Ranfòse Aktivite Antikansè Aspergillus Favus "endofit nan Jojoba" Taxol atravè konjigezon ak nanopartikil lò medyatè pa iradyasyon.
May 30, 2023
Taxol altènatif Chinwa zèb Cistanche
Mo kle:Aspergillus favus · Jojoba · Fongis andofitik · Nanopartikil lò · Taxol · -Irradyasyon · Optimizasyon nitrisyonèl
Entwodiksyon
Taxol se youn nan gwo spectre ki pi komèsyalizedwòg antikansè[1]. Aktivite Taxol elabore soti nan spesifik inik li yo pou lye ak eterodimèr tubulin-subunits selilè, ankouraje polymerization tubulin, kidonk deranje divizyon mitotik nan selil timè [2]. Taxol te montre yon gwo aktivite kont tete, poumon, tèt, ak kou, kansè nan matris, ak fòm avanse nan sarkòm Kaposi a [3]. Taxol te pwodwi premyèman nan jape pye bwa Yew Taxus brevifolia "fanmi Taxaceae" [4, 5]; sepandan, sede a pi ba nan Taxol ke yo te<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as opresyon,enflamasyon, epikansè[32]. Kidonk, objektif prensipal travay sa a se te eksplore yon nouvo izole chanpiyon ki soti nan plant jojoba ak estabilite metabolik inik pou pwodiksyon Taxol, pou evalye diferan apwòch yo pou maksimize sede Taxol yo, epi tou pou amelyore aktivite antiproliferatif konpoze Taxol ki ekstrè. atravè konjigezon ak nanopartikil lò, medyatè pa iradyasyon gamma.
Materyèl ak Metòd
Izolasyon ak kiltivasyon fongis andofitik yo
Diferan pati nan jojoba (Simmondsia chinensis) tankou fèy, jape, brendiy, ak boujon yo te kolekte nan Fakilte Agrikilti a, Cairo University, epi yo te itilize kòm sous la pou fongis andofitik. Pati plant yo te kolekte epi lave anba dlo tiyo k ap koule, sifas esterilize ak etanòl 70 pousan pou 1 minit epi apresa rense ak dlo esteril [28]. Pati plant esterilize sifas yo te koupe an ti moso nan kondisyon esteril epi yo te mete yo sou plak medyòm agar pòmdetè dextrose (PDA), Czapek's-Dox, ak mwayen agar ekstrè malt [33-36], epi plak yo te enkube a 30 degre pou 10 jou. Efikasite esterilizasyon sifas pati plant yo te evalye pa santrifuje dlo a rense, Lè sa a, 500 ul dlo esteril yo te ajoute nan presipite a ak plake nan mwayen PDA [37]. Izolan chanpiyon andofitik pirifye yo te vaksine sou PDA slants pou 7 jou epi estoke nan 4 degre.
Depistaj, Ekstraksyon, ak Quantification nan Taxol soti nan fongis andofitik yo
Yo te fè tès depistaj fongis andofitik yo ki rete nan jojoba pou pwodiksyon Taxol lè yo grandi sou bouyon pòmdetè dextrose (PDB) [38]. Yo te bay yon ploge nan chak izolat ki gen 7 jou plezi nan 100 ml PDB/250 ml travay Erlenmeyer, yo te enkube pou 15 jou nan 30±1 degre, nan kondisyon souke (120 rpm). Apre enkubasyon, kilti yo te filtre, epi yo te amande filtraj la ak 0.2 pousan bikabonat sodyòm pou presipite asid gra. Taxol te ekstrè ak dichloromethane, ak faz òganik la kolekte epi evapore nan sechrès, ak résidus yo te re-fonn nan metanol [17, 39]. Taxol te separe ak idantifye pa TLC lè l sèvi avèk Merck 1 mm (20 × 20 cm) plak jèl silica pre-kouvwi (TLC Silica jèl 60 F254, Darmstadt, Almay), detekte pa lumières UV nan 254 nm [39]. Yo te grate tach yo nan Taxol ki soti nan plak jèl silica TLC yo epi yo fonn nan metanol, vortexed kouray pou 10 min, ak santrifuje nan 1000 rpm pou 5 min. Patikil silica presipite yo te retire, epi yo te pran sipènatan an pou quantification Taxol ak tcheke pite pa HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plis Quater nary Pump, Kore) nan kolòn faz ranvèse C18 (Eclipse Plus C18 4.6). × 150 mm, 3.5 μm, Cat # 959,963–902). Faz mobil yo te itilize a se methanol/acetonitrile/dlo (25:35:40, v/v/v) nan yon vitès 1.0 ml/min pou 20 min [40], ak fraksyon Taxol yo te mezire nan 227 nm, ak yo. idantite chimik ak konsantrasyon yo te konfime nan tan an retansyon ak zòn pik absòpsyon konpare ak echantiyon natif natal.
Idantifikasyon mòfolojik ak molekilè nan fongis andofitik yo refè
Yo te idantifye izolan chanpiyon andofitik yo nan nivo espès yo ki baze sou karakteristik makro ak mikwo-mòfolojik yo lè yo grandi sou PDA, Czapek's-Dox, ak medya ekstrè malt dapre kle referans yo [33-36]. Idantite ki pi pisan Taxol-pwodwi izole chanpiyon yo te konfime plis molekilèman ki baze sou sekans nan espas transkri entèn (ITS) [41, 42]. ADN jenomik chanpiyon (gDNA) te ekstrè nan pulverize miseli a (~0.2 g) nan nitwojèn likid, Lè sa a, distribye nan 1 ml CTAB tanpon ekstraksyon (2 pousan CTAB, 2 pousan PVP40, { {21}}.2 pousan 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl nan 10{0 mM Tris-HCl, pH 8.0). Ansanm Jadendanfan PCR yo te ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ ak ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Reyaksyon PCR la gen 10 ul nan 2 × PCR melanj mèt (i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul nan gDNA, 1 ul nan chak primè (10 pmol/ul), epi ranpli a 20 ul ak distile esteril. dlo. PCR la te pwograme pou premye denaturasyon a 94 degre pou 2 minit, denaturasyon a 94 degre pou 30 s, rkwit a 55 degre pou 10 s, ekstansyon nan 72 degre pou 30 s pou 35 sik, ak ekstansyon final nan 72 degre pou 2. min. Anplikon PCR yo te analize pa 1.5 pousan jèl agaroz nan 1 × TBE tanpon (Ambion Cat # AM9864), lè l sèvi avèk 1 kb ADN nechèl (Cat. # PG{010-55DI) ak visualized pa sistèm dokimantasyon jèl. Anplikon yo te pirifye ak sekans pa Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Version 6.0 ak menm seri primè yo. Yo te chèche sekans yo jwenn BLAST ki pa redondants sou baz done NCBI a, yo te enpòte nan lojisyèl MEGA 6.0, epi yo te aliyen ak algorithm nan misk Clustal W [43] epi yo te konstwi pye bwa a filogenetik ak metòd vwazen-jwenn MEGA 6.0 [44].
Estrikti chimik nan Taxol la ekstrè
Yo te retire tach yo nan Taxol nan plak jèl TLC yo epi yo te pirifye, epi yo te detèmine pite ak konsantrasyon pa analiz UV-Vis nan λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Seri) konpare ak Taxol natif natal. [39]. Medya vid nan menm kondisyon yo te itilize kòm yon debaz negatif pou analiz espektrofotometrik yo. FT-IR spectre nan echantiyon yo Taxol pirifye te analize pa JASCO FT-IR 3600 spectrophotometer. Echantiyon Taxol la te piye ak granules KBr, peze nan disk anba vakyòm, epi yo te mezire absòpsyon nan rejyon 400 a 4000 cm-1 [3], konpare ak yon sèl natif natal. Estrikti chimik ekstrè Taxol te konfime nan espektroskopi HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) konpare ak Taxol natif natal. Echantiyon yo te dissolve nan CDCl3, chanjman chimik yo bay nan ppm (δ-echèl), ak konstan yo kouple yo eksprime nan hertz (Hz).
Efè diferan kalite medya sou pwodiksyon taksol
De ploge agar (9 mm) ki soti nan kilti ki gen 7 jou nan chak izole chanpiyon yo te vaksinen an twa fwa nan 100 ml mwayen/250 ml Erlenmeyer flacon dextrose pòmdetè (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D, ak ekstrè malt (ME). ) medya bouyon. Kontwòl ki pa inokule ki soti nan chak medya ki gratis nan espò chanpiyon yo te itilize kòm yon kontwòl negatif, enkubasyon nan 30 degre pou 15 jou nan menm kondisyon yo. Apre enkubasyon, kilti chanpiyon yo te filtre, epi Taxol te ekstrè ak detèmine jan mansyone pi wo a.
Optimizasyon Bioprocess nan Kondisyon Nitrisyonèl yo Maksimize Sede Taxol la
Optimizasyon konpozisyon mwayen an pou maksimize rannman Taxol pa izole ki pisan plezi gal la te fèt pa metodoloji sifas repons lè l sèvi avèk konsepsyon Placket-Burman ki te swiv pa konsepsyon konpoze santral [17–20, 45]. Soti nan desen RSM yo, yo te evalye varyab pozitif ak enpòtan yo ki afekte pwodiksyon Taxol pa izole chanpiyon ki pisan lè l sèvi avèk pake lojisyèl estatistik pa Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Chak eksperyans te kouri nan twa replike byolojik epi yo te konsidere valè mwayèn yo. Apre enkubasyon nan kondisyon yo vle, byomass chanpiyon yo te filtre, ak Taxol te ekstrè ak quantifye pa TLC ak HPLC jan sa dekri pi wo a.
Placket-Burman Design
Placket-Burman konsepsyon yo te souvan itilize pou optimize eleman medya pou kwasans chanpiyon ak pwodiksyon metabolit segondè byoaktif, evalye varyab enpòtan ki afekte pwodiksyon Taxol [18, 20, 46]. Chwa faktè a te baze sou medya yo itilize nan tès depistaj kalitatif ak quantitative. Onz faktè yo te enkli; ekstrè malte, peptòn, sikwoz, soytone, glutamin, ekstrè vyann bèf, ak tanperati, pH, tan enkubasyon, ak valè vitès souke ak faktè yo te varye sou de nivo, ak nivo minimòm ak maksimòm yo te chwazi. Estatistik Design-Expert 7.0 te itilize pou jenere yon seri 12 eksperyans. Pou chak eksperyans, pwodiksyon Taxol te detèmine nan twa replike byolojik, epi yo te konsidere mwayèn pwodiksyon Taxol.
Yo te fè analiz regresyon done yo lè l sèvi avèk lojisyèl estatistik. Yo te kalkile efè chak varyab (Biometrika, 2020), lè l sèvi avèk ekwasyon sa a:
kote, E se efè yon varyab tès, M plis, ak M- se konsantrasyon Taxol nan esè nan paramèt la te nan nivo ki pi wo ak pi ba li yo respektivman, ak N se kantite eksperyans ki te fèt. Efè chak varyab sou pwodiksyon an te detèmine lè yo kalkile valè E respektif yo.
Kote Tot segondè se repons total yo nan nivo segondè, Tot ba se repons total yo nan nivo ki ba a, epi Non se kantite esè.
Santral Konpozisyon Konsepsyon ak Entèraksyon Ant Faktè Ki Afekte Pwodiksyon Taxol
Faktè pozitif ki pi enpòtan ki afekte pwodiksyon Taxol pa sele chanpiyon iso late yo te optimize lè l sèvi avèk yon kalite sifas repons CCD modèl eksperimantal konsepsyon [47]. Lè w itilize CCD, yo te optimize konsantrasyon eleman mwayen yo, epi yo te itilize entèraksyon etid yo pou jenere yon total 20 eksperyans pou twa varyab yo. Pou detèmine nivo pi bon nan varyab yo pou pwodiksyon Taxol soti nan izole chanpiyon ki pisan yo, yo te trase koub sifas repons ki genyen twa dimansyon (3D) pou etidye entèraksyon ki genyen ant divès faktè ak detèmine kondisyon varyab chak faktè ki afekte pwodiksyon Taxol. Grafik 3D yo te pote soti nan kenbe konstan twa faktè 'nan yon nivo ideyal ak trase repons lan jwenn nan sede Taxol pou diferan nivo de lòt faktè yo.
Efè Gamma Irradiation sou Taxol Yield
Izolasyon andofitik ki pisan ki pwodui Taxol te ekspoze a iradyasyon ak 60sous Cobalt (selil Gamma 4000-A-India) nan diferan dòz radyasyon gamma (0.25-3.0 kGy) konpare nan kontwòl kilti ki pa iradyasyon an; yon pousantaj dòz 1.2 kGy/h nan moman eksperyans yo. Medya yo optimize yo te inoculé pa kilti iradyasyon an anba kondisyon kiltirèl estanda, konpare ak inoculum spore ki pa iradyasyon an kòm kontwòl. Kilti yo te enkube a 30±2 degre pou 15 jou sou yon shaker rotary (120 rpm). Apre enkubasyon, kilti yo te filtre epi Taxol te ekstrè, pirifye, ak quantifye pa TLC ak HPLC jan sa dekri pi wo a.
Sentèz ak karakterizasyon nan nanopartikil lò (AuNPs); Konjigezon ak Taxol
Aktivite Antikansè Taxol
Aktivite Taxol pirifye ak Taxol-PVP-AuNPs konjige kont kansòm fwa (HPG2), ak kansòm tete (MCF7) te detèmine pa 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-difenil tetrazolyom bromur (MTT) tès [48]. Plak 96-byen an te simen ak 103 selil pou chak pi, epi enkubasyon lannwit lan nan 37 degre, Lè sa a, diferan konsantrasyon dwòg la te ajoute, epi plak yo te re-enkube pou 48 èdtan. Yo te ajoute reyaktif MTT a (25 ul), epi enkube pou 2 èdtan, epi yo te mezire koulè wouj violèt konplèks formazan devlope nan λ570 nm. Valè IC50 te eksprime pa kantite dwòg diminye kwasans lan nan 50 pousan nan yon premye kantite selil timè nòmalize nan kontwòl pozitif.
Aktivite antimikwòb Taxol ak konjige Taxol-AuNPs
Aktivite antimikwòb konjige Taxol ak Taxol-AuNPs te evalye kont diferan izolasyon bakteri; Bacillus subtilis ATCC 6633 ak Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, ak Enterobacter agglomerans, anplis Candida albicans. Selil bakteri teste yo te sispann nan dlo peptone esteril pou jwenn inoculum estanda ~0.5 McFarland (1–1.5)× 1{{10}}8 CFU/ml nan λ6{{18. }}0 nm. Anpèchman kwasans (mm) kwasans patojèn mikwòb yo te evalye pa metòd difizyon disk agar. Disk antibyotik estanda esteril ak yon dyamèt 6.0 mm yo te itilize kòm kontwòl pozitif. Disk antibyotik esteril (6.0 mm) yo te chaje ak 20 ul metanol ak asid amoxicillin-clavulanic (AMC) kòm yon kontwòl negatif ak pozitif. Disk yo te chaje ak menm konsantrasyon Taxol, Taxol-PVP-AuNPs, ak AuNPs (1.0 ug/ml). Twa replike byolojik yo te prepare. Plak yo te enkube a 37 degre pou 24 èdtan, epi yo te mezire zòn anpèchman yo. Amoxicillin clavulanic acid (AMC) ak nistatin yo te itilize pou nòmalize aktivite antimikwòb Taxol. Zòn anpèchman kwasans lan te detèmine pa yon kalib vernier (mm).
Analiz estatistik
Pi piti diferans enpòtan Fisher nan tès post hoc.
Depozisyon chanpiyon
Rezilta yo
Izolasyon fongis andofitik nan Jojoba; Depistaj pou Pwodiksyon Taxol
Vennkat izolan chanpiyon andofitik yo te refè nan jape, brendiy, fèy, ak boujon jojoba ki te chaje sou mwayen PDA, CZD ak ME. Izolasyon chanpiyon sa yo te sòti nan jape (6 izole), brendiy (7 izole), fèy (4 izole), ak boujon (7 izole) jan yo anrejistre nan Tablo 1. Izolasyon chanpiyon sa yo te okòmansman idantifye nan nivo espès yo baze sou mòfolojik yo. karakteristik dapre kle yo inivèsèl, ki fè pati twa jenera, sètadi Aspergillus, Penicillium, ak Fusarium. Pami izolat sa yo, yo te rapòte prevalans genus Aspergillus (83.4 pousan), pandan ke Fusarium ak Penicillium te reprezante pa 8.3 pousan. Genus Aspergillus te reprezante pa senk espès, sètadi A. favus (3 izole), Aspergillus oryzae (5 izole), A. niger (5 izole), A. fumigatus (4 izole), ak A. terreus (3 izole). Pwodiktivite Taxol pa izole chanpiyon refè yo te evalye pa grandi sou PDB, enkubasyon nan kondisyon estanda yo, ekstraksyon, ak quantification Taxol pa TLC ak HPLC (Fig. 1). Soti nan rezilta yo, pwodiktivite maksimòm Taxol te rapòte pa A. favus Bd1 (88.65 µg/l), ki te swiv pa P. polonicum Br1 (54.42 µg/l), A. niger Lv1 (43.95 µg/l), A. oryzae Bd1. (38.87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26.80 µg/l), A. niger Lv2 (23.{01 µg/l), ak A. fumigatus Bd2 (17.62 µg/l). l). Idantite chimik estriktirèl Taxol ki soti nan pi gwo pwodiktè chanpiyon yo te revele nan spectre UV-Vis yo, konpare ak espèk chimik Taxol natif natal la. Anplis de sa, estrikti chimik Taxol ekstrè soti nan kat izolat ki pi pisan plezi yo te valide pa analiz FT-IR (Fig. 1). Remakab, Taxol la ekstrè soti nan izole chanpiyon ki pisan yo parèt menm paradigm espektral Taxol natif natal. Pik la nan 3393.3 cm-1 te asiyen pou hydroxyl (OH). Pandan ke pik yo nan 2923.5 yo te asiyen nan detire CH alifatik la, pik yo nan 1661.0 cm-1 koresponn ak frekans detire C{=O. Pik la obsève nan 1452.0-1404.0 cm-1 te akòz frekans NH etann. Yo te obsève frekans etann gwoup-oksijèn kabònil la nan 1109 cm-1. Pik yo obsève nan seri a 1020-979.7 cm-1 te akòz prezans nan C ak H vibe aromat. Soti nan analiz kwomatografik ak espèk yo, li ta ka konkli ke Taxol la ekstrè se ki idantik ak youn nan natif natal. Aparamman, aktivite metabolik nan menm espès chanpiyon yo te varye anpil ak diferan plant yo, asire inik entèraksyon byolojik ak divilgasyon siyal espesifik ki soti nan pati plant la pou deklanche ekspresyon sistèm nan machin nan byosentèz Taxol. Enteresan, fluctuation nan sistèm metabolik la pa sèlman depann sou pati plant yo, men tou sou entèraksyon izole-izole, pou egzanp, pwodiksyon an Taxol nan izole A. niger ki rete nan fèy yo nan jojoba te 43.9 µg / l, pandan y ap sede a nan Taxol te zewo pou izole A. niger nan refè nan jape plant la.
Idantifikasyon mòfolojik ak molekilè pwodiktè Taxol ki pisan yo
Karakteristik mòfolojik ki pisan chanpiyon izole pwodwi Taxol yo te egzamine dapre makroskopik ak mikwoskopik kle deskriptif yo, jan sa dekri nan Materyèl ak Metòd, ak revele pwoksimite mòfolojik li yo ak A. favus (figi 2). Te izole chanpiyon an grandi sou PDA nan 30 degre pou 10 jou ak makroskopik ak mikwoskopik karakteristik yo te revele idantite li yo tankou tèt konidyal, mòd branch, idantite stigma, ak ontoloji konidyal, ak fòmasyon kò fruktifikasyon, dapre inivèsèl la. kle mòfolojik [33], epi yo te jwenn yo ki idantik ak Aspergillus favus. Te pisan Taxol-pwodwi izole A. favus la plis idantifye ki baze sou sekans ITS yo, lè l sèvi avèk gDNA kòm yon modèl. Anplikon PCR yo (~ 550 bp) nan A. favus yo te rezoud, pirifye, ak sekans (Fig. 2). Sekans ITS nan A. favus te eksplozyon ki pa redondant fouye sou baz done NCBI, ki montre 99 pousan resanblans ak A. favus, ak zewo E. valè, ak kouvèti rechèch 95 pousan. Kidonk, nan analiz mikwoskopik ak molekilè yo, yo te konfime izole sib la kòm A. favus epi depoze sou GenBank ak nimewo asansyon MW485934.1, epitou izole a te depoze nan Sant Mikolojik Inivèsite Assiut (AUMC), peyi Lejip ak yon nimewo depozisyon AUMC13892. Izolasyon aktyèl la te gen 99 pousan resanblans ak izole A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,
Fig. 1 Yon View mòfolojik nan plant jojoba. B Kilti plak ki pisan fongis andofitik ki pwodui Taxol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23), ak A. oryzae Bd (25) sou PDA apre 8 jou o enkubasyon nan 30 degre. Izolasyon chanpiyon yo te grandi sou PDB, ak enkubasyon nan kondisyon estanda yo, ak Taxol te ekstrè ak tcheke pa TLC (C). D HPLC chromatogram Taxol ki soti nan izolat chanpiyon ki pisan yo. E Sede Taxol jan yo mezire nan HPLC. F, UV-Vis analiz espèk nan ekstrè Taxol soti nan izole chanpiyon yo. G FT-IR analiz de extrait Taxol konpare ak natif natal
Fig. 2 A Karakteristik makromorfolojik A. favus yon andofit jojoba apre 3, 5, ak 8 jou kwasans sou PDA. Karakteristik mikwo-mòfolojik, tèt konidyal nan A. favus pa agrandisman 400X. C PCR anplikon nan rejyon A. favus ITS nan 500 bp, nòmalize a 1 kb nechèl (Cat.#. SM0312). D Analiz filogenetik ITS A. favus pa metòd maksimòm chans [44]
