Antioksidan, anti-enflamatwa, ak anti-aje potansyèl nan yon ekstrè Kalmia angustifolia ak idantifikasyon nan kèk konpoze prensipal Pati 1

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:Aje po se eleman ki pi vizib nan pwosesis aje a, ki bay yon gwo enkyetid pou anpil moun. Plant ki soti nan fanmi Ericaceae jeneralman gen pwopriyete antioksidan ak anti-enflamatwa, ki fè yo potansyèl engredyan aktif anti-aje. Etid sa a te vize pou evalye sekirite ak anti-aje efikasite nan yon ekstrè Kalmia angustifolia lè l sèvi avèk ranplasan po rekonstwi. Evalyasyon sekirite a te fèt lè l sèvi avèk yon 3-(4,5-dimethyl thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromur (MTT)essai, pandan ke yo te efikasite detèmine pa evalye aktivite antioksidan ak anti-enflamatwa ak analize ranplasan po rekonstwi selon metòd oto-asanble pa istoloji ak tach imunofluoresans (elastin, kolagen-1, kolagen-3, akwaporin-3) . Tès viabilite selil la te etabli sekirite ekstrè a nan yon konsantrasyon ki rive jiska 200 ug/mL. Egzamen Kapasite Radikal Absòbsyon Oksijèn (ORAC) ak yon tès ki baze sou selil lè l sèvi avèk 2',7'-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) te revele yon gwo aktivite antioksidan ak yon valè ORAC 16 μmol Trolox Ekivalan/mg ak yon mwatye. maksimòm konsantrasyon inhibitory (IC50) nan 0.37±0.02 ug/mL, pandan y ap yon aktivite enteresan anti-enflamatwa yo te jwenn nan anpèchman pwodiksyon NO, ak yon pousantaj anpèchman pwodiksyon NO nan 49±2 pousan nan 80 ug/mL. Izolasyon ak karakterizasyon ekstrè a pèmèt idantifikasyon konpoze ki ta ka responsab aktivite byolojik sa yo, ak de nan yo te idantifye pou premye fwa nan K.cistanche stemAngustifolia: avicularia ak epicatechin-(2 -O-7, 4 -6)-ent-epicatechin. Analiz histolojik nan ranplasman po trete ak ekstrè a te montre yon ogmantasyon nan epesè po konpare ak kontwòl yo. K. Angustifolia ekstrè ogmante ekspresyon de elastin ak kolagen an -1, ki anjeneral diminye ak aje po. Rezilta sa yo sijere ke K. Angustifolia gen pwomèt efikasite antioksidan ak potansyèl anti-aje.

Tanpri klike la a pou w konnen plis

Mo kle: ranplasman po; aje po; pwodwi natirèl; engredyan aktif; Mouton Laurel; aktivite antioksidan; aktivite anti-enflamatwa; jeni tisi

1. Entwodiksyon

Po aje se yon pwosesis natirèl fizyolojik enkyetid pou anpil moun. Li se premye "yon siy vizib nan avanse laj ak koripsyon po. Kidonk, fòmilasyon an nan anti-aje: pwodui kosmetik yo te pran enpòtans nan dènye ane yo akòz dezi a limite aparans nan aje. Po aje karakterize pa chanjman miltip nan yon nivo byolojik, ki gen ladan yon diminisyon nan pwopagasyon selil, sa ki lakòz atrofi epidèm, ak yon diminisyon nan konpozan po tankou fibroblast ak elastin ak fib kolagen, e konsa yon diminisyon nan epesè po nan granmoun aje [1,2] .Forè boreal la plen ak resous enkonu ak gwo potansyèl pou devlopman engredyan aktif kosmetik Kalmia angustifolia, ke yo rele tou mouton Laurel, se yon plant anjyospèm nan fanmi Ericaceae.benefis cistanche tubulosa ak efè segondèPlant sa a se natif natal nan lès Amerik di Nò men yo jwenn sitou nan forè boreal Kanadyen an [3].Nan medikaman tradisyonèl Ameriken natif natal, K. Angustifolia te itilize pou trete divès pwoblèm sante ki enplike enflamasyon, tankou doulè nan vant, antors, ak anfle, sijere ke plant sa a gen pwopriyete anti-enflamatwa [4]. Plizyè plant nan fanmi Ericaceae genyen tou pwopriyete anti-enflamatwa ak antioksidan, ki fè yo enteresan engredyan kosmetik aktif. Konpozisyon chimik K.angustifolia poko byen dokimante. Gen kèk etid ki idantifye konpoze toksik, tankou grayanotoxins, ki se nerotoksin pwazon pou moun lè yo enjere, men raman fatal, ak arbutin(4-hydroxyphenyl -D-glucopyranoside), yon inibitè tirozinaz yo jwenn nan fèy K. Angustifolia. epi itilize kòm yon ajan depigmantasyon [5-8]. Malgre sa yo konpoze potansyèlman toksik yo te jwenn nan K. Angustifolia, lòt rechèch te etabli tou ke flavonoid, asid fenolik, tanen, ak tèrpèn yo ka jwenn nan abondans nan plant la [9-15]. Kèk nan konpoze sa yo gen aktivite byolojik enteresan epi yo ka bay K. Angustifolia yon efè anti-aje pwomèt, menm jan yo fè pou lòt plant yo.

Cistanche ka anti-aje

Menmsi gen yon nesesite pou devlope nouvo pwodwi dermo-kosmetik ki ede anpeche aje po, nouvo lwa ki entèdi oswa mete restriksyon sou tès bèt nan endistri a kosmetik fè li pi difisil pou fè sa. Se poutèt sa, lòt opsyon pou tès efikasite pwodwi yo bezwen. Itilize nan kilti selil in vitro, oswa ranplasan po, se yon bon altènatif pou tès depistaj engredyan kosmetik. Plizyè modèl yo apwouve pa Sant Ewopeyen an pou Validasyon Metòd Altènatif (ECVAM, Ispra, Itali) ak vann komèsyal bay konpayi kosmetik, yo nan lòd pou yo egzekite tès sekirite epi evite soufrans ki pa nesesè vini ak itilizasyon bèt [16,17] . Sepandan, pifò modèl ki disponib nan komès prezante sèlman yon epidèm diferansye epi yo manke entèraksyon ant keratinosit ak fibroblast [16]. Nouvo modèl plen epesè yo te parèt nan dènye ane yo epi yo te pèmèt, pami lòt moun, envestigasyon nan chemen aje ak konpoze anti-aje, ki fè yo zouti itil pou ranplasman itilizasyon bèt nan jaden an kosmetik [18,19].cistanche tubulosa ekstrèObjektif etid sa a se te premye evalye aktivite byolojik yon ekstrè K. Angustifolia sou monokouch selil kiltive ak Lè sa a, evalye potansyèl anti-aje ekstrè sa a lè l sèvi avèk ranplasan po rekonstwi dapre metòd pwòp tèt ou-asanble [20,21] . Fòs nan modèl ranplasan po sa a se ke li gratis nan materyèl ekzojèn ak depann sou kapasite nan asid ascorbic ankouraje pwodiksyon an nan matris ekstraselilè pa fibroblasts po, fè modèl la antyèman imen.revizyon cistanche tubulosaEtid sa a prezante yon nouvo engredyan aktif ki ta ka itilize nan pwodwi dermo-kosmetik ak sijere itilizasyon modèl in vitro kòm yon altènatif nan rechèch kosmetik.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Materyèl Plant ak Preparasyon Ekstrè

K.angustifolia te rekòlte nan 2 Me015 nan rejyon Lac-St-Jean nan Quebec, Kanada. M. Patrick Nadeau te idantifye plant la epi yo te depoze yon echantiyon bon (no.QFA0617265) nan èrbyòm Louis Marie Inivèsite Laval, Ouébec, Kanada. Pati ayeryen nan K.angustifolia (2.1 kg) yo te tè lè l sèvi avèk yon Mill koupe Fritsch Pulverisette 25 (Fritsch, Laval, QC, Kanada) epi yo te ekstrè anba rflu ak etanòl anidrid (1.5L, twa fwa) ak EtOH-H2O3:1( 1.5 L, de fwa). Ekstrè yo te jwenn apre premye ekstraksyon yo (nan EtOH ak EtOH-H, O) yo te filtre ak pisin ansanm. Apre evaporasyon EtOH nan vacuo, faz akeuz la te divize ak dichloromethane (DCM, CHCl; 300 mL, senk fwa) ak acetate etil (EtOAc; 300 mL, senk fwa). Faz EtOAc la te evapore anba presyon redwi a sechrès pou bay ekstrè K.angustifolia (222.6 g, 10.6 pousan). Jou anvan tretman an, ekstrè a, nan fòm poud, te fonn nan dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, Oakville, ON, Kanada) pou jwenn solisyon stock la, epi yo te estoke nan -20 degre jiskaske li nesesè. Konsantrasyon yo vle nan K.angustifolia yo te jwenn nan dilye solisyon an stock (12.5 oswa 25 mg / mL) dirèkteman nan mwayen kilti a nan jou eksperyans la. Konsantrasyon final la nan DMSO te 0.2 pousan (ofo) yo nan lòd pou fè pou evite toksisite sòlvan.

2.2.Izolasyon Konpoze Gwo nan ekstrè K. Angustifolia

Nan ekstrè EtOAc ki dekri deja, 30 g yo te separe pa kwomatografi sou yon kolòn Diaion (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA), lè l sèvi avèk MeOH/H2O kòm eluyan nan kondisyon gradyan (40 pousan). , 50 pousan , 60 pousan ,70 pousan , ak 100 pousan ), pou bay kat fraksyon anrichi (AD). Fraksyon B (2 g) te sibi nan yon kolòn jèl silica (200 g) epi elite ak kondisyon gradyan nan MeOH-DCM soti nan 5 pousan a 15 pousan bay kat fraksyon (B1-B4). Fraksyon C (6 g) te tou sibi yon kolòn jèl silica (300 g) ak eluye ak kondisyon gradyan nan MeOH-DCM soti nan 5 pousan a 25 pousan bay sèt fraksyon (C1-C7). Fraksyon C3 (500 mg) te pirifye pa chromatografi ranvèse-faz sou yon kolòn C18 (120 g, FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18, Silicycle, Quebec, QC, Kanada) lè l sèvi avèk 0.1 pousan asid fòmik nan H, O-MeOH soti nan 40 pousan a 60 pousan. Kat subfraksyon yo te jwenn: C3A-C3D, ak C3B, ak C3C ak pite segondè, ki gen gwo konpoze. Fraksyon C4(2g) te pirifye tou pa chromatografi ranvèse-faz sou yon kolòn C18 lè l sèvi avèk 0.1 pousan asid fòmik nan H2O-MeOH soti nan 30 pousan a 45 pousan. Twa soufraksyon yo te jwenn nan separasyon an: C4A-C4C, ak C4A ak C4C nan pite segondè, ki gen chak yon sèl konpoze. Fraksyon D (8.7 g) te sibi kolòn jèl silica (2 × 200 g) epi elite ak kondisyon gradyan CHCl3-MeOH (15:1; 10:1; 5:1) pou jwenn uit fraksyon (D). 1-D8). Fraksyon D1 a D4 yo chak prezante yon gwo konpoze.

2.3. Analiz RMN ak GC-MS

Yo te anrejistre espèk nikleyè sonorite mayetik (NMR) ak yon espektromèt Bruker Avance 400 (Bruker, Milton, ON, Kanada) nan 400 MHz pou nwayo H ak 100 MHz pou nwayo 13C, lè l sèvi avèk klowofòm deutere (CDCl3) oswa metanol deutere (CH3OD) kòm sòlvan an. Chanjman chimik yo rapòte an ppm parapò ak pik rezidyèl sòlvan an. High-Rezolisyon Mass Spectrometry (HRMS) te anrejistre sou yon Agilent 6224 MS-TOF mas spectrometer (Agilent, Saint-Laurent, QC, Kanada) ekipe ak yon sous electrospray.

2.4.Biopsi ak Ekstraksyon Selil

Premye keratinosit ak fibroblast yo te jwenn nan byopsi nan operasyon rediksyon tete. Donatè yo te fanm Blan ki gen laj ant 18 ak 52 ane fin vye granmoun. Keratinosit ak fibroblast yo te ekstrè nan byopsi yo lè l sèvi avèk metòd izolasyon ki dekri deja [22,23]. Biopsi yo te enkube nan thermolysin nan 4 degre pou 16 èdtan yo nan lòd yo separe epidèm la ak dèrm la. Imedyatman, keratinosit yo te izole nan epidèm la lè l sèvi avèk trypsin pou 30 minit, pandan y ap fibroblast yo te izole nan dèrm yo lè l sèvi avèk kolagenaz pou 4 èdtan. Lè sa a, selil yo te kiltive nan pasaj la vle. Keratinosit yo te itilize nan pasaj 1 ak fibroblast nan pasaj 4.

2.5. Kilti Selil

Fibroblast prensipal yo (pasaj 4) yo te simen nan 4 × 103 selil/cm² epi yo te kiltive nan Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ki te ajoute ak 10 pousan serom FB Essence (FBI; Seradigm, Salt Lake City). , UT, USA), 100 UI/ml penisilin G (Sigma, Oakville, ON, Kanada), ak 25ug/ml gentamicin (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Keratinosit prensipal yo (pasaj 1) yo te simen nan 4 × 103 selil/cm² sou yon kouch feeder fibroblast murin 3T3 iradyasyon epi yo te kiltive nan yon konbinezon DMEM ak F12 Kam nan yon pwopòsyon 3:1 (DMEMH), ki te konplete ak 5 pousan klonaj fetal. Ⅱ serom (Hyclone, Scarborough, ON, Kanada), 5 ug/mL ensilin (Sigma, St. Louis, MO, USA), 0.4 ug/mL idrokortizòn (Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Kanada), 0.212 ug. /mL isoproterenol idroklorid (Sandoz Kanada, Boucherville, QC, Kanada), 10 ng/mL faktè kwasans epidèm imen (EGF; Austral Biological, San Ramon, CA, USA), 100UI/mL penisilin G (Sigma, Oakville, ON, Kanada). ) ak 25 ug / mL gentamicin (Gemini, West Sacramento, CA, USA). Kilti selil yo te enkube nan 37C nan yon atmosfè 8 pousan diyoksid kabòn (CO2). Medya kilti selil yo te chanje chak de jou, pou yon total de twa fwa pa semèn.

2.6. Esè sitotoksisite

Yo te evalye toksisite ekstrè K.angustifolia sou keratinosit prensipal yo lè l sèvi avèk yon {{0}}(4,5-dimethyl thiazolyl-2)-2,{{5} }diphenyltetrazolium bromur (MTT) esè. Egzamen MTT a se yon tès kolorimetrik ki baze sou rediksyon anzimatik yon sèl jòn tetrazolyom (MTT) nan kristal formazan koulè wouj violèt. Reyaksyon anzimatik sa a katalize pa mitokondrial succinate dehydrogenase nan selil metabolik aktif. Kidonk, li itilize pou evalye viabilite selilè ki baze sou aktivite metabolik selilè. Yon ti tan, nan jou 0, keratinosit nan P3 ki soti nan donatè ki an sante yo te plake nan 5 × 103 selil / pi nan yon plak 96-byen sou yon kouch feeder fibroblast murin 3T3 iradyasyon. Nan 2 jou, tretman an te ajoute. Nan jou 4, MTT lank (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma, St. Louis, MO, USA) te ajoute nan plak la nan yon konsantrasyon nan 0.5 mg / mL nan esteril fosfat-tanpon saline (PBS) 1X. Lè sa a, plak la te enkube pou 3 èdtan (37 degre, 8 pousan CO,) ak formazan yo te ekstrè ak yon solisyon fre nan izopropanol ak asid idroklorik (HCl). Yo te li absorbans la nan 570 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA). 2.7. Essay Kapasite Radikal Absòbsyon Oksijèn (ORAC).

Yo nan lòd yo evalye pwopriyete yo antioksidan nan ekstrè a K.angustifolia, yon tès Oksijèn Radical Absorbance Capacity(ORAC) te fèt jan sa dekri pa Ou et al. ak kèk modifikasyon [24]. Yon ti tan, yo te fè tès la nan yon 384-plak byen sou yon lektè plak Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, USA). Diferan konsantrasyon Trolox(6-idwoksi-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-asid carboxylic; yon analòg vitamin E) yo te prepare pou fè yon koub estanda nan lòd. pou konpare echantiyon tès yo ak kontwòl pozitif sa a. Eksperyans lan te fèt nan yon tanperati 37.5 degre ak yon mwatye 7.4 ak yon echantiyon vid nan paralèl.cistanche UKYo te anrejistre fliyoresans fluorescein chak 60 s ak fliyomèt apre adisyon 2,2'-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride. Yo te mezire fliyoresans nan yon longèdonn eksitasyon 485 nm ak yon longèdonn emisyon 538 nm. Rezilta yo te kalkile lè l sèvi avèk diferans ki genyen ant zòn ki anba fliyorescein pouri anba tè vid la ak koub echantiyon an. Rezilta yo pou valè ORAC yo te eksprime nan mikromol ekivalan Trolox （TE） pou chak miligram (μmol TE/mg) oswa mikromol nan TE pou chak mikromol (umol TE/mol).

2.8. Aktivite antioksidan evalye lè l sèvi avèk yon tès ki baze sou selil

Aktivite antioksidan an te evalye ak yon tès selil ki baze sou lè l sèvi avèk 2',7/-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) jan sa dekri pa Girard-Lalancette et al. ak kèk modifikasyon [25]. Yon ti tan, po moun WS1 fibroblasts (ATCC⑧ CRL-1502, Manassas, VA, USA) yo te enkube pou 60 minit ak 100 μL nan 5μM DCFH-DA nan solisyon sèl Hanks balanse (HBSS, HyClone, Marlborough, MA, USA) . Lè sa a, pou evalye aktivite antioksidan ekstrè a, selil yo te enkube pou 60 minit ak ogmantasyon konsantrasyon ekstrè K.angustifolia ak kontwòl pozitif (quercetin ak Trolox). Pou estrès oksidatif, yo te ajoute 100 μL nan 400 μM tertbutyl hydroperoxide （t-BuOOH） pou jwenn yon konsantrasyon final 200 μM t-BuOOH nan pwi yo. Lè sa a, yo te mezire fliyoresans la imedyatman epi apre 90 minit lè l sèvi avèk yon lektè otomatik Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, USA). Fluoresans la te evalye nan yon longèdonn eksitasyon nan 485 nm ak yon longèdonn emisyon nan 538 nm. Aktivite antioksidan te eksprime kòm pousantaj anpèchman nan oksidasyon DCFH.

2.9. Aktivite anti-enflamatwa evalye pa Quantification Nitrite

Aktivite anti-enflamatwa a te evalye pa evalye anpèchman nan pwodiksyon oksid nitrique (NO) pa ekstrè a K.angustifolia jan sa dekri pa Legault et al. [26]. Yon ti tan, makwofaj murin RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71, Manassas, VA, USA) yo te enkube ak ogmantasyon konsantrasyon nan ekstrè K. Angustifolia ak Lè sa a, ankouraje ak 100 ng / mL lipopolysaccharide (LPS). Yon kontwòl pozitif, Nw-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride （L-NAME）, te itilize tou nan de diferan konsantrasyon∶250 μM (67 ug/mL) ak 1 mM (270 ug/mL). Supernatant san selil yo te kolekte 24 èdtan apre LPSstimulation la, epi konsantrasyon NO a imedyatman evalye lè l sèvi avèk reyaksyon Griess la. Yo te li absorbans la nan 540 nm lè l sèvi avèk yon lektè plak Multiskan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Prezans nitrite te quantifye lè l sèvi avèk yon koub estanda NaNO. Selil inaktive (ekspoze ak medya pou kont li) yo te itilize kòm yon kontwòl negatif ak selil aktive kòm yon kontwòl pozitif.

2.10.Pwodiksyon Ranplasan Po

Ranplasan po ki an sante yo te pwodwi dapre metòd pwòp tèt ou-asanble a, pasyèlman modifye lè l sèvi avèk 6-byen plak [20,21]. Yon ti tan, fibroblasts nan P5 ki soti nan donatè ki an sante yo te simen nan 1.5 × 105 selil / byen ak kiltive pou 26 jou nan DMEM complétée ak 50 ug / mL nan (plis)-sodyòm L-ascorbate (Sigma, St. Louis, MO, USA) jiskaske yo te fòme dra manipulable. Lè sa a, de dra fibroblast yo te detache ak supèrpoz yo fòme ekivalan nan po. Ekivalan po yo te enkube nan 37 degre nan yon atmosfè 8 pousan CO, pou de jou plis pou pèmèt fizyon fèy epi konsa fòme nouvo kouch po a nan ranplasman po yo. Apre peryòd sa a, keratinosit nan P2 ki soti nan donatè ki an sante yo te simen sou ekivalan po a nan 1 × 10 degre selil / ekivalan yo fòme kouch epidèm nan ranplasan po yo ak kiltive pou sèt jou nan DMEMH complétée ak 50 ug / mL nan (plis) -sodyòm L-ascorbate (Sigma, St. Louis, MO, USA) pou pèmèt keratinocyte pwopagasyon. Lè sa a, ranplasan po yo te leve soti vivan nan koòdone lè-likid pou ankouraje diferansyasyon selil. Nan koòdone lè-likid, ranplasman po yo te kiltive ak yon mwayen ki manke EGF pou jwenn yon reprezantan epitelyal stratifye nan po in vivo. Katòz jou apre yo te leve soti vivan nan koòdone lè-likid, ranplasman po yo te trete twa fwa pa semèn pou yon semèn ak solisyon an stock ekstrè dilye nan yon mwayen kilti (ak yon konsantrasyon final nan ekstrè K. Angustifolia nan 25 ug / mL). Apre yon total de 56 jou nan kilti, yo te pran biopsi ranplasan po ak analize pa istoloji ak tach imunofluoresan.

2.11. Analiz histolojik

Yo te fikse byopsi ranplasan po ki soti nan chak kondisyon nan solisyon HistoChoice (Amresco, Solon, OH, USA) epi yo te entegre nan sir parafin. Lè sa a, seksyon 5 μm epè yo te koupe ak tache ak Trichrome Masson lè l sèvi avèk ematoksilin Weigert a, fuchsin-ponceau, ak koloran ble anilin. Yo te mezire dèrm ak epesè epidèm vivan ak lojisyèl ImageJ (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Pou mezi epesè yo, yo te analize twa popilasyon selil diferan, epi pou chak nan yo, yo te pran de foto reprezantan pou chak kondisyon epi yo te fè 10 mezi pou chak foto pou yon total de 60 mezi pou chak kondisyon.

2.12. Tach imunofluoresan

Byopsi ranplasan po ki soti nan chak kondisyon yo te entegre nan Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), jele nan nitwojèn likid, epi yo te kenbe nan -80 degre jiskaske li nesesè. Seksyon glase nan po nòmal imen yo te itilize kòm kontwòl pozitif. Yo te fè tach imunofluoresans endirèk sou 6 um kriseksyon epè fiks nan asetòn. Antikò prensipal yo te itilize yo se: lapen poliklonal anti-elastin (gG) (dilution 1:800, Abcam, Cambridge, MA, USA), lapen poliklonal anti-kolagen -1 (IgG) (dilution 1:300, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada), lapen poliklonal anti-kolagen-3 (IgG) (dilution 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Kanada) ak lapen poliklonal anti-akwaporin-3 (IgG) (dilution 1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA). Antikò segondè yo te itilize se te bourik anti-lapen IgG (H plis L)Alexa 488 (dilution 1:1600, Life Technologies, Eugene, OR, USA). Nwayo selil yo te make apre antikò segondè a ak mwayen aliye DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Pou semi-kantite entansite fliyoresan chak pwoteyin, yo te mezire entansite pixel nan tach imunofluoresans lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Yon ti tan, tout kouch po a (dèm oswa epidèm vivan) nan pwoteyin etidye a te analize pa mezire valè gri mwayèn nan chak zòn. Entansite fluoresans ranplasan po trete yo te konpare ak entansite fluoresans ranplasan po kontwòl yo pou evalye chanjman nan ekspresyon pwoteyin yo obsève ak tretman yo.

2.13. Analiz estatistik

Rezilta yo te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda. Analiz estatistik tès MTI a, tès antioksidan ki baze sou selil la, ak aktivite anti-enflamatwa a te fèt ak yon analiz yon sèl-fason nan divèjans (ANOVA) ki te swiv pa yon tès post hoc Dunnett (valè p).<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

Atik sa a soti nan Antioksidan 2021, 10, 1373. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants