Chapter 2: Krϋppel-like Factor 15 Supprimer glomerulèr ren pwoliferasyon selil mesanjyal atravè Amelyore P53 SUMO1 konjigezon
May 12, 2022
Pou plis enfòmasyon. kontaktetina.xiang@wecistanche.com
3 REZILTA
3.1|Depistaj jèn ki lye KLF15-nan ChIP-Seq nan MC glomerulè ren prensipal yo
Pou idantifye jèn patnè dirèk KLF15 yo, nou te fè analiz ChlP-Seq epi finalman nou teste 2478 jèn. GO analiz jèn sa yo atravè zouti nan sitwèb www.uniprot.org (Figi 1A, B) te revele tèm fonksyon molekilè ki asosye ak jèn 1941, tèm eleman selilè ki gen rapò ak jèn 1662 ak tèm pwosesis byolojik ki gen rapò ak jèn 1766. Piske objektif nou se te chèche konnen ki jan KLF15 afekte MC yo, nou konsantre sou jèn ki gen rapò ak pwosesis selil yo. Pami 1315 jèn ki gen rapò ak pwosesis selil yo, yo te jwenn 74 jèn yo patisipe nan pwosesis sik selil; espesyalman, jèn sa yo te patisipe nan sik selil mitotik, tranzisyon faz sik selil ak lòt pwosesis (Figi 1C, D). Anplis de sa, nou analize jèn ki enplike nan kwasans epi nou jwenn ke yo te gen rapò ak kwasans devlopman, kwasans selil ak lòt kalite kwasans (Figi 1E).
3.2|Depistaj jèn ki kontwole diferan nan KLF15-ki twòp eksprime MC glomerulè ren yo lè l sèvi avèk SILAC ak LC/MS
SILAC ak LC/MS analiz de HRMCs overexpressing KLF15 konpare ak selil paran yo te mennen nan idantifikasyon nan 1357 pwoteyin. Nou itilize DAVID ak IPA pou jwenn domèn GO ak chemen ki rich nan pwoteyin ki kantite SILAC idantifye. Enteresan, tèm ki gen rapò ak fonksyon byolojik anpil pwoteyin yo te pami 30 pi gwo tèm GO siyifikativman anrichi, ki gen ladan règleman pwosesis metabolik selilè asid amine, konplèks proteazom, pwoteyin obligatwa, ak transkripsyon ak tèm tradiksyon, yo tout ki gen rapò sere ak. ubiquitination (Figi 2A). Figi 2B montre 30 pi gwo tèm chemen anrichi yo. Plizyè tèm pwosesis byolojik, ki gen ladan tèm proteazòm ak maladi neurodegenerative, yo te gen rapò tou ak ubiquitination.
Klike pou w konnensistanchpou vann ak detay
3.3|Analiz byoenfòmatik KLF15-jenn obligatwa ki potansyèlman asosye ak pwopagasyon glomerulèr ren MC
Pou eksplore KLF15-jenn ki ka asosye avèk yoglomerulè renPwopagasyon MC, nou te fè yon analiz byoenfòmatik done ChIP-Seq ak done SILAC-LC/MS. Senkant-de jèn yo te tès depistaj (Tablo 2 ak Figi 2C), ak senk nan jèn sa yo, ki gen ladan SUMO1, macrophage migration inhibitory factor (MIF), ekaryotic inisy factor (EIF), ensilin-like growth factor (IGF) ak reticulocalbin (RCN). ), yo te gen rapò akpwopagasyon selilè. Depi analiz GO ak chemen pwoteyin yo eksprime diferansye yo sijere ke jèn tès depistaj yo te gen rapò sitou ak pwosesis ubiquitination la, nou konkli ke SUMO1, yon manm fanmi pwoteyin ki tankou ubiquitin (UBL), patisipe nan modifikasyon pòs-tradiksyon menm jan ak ubiquitination kòm jèn sib KLF15.
Ogmante kantite prèv te endike ke HG se youn nan pi gwo faktè ki pwovoke devlopman nan nefropati dyabetik, epi li ankouraje pwopagasyon MC ak ogmante sentèz matris nan vitro.25Yon etid anvan te montre ke PDGF-BB se esansyèl pou pwopagasyon MC anvan devlopman an. nan glomerulosclerosis nan glomerulosclerosis eksperimantal.26 Apre konfime ke MC yo te ankouraje pa HG oswa PDGF-BB an vitro, nou detekte chanjman nan ekspresyon KLF15 ak SUMO1 nan tou de RNA a ak pwoteyin.
nivo epi li te jwenn ke molekil sa yo te gen tandans menm jan an (Figi 2D-l). Finalman, nou detèmine SUMO1 kòm jèn sib KLF15.
3.4|KLF15 kontwole ekspresyon jèn SUMO-1 lè li lye nan yon rejyon pwomotè CACCCA-SUMO-1 16 bp ak yon motif C plis A ki rich.
Nou te itilize MEME suite(http://meme-suite.org/tools/meme) pou karakterize motif KLF15-obligatwa 52 jèn tès depistaj yo ki soti nan done KLF15 ChlP-Seq yo epi nou idantifye motif KLF-obligatwa a. (Figi 3A).Anplis de sa, nou analize plis pase mil baz en pwomotè SUMO1 la epi nou te jwenn ke KLF15 te kapab rekonèt ak mare nan yon sekans 16 bp (nukleotid -205 ~ -199) ki gen ladan - CACCCA-(Figi 3B) .ChIP-PCR konfime ke KLF15 mare nan pwomotè SUMO1, ak rezilta yo te montre siyifikativman pi wo ekspresyon de SUMO1 nan gwoup antikò anti-KLF15 pase nan gwoup kontwòl background (Figi 3C).
Anplis de sa, nou te fè yon tès repòtè doub-luciferase pou konfime relasyon vize ant SUMO1 ak KLF15. Gwoup pwomotè SUMO1 sovaj la te montre pi wo aktivite luciferase pase vektè pGL3 ak gwoup mutan nan HRMC yo, e aktivite a te siyifikativman ogmante pa ekspresyon KLF15. Amelyorasyon yo nan aktivite luciferase yo te ranvèse pa transfèksyon ak yon plasmid ki eksprime rejyon an pwomotè mutan (Figi 3D). Ansanm, done sa yo sijere ke SUMO1 se yon sib transkripsyon dirèk nan KLF15.
3.5 |Depistaj P53 kòm substra SUMOylation SUMO1
Modifikasyon SUMO yo lajman eksprime modifikasyon apre tradiksyon nan ekaryot. Konjigezon revèsib nan modifikasyon sa yo nan pwoteyin substra yo konnen tou kòm SUMOylation, ki jwe yon wòl enpòtan nan reglemante fonksyon pwoteyin sib yo ak plis patisipe nan divès pwosesis byolojik, tankou transpò nukleositoplasmik, règleman transkripsyon, apoptoz, estabilizasyon pwoteyin, repons estrès ak. Pwogresyon sik selilè.27 Pou eksplore molekil siyal enskripsyon yo dirèkteman konjige pa SUMO1, nou te fè yon analiz rezo SUMO1 lè l sèvi avèk baz done IPA a, ak done yo te montre ke SUMO1 te kapab dirèkteman kon-jige nan P53, APP, JUN ak AKT, pami lòt. pwoteyin (Figi 4A-C). Okòmansman, nou te chwazi P53 kòm yon molekil en SUMO1 paske li se yon pwoteyin byen li te ye ki gen rapò ak pwopagasyon selil yo.28.29 Anplis de sa, nou te itilize lojisyèl SUMOsp pou predi posib sekans SUMOylation nan P53invariousspecies epi nou te jwenn ke P53 te gen sekans SUMOylation la（ Figi 4D). Pou detèmine si P53 se vre modifye pa SUMOylation, nou transfekte HRMCs tanporèman ak yon plasmid SUMO1 overexpression oswa SUMO1 siRNA. Tou de rezilta IP ak Western blot revele tandans nan chanjman ekspresyon nan SUMO1-P53 ak P53 ki te konsistan avèk chanjman yo. nan SUMO1 (Figi 4E-J). Done sa yo endike ke P53 se yon substrate SUMOylation nan SUMO1.
3.6 |KLF15 anpeche pwopagasyon MC pa ankouraje ekspresyon SUMO1 ak P53 SUMOylation.
Pou etabli règleman P53 SUMOylation ak pwopagasyon MC pa KLF15 ak SUMO1, nou te entèveni ak ekspresyon KLF15 oswa SUMO1 nan HRMCs ak trete HRMCs ak PDGF-BB. Pami HRMC yo trete PDGF-BB, selil transfekte ak plasmid KLF15 overexpression te montre pi wo ekspresyon SUMO1-P53, P53, KLF15 ak SUMO1 pase selil transfekte ak plasmid kontwòl KLF15 la. Menm chanjman sa yo nan SUMO1-P53, P53 ak SUMO1 yo te jwenn nan selil SUMO1 ki te transfekte plasmid twòp ekspresyon, alòske ekspresyon KLF15 pa t chanje nan selil sa yo (Figi 5A-F). PDGF-BB se youn nan faktè kwasans ki pi efikas nan MCs ki dekri jiskaprezan, epi yo te obsève repons proliferatif HRMC yo nan PDGF-BB. Jan yo montre nan Figi 5G, H, pousantaj selil EdU-pozitif yo te siyifikativman ogmante pa administrasyon recombinant PDGF-BB. Rezilta tach EdU yo endike ke tou de KLF15 ak SUMO1 twòp ekspresyon anpeche pwopagasyon selil PDGF-BB-induit (Figi 5G, H).
Pou jwenn plis insight sou wòl KLF15 ak SUMO1 nan pwopagasyon HRMCs, nou transfekte selil ak sèlman SUMO1 siRNA oswa kotransfekte yo ak SUMO1 siRNA ak yon plasmid overexpression KLF15. Regilasyon anba nan SUMO1 pa te afekte ekspresyon KLF15, men nivo ekspresyon SUMO 1-P53 ak P53 te evidamman diminye apre transfeksyon siRNA SUMO1 (Figi 6A-C). Anplis de sa, lè ekspresyon SUMO1 te anpeche, nivo ekspresyon SUMO1-P53 ak P53 yo te siprime menm nan selil ki twòp KLF15 (Figi 6D-F). Lè sa a, yo te evalye pwopagasyon MC lè l sèvi avèk yon tès tach EdU. SUMO1 RNAi amelyore efè proliferasyon PDGF-BBon HRMC yo, ak gwoup la ki te kotransfekte ak plasmid la overexpression KLF15 ak SUMO1 siRNA te gen plis selil EdU-pozitif pase gwoup la cotransfected ak plasmid la overexpression ak siRNA kontwòl sekans ibrid (Figi 6G, H) . Se poutèt sa, nou konkli ke KLF15 siprime pwopagasyon MC pa amelyore P53 SUMOylation.
3.7|Ekspresyon mondyal SUMO1 ak P53 nan MC glomerulè yo gen yon relasyon negatif ak pwopagasyon MC nan nefrit Thy-1 rat.
Anti-Thy1 nefrit se yon modèl klasik nan glomerulonefrit pwoliferatif mezanjyal oto-limite ak yon faz proliferatif ak yon faz rekiperasyon. Nou te enjekte yon antikò Thy1 nan rat Wistar pou kreye modèl sa a. Tou de nitwojèn ure serom ak kreyatinin pa gen okenn chanjman enpòtan ant rat kontwòl ak rat modèl yo (Figi S1). Yo te obsève pwopagasyon mezanjyal ak akimilasyon ECM pandan faz proliferasyon (jou 5 ak 7) nan rat modèl yo, ak kantite MC yo te diminye pandan faz rekiperasyon an nan jou 10 (Figi 7A). Nou menm tou nou detekte chanjman ekspresyon yo nan makè pwopagasyon selil PCNA pa IHC (Figi 7A, B). Nivo PCNA yo te ogmante nan jou 5, pik nan jou 7 ak diminye nan jou 10 (Figi 7F). Analiz Western blot te montre ke ekspresyon pwoteyin P53, SUMO1 ak KLF15 nan glomeruli izole te pi ba nan gwoup modèl yo pase nan gwoup kontwòl la (Figi 7C, D), ki konsistan avèk rezilta imunohistochimik yo (Figi 7E, F). Rezilta sa yo endike ke pwopagasyon nòmal nan MCs nan rat modèl anti-Thy1 gen rapò ak ekspresyon nan nivo ki ba nan KLF15 ak SUMO1. Entèferans ak ekspresyon molekil sa yo espere soulaje fenotip patolojik nan rat.
4 DISKISYON
Laglomerulise inite filtraj yo nanren. Dezòd fonksyon glomerulè yo ka koze pa patoloji glomerulè prensipal oswa yo ka segondè nan maladi sistemik. Chanjman mezanjyal yo te wè apre aksidan glomerulè ki gen ladan ipèproliferasyon nan MC ki te swiv pa pwodiksyon twòp nan ECM (ekspansyon mesangial) ak pwodiksyon chemoattractant pou selil enflamatwa. Se poutèt sa, modulasyon repons MC, espesyalman pwopagasyon nòmal, se yon nouvo apwòch terapetik. KLF15 se yon pwoteyin ki jwe yon wòl regilasyon kòm yon faktè transkripsyon pa obligatwa nan sekans ADN espesifik. Anpil etid rapòte ke KLF15 patisipe nan règleman pwopagasyon selil yo. Pou egzanp, li te jwenn ke KLF15 patisipe nan anpèchman nan MC pwopagasyon ki gen rapò ak siyal chemen, 15,30 men jèn dirèk sib li yo pa te rapòte nan literati a. Se poutèt sa, etid sa a enplike sitou tès depistaj jwenti nan nivo transkripsyon ak tradiksyon yo idantifye jèn sib dirèk nan KLF15.
KLF15 kontwole jèn diferan nan diferan espès ak nan diferan tisi ak ògàn. Nan pwosesis pou kontwole pwopagasyon MCs, KLF15 afekte ekspresyon plizyè jèn epi patisipe nan plizyè chemen.131,32 Pou eksplore jèn sib dirèk KLF15, nou te itilize ChIP-Seg.Klein RH ak kòlèg li yo te itilize ChlP-seq. Teknoloji pou etidye règleman KLF7 sou diferansyasyon selil epitelyal kornye yo.33 Ying M et al te itilize teknik sa a pou etidye efè inhibition KLF9 sou pluripotence glioblastoma.34Konpare ak ChlP-chip, ChIP-Seq pèmèt vrè analiz genòm antye. ak pi wo rezolisyon, pi wo sansiblite deteksyon ak pi ba demann gwosè echantiyon.35 Nou itilize ChP pou jwenn fragman ADN yo dirèkteman mare pa KLF15, epi apre konparezon ak analiz ak GenBank, nou tès depistaj 2478 jèn sib posib. Atravè analiz GO ak chemen, nou idantifye anpil jèn sib ki enplike nan sik selil ak pwosesis pwopagasyon.
Eksperyans ChlP-Seq mande pou PCR pou anplifikasyon siyal deteksyon an, ak kèk degre patipri pandan pwosesis anplifikasyon an inevitab. Anplis de sa, ChIP-Seq jwenn sèlman jèn yo ke KLF15 ka mare epi li pa endike chanjman ki fèt nan ekspresyon jèn sa yo lè ekspresyon KLF15 chanje. Nou itilize analiz pwoteomik SILAC-LC/MS pou konpanse enpèfeksyon sa yo. Teknik sa a bay enfòmasyon sou tout pwoteyin ki gen ekspresyon chanje lè yo reglemante pa KLF15, ki gen ladan pwoteyin yo dirèkteman reglemante pa KLF15 ak pwoteyin ki endirèkteman reglemante oswa apre-tradiksyon modifye. HRMC yo te kiltive lè l sèvi avèk SILAC, ak KLF15 te overexpressed nan selil yo atravè transfeksyon plasmid. Pwoteyin yo te kolekte pou deteksyon LC/MS, epi yo te jwenn 1357 pwoteyin diferan eksprime. GO ak analiz chemen yo te revele ke kèk nan pwoteyin diferan eksprime yo te enplike nan ubiquitination. Done jèn ak pwoteyin yo te kwaze. Jèn ki pa gen rapò ak objektif rechèch la ak jèn ki pa dirèkteman reglemante pa KLF15 yo te retire; finalman, yo te teste 52 jèn. Pami sa yo, yo te chwazi senk jèn ki gen diferans ekspresyon ki pi evidan ki te gen plis rapò ak pwopagasyon. Bay rezilta yo konbine nan analiz chemen, SUMO1 ak KLF15 analiz ekspresyon nan pwopagasyon HRMCs, ChlP-PCR ak tès repòtè doub-luciferase, pwoteyin SUMO1 la te chwazi kòm jèn nan sib nan KLF15.
Anplis de ubiquitin, ogmante kantite UBLproteins, 3637 ki gen ladan SUMO, 38 neral precurseur selil-eksprime, devlopman desann-reglemante 8(NEDD8)3940 ak entèferon-stimile jèn 15(ISG15),41 yo te idantifye. Pwoteyin modifye sa yo byen kontwole yon varyete de pwosesis byolojik. Adisyon kovalan SUMO nan substrats, ki rele SUMOylation, se yon modifikasyon apre tradiksyon ki enplike nan yon seri de pwosesis selilè, ki gen ladan transpò nikleyè-sitosolik, règleman transkripsyon, apoptoz, kontwòl estabilite pwoteyin, repons estrès ak pwogresyon sik selilè.27SUMO se tipikman. tache ak résidus lizin akseptè nan substra pwoteyin ki ebèje yon sekans konsansis epi kontribye nan règleman an nan entèraksyon pwoteyin-pwoteyin kòm byen ke nan compartimentalizasyon subselilè ak estabilite pwoteyin.2 sUMO1, kòm yon manm nan fanmi an SUMOS, ka afekte pwopagasyon selil pa modifye substra. ak estabilize pwoteyin sik selilè regilasyon.43 Se poutèt sa, konbine avèk rapò literati a ak rezilta tès depistaj ak analiz konplè, nou konsantre sou fason KLF15 kontwole efè SUMO1 sou pwopagasyon selil mesangyal.
Pou idantifye substrats SUMO1, nou te fè yon analiz rezo SUMO1 lè l sèvi avèk baz done IPA ak lojisyèl SUMOsp. Konbine ak rechèch pibliye sou P53, done premye tès depistaj nou an sijere P53 kòm yon molekil en SUMO1 ak sekans SUMOylation YKxD/E. Etid anvan yo te montre ke P53 se te yon substra nan SUMOylation,45 ak amelyore P53 SUMO1 konjigezon ankouraje estabilite ak aktivite nan P53 ak pwovoke se-nesans.46 Nan etid nou an, entèferans ak ekspresyon nan SUMO1 nan HRMC yo te pwodwi menm tandans chanjman nan SUMO1-P53 ak P53, ki endike ke P53te yon substrate SUMOylation SUMO1.
Prèv émergentes yo endike ke SUMOylation ak de-SUMOylation jwe wòl nan anpil maladi nefropatik, tankou disgenèz ren, kansòm ren, maladi glomerulèr, apoptoz podosit, ak ipèrtonisite medul ren, blesi ren egi ak nefrolitiaz.7-51 Pou klarifye a. relasyon ant KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation ak pwopagasyon MC, nou te fè yon seri de tretman transfèksyon sou selil ki te sibi pwopagasyon PDGF-BB-induit. Ekspresyon KLF15 te kontwole ekspresyon SUMO1, pandan y ap ekspresyon SUMO1 pa t afekte ekspresyon KLF15. Swa KLF15 oswa SUMO1 twòp ekspresyon ogmante SUMOylation nan P53 ak antagonize pwopagasyon selil la pwovoke pa PDGF-BB. Lè ekspresyon SUMO1 te anpeche, SUMOylation P53 te tou anpeche, ak KLF15 te pèdi efè antagonis li sou pwopagasyon selil. An vivo. pwopagasyon nan MCs piti piti ogmante ak agravasyon nan nefrit pwopagatif mezanjyal, pandan y ap ekspresyon nan KLF15, SUMO1 ak P53 diminye anpil. Lè nou konsidere obsèvasyon yo entegre nan selil ak tisi, nou preliminèman konkli ke KLF15 kontwole SUMOylation nan P53 nan SUMO1, kidonk anpeche pwopagasyon MC.
5 KONKLIZYON
Gen kèk etid ki endike ke KLF15 jwe yon wòl enpòtan nan reglemante pwopagasyon MCs. Nan travay sa a, nou te eksplore mekanis repwesyon pwopagasyon MC medyatè pa faktè transkripsyon sa a. Nou idantifye SUMO1 kòm sib prensipal KLF15 nan MCs atravè analiz byoenfòmatik ki enplike ChIP-Seq ak SILAC-LC/MS. Anplis de sa, avèk èd nan baz done IPA a ak lojisyèl SUMOsp, nou detèmine ke P53 te yon substra dirèk nan SUMO1. Eksperyans nan vitro ak nan vivo konfime ke KLF15 te kapab ankouraje ekspresyon SUMO1 ak SUMOylation nan P53 Lè sa a, anpeche pwopagasyon MCs (Figi S2). Rezilta sa yo kontribye nan konpreyansyon sou wòl regilasyon KLF15 nan pwopagasyon MC epi yo bay yon baz teyorik pou jwenn nouvo tretman pou maladi ren ki gen rapò ak pwopagasyon MC.
