo te jwenn dis koub Fòs nan dis pwen diferan nan menm sipèfisi echantiyon an. Chak koub Fòs se yon koub defleksyon (Volt) kont deplasman (nm) epi yo ka konvèti an koub Fòs (N) kont separasyon (nm). An reyalite, chak koub Force rapòte koub chaje ak dechaje. Yo reprezante tandans pwent an ki gen rapò ak echantiyon an: lè pwent la se byen lwen echantiyon an lè yo antre an kontak ak pwent la kòmanse devye, epi lè li deplase lwen ankò. Se sèlman premye pati koub sa yo ka envestige. Chak pati sa yo nan koub yo te anfòm ak yon modèl Hertzian estanda, an patikilye, Hertzequation tipik pou yon pwent piramid, ekstrè modil elastik ke yo rekonèt kòm modil Young nan GPa.

4.14. Analiz estatistik

Tout valè rapòte yo te mwayèn twa eksperyans endepandan, chak nan yo te fèt an triple. Asterisk yo endike siyifikasyon estatistik yo kalkile an akò ak tès t la: *vle di valè pi piti oswa egal a 0.05;** valè p pi piti oswa egal a 0. 01;***p valè Mwens pase oswa egal a 0.001.

Atik sa a soti nan Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites