Karakterizasyon Asid Kafeoylquinic Soti nan Lepisorus Thunbergianus Ak Aktivite Inibisyon Melanogenesis Yo

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung,* ak Kooyeon Lee*

REZIME:Ipèpigmantasyon ki soti nan overactivation nan tirozinaz mennen nan tach ki pi fonse oswa plak sou po imen an. Malgre ke fenomèn sa yo inofansif, toujou gen gwo demann pou inibitè melanogenesis pou anpeche ipèpigmantasyon pa anpeche tirozinaz, yon anzim ki limite pousantaj nan melanogenesis. Malgre ke Lepisorus thunbergianus yo te itilize nan folkremedies kòm yon ajan dyurèz ak emostatik, efè li sou melanogenesis poko rapòte. Nan etid sa a, nou te prepare yon ekstrè L.thunbergianus ak fraksyon sòlvan li yo epi evalye aktivite byolojik yo kont sentèz radikal gratis ak melanin. Ekstrè L. thunbergianus anpeche aktivite tirozinaz djondjon pi efikas pase, ak aktivite antioksidan ki sanble ak arbutin nan vitro. Evalyasyon konparatif nan aktivite anti-melanogenesis ak anti-tirozinaz nan L. thunbergianus sòlvan fraksyon te demontre ke, pa anpeche aktivite tirozinaz, fraksyon nan butanol gen potansyèl ki pi wo pou anpèchman nan melanogenesisin selil melanom. Nou te jwenn pa analiz estriktirèl lè l sèvi avèk segondè-pèfòmans likid chromatografi (HPLC) ak NMR spectroscopythat konpoze yo pi gwo nan fraksyon butanol yo te twa dérivés asid kafeoylquinic. Twa dérivés yo te gen menm aktivite radikalscavenging ak anti-tirozinaz nan vitro, pandan ke sèlman 5-asid kafeoylquinic te gen yon efè inhibition sou -MSH-inducedmelanogenesis. Efè inhibition 5-asid kafeoylquinic te verifye pa detèminasyon kontni melanin ak aktivite tirosinaz nan melanom apre yo fin trete selil yo ak yon konpoze komèsyal yo. Anplis de sa, nou te revele ke 5-asid kafeoylquinic inibit melanogenesis nan chelating yon kasyon kwiv ki soti nan yon konplèks kwiv-tirozinaz. Kidonk, 5-asid kafeylikinik oswa fraksyon butanol izole nan L. thunbergianus ta ka itil nan pwodui kosmetik kòm yon ajan blanchi po.

Cistanche tubulosa: ajan blanchi po a.

ENTWODIKSYON

Melanin, yon gwoup pigman natirèl yo jwenn nan pifò òganis, jwe yon wòl enpòtan nan mawon fwi, fongis, ak legim ak pigmantasyon nan po imen an.1 Melanin ki pwodui nan tirozin asid amine atravè yon pwosesis milti-etap ki gen ladan oksidasyon anzimatik ak polimerizasyon. 2 Inhumans, melanin pigman se sentetize pa melanosit selil dendritik espesyalize ki sitiye nan junction ant epidèm ak dèrm kote sentèz inisye pa ekspoze a reyon iltravyolèt (UV). konsa, koulè po a detèmine pa modèl distribisyon pigman melanin lan.2 Disregulasyon sentèz enmelanin mennen nan anpil fòm ipèpigmantasyon, tankou melasma, freckles, tach laj, lentigo solè, ipèpigmantasyon apre enflamatwa, ak lòt sendwòm ipèpigmantasyon.4 Plis pase yon santèn pwoteyin yo gen rapò ak sentèz tomelanin, e pami yo, tirosinaz se anzim ki limite vitès la ke yo rekonèt kòm yo se sentèz fòmlanin responsab. tyrosinase inhibitors for the prevention of melanogenesis.1,6 Yon nimewo oftyrosinase inhibitors, such as kojic acid, arbutin, hydroquinone, azelaic acid, ellagic acid, and tranexamic acid, have beenpopularly itilize nan endistri a kosmetik kòm anti-melanogenesisagents; sepandan, akòz limit yo nan dwòg chimik, ki gen ladan sitotoksisite ak efè segondè, gen toujou mande nouvo materyèl ak sekirite amelyore, estabilite, ak efikasite.7

Pwodwi natirèl, ki gen ladan plant, bakteri, ak fongis, te vin tounen sous altènatif pou dekouvèt engredyan efikas pou blanchi po akòz pi piti toksisite yo ak pi bon byokonpatibilite ak byodisponibilite. oswa jape pye bwa yo epi li distribye nan rejyon tanpere nan Azi de Lès, tankou Kore, Japon, Lachin, Filipin, ak Indochina. L. thunbergianus te itilize kòm adiuretik, ajan emostatik epi li se antitussive nan folkremedies Koreyen. Etid anvan yo te rapòte ke yon ekstrè L. thunbergianus gen aktivite aktualite anti-lipid peroksidasyon nan aktivite lokal ak antioksidan.9 Anplis de sa, ekstrè L. thunbergianus te montre siyifikatif anpèchman kwasans ki depann de konsantrasyon nan kansè nan bouch ak selil kansè nan kolon.10 L. thunbergianusextract ka gen aplikasyon potansyèl. nan endistri kosmetik la paske plant sa a gen plizyè konpoze flavonoid ak anpil molekil byoaktif, ki enkli kercetin 3-methyl ether-glucoside, vitexin, oriental, periodical-glucoside, isovitexin, orientin, Corentin, ak caffeoylquinicacid.9a Sepandan, efè yo nan L. thunbergianus ekstrè onmelanin sentèz nan melanosit gen ankò yo dwe klè.

Figi 1. Analiz ekstrè L. thunbergianus pou (A) ABTS radikal scavenging, (B) anti-tirozinaz, ak (C) entracellular ROS scavengingactivities

Nan etid sa a, nou te prepare ekstrè L. thunbergianus ak fraksyon sòlvan li yo atravè fraksyon an seri epi nou te envestige efè inibisyon fraksyon sòlvan yo sou melaninbiosentèz nan selil melanom B16F10. Nou idantifye thebutanol (n-BuOH) fraksyon kòm yon gwo pòsyon ki gen inhibitor thenatural ak plis karakterize efè yo nan dérivés asid kafeoylquinic izole nan ekstrè yo L. thunbergianus sou anpèchman nan biosentèz melanin.

revizyon cistanche: anti-oksidasyon

REZILTA AK DISKISYON

Ekstrè etanòl nan L. thunbergianus Scavenges 2,2′-Azinobis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) Radical and Inhibits Tyrosinase Aktivite.

Ekstraksyon nan L. thunbergianus ak 70 pousan etanòl (EtOH) te fè pou evalye potansyèl aktivite inhibition nan konpoze natirèl nan plant la. Aktivite radikal scavenging ekstrè L.thunbergianus la te detèmine nan concentrationrange 2-200 ug/mL. Ekstrè etanòl la te montre aktivite depandan nan konsantrasyon radikal ak efè maksimòm nan 50 ug / mL nan ki rezilta a te konsistan avèk sa yo ki an arbutin itilize kòm yon kontwòl pozitif (Figi 1A).

Nou menm tou nou evalye efè a inhibition nan ekstrè nan aktivite tirozinaz djondjon nan mezire pousantaj la sentèz dopachrome katalize pa tirozinaz. Ethanolextract inibit 87 pousan nan aktivite tirozinaz nan 500 ug / mL, pandan y ap arbutin inibit sèlman 38 pousan nan aktivite tirozinaz nan konsantrasyon sa a (Figi 1B). Lè sa a, nou evalye aktivite scavenging ekstrè a sou ROSentraselilè ogmante pa 100 μM oksijene idwojèn. Tretman ak oksijene idwojèn pwovoke yon ogmantasyon apeprè 2.1-pliye nan nivo ROS intraselilè selil B16F10 (Figi 1C). Wefound ke ogmantasyon nan oksijene-medyatè nan intraselilè ROS te scavenged pa ekstrè a nan yon fason ki depann de dòz: aktivite a scavenging maksimòm nan 100 ug / mL te 78 pousan (Figi 1C). Rezilta sa yo sijere ke ekstrè nan etanòl nan L. thunbergianus gen engredyan byoaktif ki anpeche aktivite tirozinaz kòm byen ke scavengingABTS radikal ak entraselilè ROS.

cistanche deserticola ekstrè: inibit aktivite tirozinaz.

Potansyèl Inibisyon L. thunbergianus Fractionsagainst Melanogenesis.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, ki se ki konsistan avèk rapò anvan an.10bFurther, efè inhibition nan diferan fraksyon sòlvan aktivite onttyrosinase ogmante nan yon konsantrasyon-dependentmanner: aktivite yo maksimòm inhibitory nan n-Hex ak CH2Cl2fractions yo te pi ba pase 65 pousan, men sa yo ki nan EtOAc ak n-BuOHfraksyon yo te pi wo pase 70 pousan (Figi 2B). Aktivite inhibiteur a te nan lòd n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. .

Apre sa, efè fraksyon sòlvan L. thunbergianus sou pwopagasyon selil melanom yo te envestige nan trete selil B16F10 yo ak 200 ug/mL chak nan fraksyon diferan oswa 2mg/mL arbutin nan prezans nan yon -melanocyte-stimulatinghormone (-MSH), ki se byen li te ye pou ankouraje melanogenesis nan endiksyon faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi (MITF).11 Rezilta yo te montre ke okenn nan fraksyon yo te gen okenn efè enpòtan sou melanom cellproliferation (Figi 2C). Lè sa a, nou te envestige efè inhibitoryfraksyon sòlvan yo sou melanogenesis ankouraje pa -MSH nan selil melanom. Tretman ak -MSH pwovoke yon ogmantasyon de 2.0-pliye nan kontni melanin nan selil B16F10 (Figi 2D). Nou te jwenn ke -MSH medyatè melanogenesis te konplètman inibit pa fraksyon nan n-BuOH (p <0.01) ak="" pasyèlman="" inibit="" pa="" etoacfraction="" a="" (40="" pousan,="" p=""><0.01), pandan="" y="" ap="" -msh-medyatè="" melanogenesis="" pa="" te="" siyifikativman="" chanje="" pa="" n-hex.="" ak="" ch2cl2fractions="" (figi="" 2d).="" pli="" lwen,="" efè="" inhibition="" nan="" sòlvanfraksyon="" sou="" deklanchman="" tirozinaz="" medyatè="" pa="" -msh="" yo="" te="" detèmine="" depi="" tirozinaz="" jwe="" yon="" wòl="" kle="" nan="" melanogenesis.="" pa="" -msh,="" tandiske="" n-hex="" ak="" fraksyon="" ch2cl2="" pa="" t="" ',="" jan="" yo="" montre="" nan="" figi="" 2e.="" anplis,="" efè="" scavenging="" diferan="" fraksyon="" sòlvan="" sou="" ogmantasyon="" entraselilè="" ros="" te="" ankouraje="" pa="" oksijene="" idwojèn.="" tout="" fraksyon="" sòlvan="" ranvèse="" ogmantasyon="" entraselilè="" ros="" medyatè="" pa="" oksijene="" idwojèn,="" jan="" yo="" montre="" nan="" figi="" 2f.="" rezilta="" sa="" yo="" endike="" ke="" buohfraction="" nan="" l.="" thunbergianus="" inibit="" -msh-induit="" melaninsenthesis="" pa="" anpeche="" aktivite="" a="" tirozinaz="" intraselilè="" nan="" selil="" b16f10.="" anplis="" de="" sa,="" rezilta="" sa="" yo="" sijere="" ke="" engredyan="" byoaktif="" ki="" anpeche="" sentèz="" melanin="" yo="" te="" idrofil="" epi="" yo="" te="" sitou="" jwenn="" nan="" fraksyon="">

Figi 2. Efè fraksyon sòlvan sou ABTS radikal scavenging, anti-tirosinaz, ak aktivite anti-melanogenesis.

Idantifikasyon ak karakterizasyon BioactiveCompounds nan ekstrè L. thunbergianus.

Pou idantifye ak karakterize engredyan ki anpeche melanogenesis, yo te fè analiz segondè-pèfòmans kwomatografi likid (HPLC) pou tout fraksyon solvant. Analiz HPLC nan sòlvanfraksyon te revele ke tout fraksyon gen twa gwo konpoze nan tan retansyon nan 21, 28, ak 29 min pou konpoze 1, 2, ak 3, respektivman (Figi 3A-D). Twa gwo konpoze sa yo te izole plis pa pirifikasyon preparative HPLC. Selon rapò anvan an, kantite twa konpoze prensipal yo nan fraksyon n-BuOH yo te detèmine lè l sèvi avèk dérivés asid kafeoylquinic komèsyal yo kòm molekil estanda entèn yo.

Lè sa a, yo te idantifye konpoze izole yo pa konparezon done 1H ak 13C NMR yo ak literati a epi yo te jwenn yo an akò ak estrikti yo pwopoze yo (Figi 4).13 Figi 3E montre estrikti nan molekilè nan twa konpoze yo. Konpoze 1 (sede, 3.2 ± 0.1 mg/100 mg n BuOH fraksyon) te jwenn kòm yon poud jòn pal. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.66 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.49 (1H, d, J=15.9 Hz), 7.04 (1H, s), 6.99 ( 1H, d, J=8.2Hz), 6.78 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.23 (1H, d, J=15.9 Hz), 5.20( 1H, m), 5.08 (1H, brs), 4.89 (1H, brs) 4.13 (1H, m), 3.84 (1H, m), 3.56 (1H, s), 3.35 (1H, s), 1.99 (1H, s), m), 1.92 (1H, m), 1.89 (1H, m), 1.79 (1H, m). 13C{1H} RMN (100 MHz, DMSO-d6) δ (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65, 121.07, 115.75, 114.75, 114.71, 114.71, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65. Konpoze 1 te idantifye kòm 3-kafeoylquinicacid pa analiz RMN ak konparezon ak literati anvan an.13b

Konpoze 2 (sede, 14.1 ± 0.1 mg/100 mg n-BuOHfraksyon) te jwenn kòm yon poud jòn pal. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7.06 (1H, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79 (1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs), 4.70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1H, brs), 3.95 (1H, m), 1.97 (2H, m), 1.88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} RMN (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77, 125.54, 121.19, 115.76, 114.6.68, 114.68, 114.76, 114.68, 114.76, 114.76, 114.68, 114.76, 114. 68. 5. Konpoze 2 te idantifye kòm 5-asid kafeyliknik nan analiz NMR ak nan konparezon ak literati anvan an.13c

Konpoze 3 (sede, 3.9 ± 0.2 mg/100 mg n-BuOHfraksyon) te jwenn kòm yon poud jòn pal. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ 9.64 (1H, brs), 9.20 (1H, brs), 7.52 (1H,d, J=15.9 Hz), 7.06 (1H, s), 7.02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79 (1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs), 4.70 (1H, d, J=4.9 Hz), 4.12 (1H, brs), 3.95 (1H, m), 1.97 (2H, m), 1.88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} RMN (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77, 125.54, 121.19, 115.76, 114.6.68, 114.68, 114.76, 114.68, 114.76, 114.76, 114.68, 114.76, 114. 68. 5. Konpoze 3 te idantifye kòm 4-asid kafeyliknik nan analiz NMR ak nan konparezon ak literati anvan an.13a

Figi 3. Kwomatogram HPLC nan (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc, ak (D) n-BuOH fraksyon nan L. thunbergianus ak (E) estrikti nan twa gwo konpoze yo.

Inibisyon potansyèl de dérivés asid Caffeoylquinic izole nan L. thunbergianus kont Melanogenesis.

Apre sa, pou idantifye engredyan byolojik ki aktif ki kache ki pisan anti-melanogenesis la, nou detèmine aktivite inibisyon twa dérivés asid kafeoylquinic izole nan L. thunbergianus kont selil melanin sentèz melanin. Premyèman, efè twa dérivés sou ABTS radikal scavenging yo te envestige. Rezilta yo te montre ke twa dérivés yo te gen menm aktivite ABTS radikal scavenging (Figi 5A). Lè sa a, nou te envestige efè inhibitoryefè twa dérivés yo izole nan aktivite L. thunbergianus ontyrosinase. Twa dérivés yo te montre konsantrasyon-depandan anpèchman nan aktivite tirozinaz, ak anpèchman maksimòm nan yon konsantrasyon 200 μM (Figi 5B). Pli lwen, nou envestige efè a inhibition nan threederivatives yo sou sentèz melanin -MSH-induit nan B16F10cells. Tretman ak -MSH pwovoke yon ogmantasyon apeprè 2.0-pliye nan kontni melanin entraselilè B16F10cells (Figi 5C). Enteresan, konpoze 1 (3-kafeoylquinicacid) ak 3 (4-kafeoylquinic asid) siyifikativman ogmante sentèz melanin pa 25 ak 23 pousan, respektivman (Figi 5C, p< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Figi 4. Spectre 1H RMN nan (A) 3- asid kafeoylquinic, (B) 4- asid kafeoylquinic, ak (C) 5- asid kafeoylquinic ak spectre 13C RMN nan (D) {{ 6}}asid kafeylikkinik, (E) 4-asid kafeylikkinik, ak (F) 5-asid kafeylikkinik

Verifikasyon Efikasite Anti-Melanogenesis 5-Caffeoylquinic Acid.

Pou verifye efè inhibition {{0}}asid kafeoylquinic kont melanogenesis, nou detèmine efè inhibition nan sentèz onmelanin komèsyal {{{5-kafeoylquinic asid medyatè pa -MSH. Tretman ak pi ba konsantrasyon 0.1 ak 0.2 mM 5-caffeoylquinicacid yon ti kras ogmante sentèz melanin ak aktivite intracellulartyrosinase, pandan y ap pi wo konsantrasyon nan 0.5 ak 1mm nan konpoze an ranvèse - MSH-medyatè melanogenesis ak aktivite tirozinaz intraselilè (Figi 6A, B) nan ki rezilta yo konsistan avèk rapò anvan an.14

Kafeoylquinic asid se yon konpoze fenolik ki fòme pa lyezon ester ant asid kafeik ak asid L-kinik. Dérivés asid Caffeoylquinic yo te konnen yo gen aktivite anti-melanogenesis ak anti-tirosinaz ak aktivite ROS scavenging. Tyrosinase se yon multifonctionalcopper ki gen metaloenzyme ak divalent kwiv cations.1 Kafeoylquinic asid dérivés ka anpéché tyrosinaseactivity pa chelating yon cation kwiv ki responsab pou sustainingthe aktif eta tyrosinase. Pou predi entèraksyon ant 5-asid kafeylikik ak tirozinaz, yo te fè yon etid debakabl molekilè lè l sèvi avèk Maestroprogram la. Pi bon poze pou konpoze an, totyrosinase ki anbake, montre nan Figi 6C, D. Etid molekilè a te revele ke 5-asid kafeoylquinic reyaji ak copperion nan yon distans 2.43 Å epi etabli yon seri π−πstacking ak His. 259, Asn 260, His 85, ak His 263 résidus ak yon H-kosyon ak Arg 268. Anplis de sa, enèji lyezon ant tirozinaz ak 5-asid kafeylikkinik te -4.425 kJ/mol. Rezilta sa yo endike ke 5-asid kafeylikkinik te kapab anpeche aktivite tirozinaz pa chelation kòb kwiv mete. Pou verifye mekanis inhibitor melanogenesis 5-asid kafeoylkinik, nou te detèmine abilite kòb chelating asid kafeoylquinic la. Kapasite chelating kòb kwiv mete nan 5-asid kafeoylquinic te ogmante nan yon fason ki depann de konsantrasyon (Figi 6E). Rezilta sa a sijere ke 5-kafeoylquinicacid inibit sentèz melanin atravè chelating yon katyon kwiv ki entèraksyon ak tirozinaz.

Figi 5. Efè twa dérivés asid caffeoylquinic yo sou scavenging radikal, nan vitro anti-tirosinaz, ak aktivite anti-melanogenesis nan selil B16F10.

MATERYÈL AK METÒD

Materyèl

L. thunbergianus te achte nan onlinemarket www.jirisangol.com (Kore di) epi seche anba kondisyon anviwònman anvan yo itilize nan etid sa a. Reyaktif, tankou 2,2′-zenk bis(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) ak 3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromur (MTT), yon òmòn -melanocyte-stimulating (-MSH), ak anzim, tankou tirozinaz djondjon, yo te jwenn nan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Potassiumpersulfate (K2S2O8), pyrocatechol violet, ak 3,4-dihydroxy-L phenylalanine (L-DOPA) te achte nan men Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).

Ekstraksyon ak fraksyon nan L. thunbergianus.

Seche L. thunbergianus (80 g) te pulverize lè l sèvi avèk yon pulverizeur (HBL-3500S, Samyang Elektwonik, Kore) ak ekstrè ak 70 pousan EtOH twa fwa (800 mL, chak fwa. ) nan 70 degre pou 3 jou. Ekstrè ki kapab lakòz yo te filtre vakyòm lè l sèvi avèk papye Advantecfilter nos. 1 ak 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japon) ak konsantre lè l sèvi avèk yon Rotaryevaporator Hei-Vap Advantage (Heidolph, Almay) pou jwenn 17.2 g nan ekstrè EtOHcrude la. Ekstrè brit sa a te sispann nan dH2O (180mL) ak siksesif fraksyon ak Hex, CH2Cl2, EtOAc, ak n-BuOH bay Hex (1.51 g, 8.8 pousan), CH2Cl2 (0.88 g, 5.1 pousan), EtOAc (3.95 g, 23). pousan ), ak n-BuOH (3.02 g, 17.6 pousan ), jan sa te dekri anvan an.15 Ekstrè yo ak fraksyon ki te lakòz yo te seche nan friz epi estoke nan -80 degre anvan yo itilize.

Detèminasyon ABTS gratis Radikal Scavenging Aktivite.

Pou evalye aktivite antioksidan ekstrè L.thunbergianus ak fraksyon sòlvan li yo, yo te detèmine aktivite scavenging ABTSradical la, jan sa te dekri anvan an.16 Pou jenere radikal ABTS la, 10 mL 7 mMABTS te melanje ak 176 μL 140 mM. potassiumperoxy disulfate nan dH2O ak enkubasyon nan fè nwa a nan tanperati chanm (RT) pou 16 èdtan anvan yo itilize. Solisyon radikal ABTS te dilye ak metanol absoli pou jwenn anabsorbans tou pre 0.7 nan 734 nm. Alikòt 100 μL nan chak ekstrè oswa fraksyon nan seri konsantrasyon ki endike nan 2-200 ug / mL yo te ajoute nan 100 μL nan dilye ABTS solisyon radikal ak enkubasyon pou 10 min nan fè nwa a nan RT. Lè sa a, yo te mezire absorpsyon nan 732 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate SpectraMaxM5 multimode (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Aktivite pou netwaye radikal ABTS yo te kalkile jan sa a

Aktivite radikal ABTS (pousan) =1−(Egzanp/Akontwòl)×100 (1)

Invitro Tirozinaz In Vitro.

Efè inhibition nan ekstrè L.thunbergianus ak fraksyon sòlvan li yo sou aktivite tyrosinase te evalye pa kantite lajan an nan dopachromesynthesized soti nan reyaksyon an katalitik nan tyrosinase.2a,17Briefly, 50 μL nan chak ekstrè oswa fraksyon nan ranje a endike konsantrasyon te melanje ak 550 μL nan 5500 μL. U/mLtirozinaz djondjon nan 50 mM fosfat-tanpon saline (PBS; 8.1 mM Na2HPO4, 1.2 mM KH2PO4, pH 6.8, 2.7 mMKCl, ak 138 mM NaCl) nan yon plak 96-byen ak enkubasyon pou RT30. Lè sa a, 100 μL nan 1 mM L-DOPA te ajoute nan chak byen ki te swiv pa enkubasyon pou yon lòt 10 min nan 37 degre. Yo te mezire absorbans solisyon an nan 475 nm lè l sèvi avèk SpectraMax M5 multimode microplatereader la.

Kilti Selil.

Selil melanom murin B16F10 yo te kiltive nan mwayen Eagle's modifye Dulbecco a (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) konplete ak 10 pousan serom fetal bovine chalè-inaktive (Gibco), 100 inite/mL penisilin, ak 100ug/mL streptomycin (37 Gibco) anba imidite 5 pousan CO2.

Viabilite selilè.

Vitabilite selil B16F10 yo te detèmine ak yon tès MTT, jan sa te dekri anvan an.18 Yon ti tan, yo te simen selil B16F10 nan 24-plak byen nan yon dansite 1 × 104 selil pou chak byen. Apre 24 èdtan, selil yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan ekstrè L. thunbergianus oswa fraksyon pou 48 èdtan. Lè sa a, selil yo te enkube ak solisyon MTT pou 4 èdtan, ak kristal formazan redwi yo te fonn nan DMSO. Solisyon sa a te transfere nan 96-plak byen, epi yo te mezire absorpsyon nan 540 nm lè l sèvi avèk lektè mikwoplak SpectraMax M5multimode la.

Detèminasyon Intracellular Reactive OxygenSpecies (ROS).

Nivo ROS intraselilè a te mezire ak yon twous tès selilè ROS DCF/H2DCFDA (ab113851,Abcam), dapre enstriksyon manifakti a. Yon ti tan, selil B16F10 yo te simen nan 48-plak byen nan yon dansite 2 × 104 selil pou chak pui. Apre yon kilti 24 h, selil yo te trete pou 1 h ak konsantrasyon ki endike nan L. thunbergianus ekstrè sòlvan fraksyon nan 0.1 pousan albumin serik bovin (BSA) ki gen medya kilti ki pa gen okenn fenol wouj. Selil yo te enkube ak 100 μM oksijene idwojèn pou 30 min.Apre lave ak PBS, selil yo te trete ak 25 μMH2DCFDA nan PBS pou 45 min. Nivo ROS te analize pa yon lektè microplate (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) ekipe ak yon filtè fluoresans nan 485/545 nm (longèdonn eksitasyon / emisyon). Mwayèn entansite fluoresans relatif kontwòl la te egalize a 100 pousan, ak kondisyon tretman kalkile pwopòsyonèl.

Detèminasyon kontni Melanin.

Kontni melanin lan te detèmine, jan sa te dekri anvan an, ak kèk modifikasyon.19 Selil melanom yo te kiltive nan yon plak sis-pou pou 24 èdtan. Yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan ekstrè L. thunbergianus oswa sòlvanfraksyon li yo pou yon lòt 48 èdtan nan prezans 100 nM -MSH. Gibco), selil ki te lakòz yo te detache pa enkubasyon ak yon solisyon tripsin-EDTA. Apre santrifugasyon nan 1000 rpm pou 3 min, granules selil la te disoud nan 150 μL NaOH 1 M ki gen 10 pousan DMSO pou 1 èdtan nan 60 degre pou 1 èdtan. Kontni melanin la te detèmine pa absorpsyon nan 405 nm lè l sèvi avèk lektè mikroplak la.

Ekstrè Cistanche inibit melanin.

Detèminasyon Aktivite Tirozinaz Selilè nan Selil Melanom.

Aktivite tirozinaz nan selil B16F10 yo te egzamine ki baze sou kantite dopachrome ki pwodui nan reyaksyon katalitik tirosinaz entraselilè.20 Yon ti tan, selil melanom yo te kiltive nan yon plak sis-pou 24 èdtan, epi tretman ak diferan konsantrasyon ekstrè L.thunbergianus oswa sòlvan li yo. fraksyon pou yon plis 48 hin prezans nan 100 nM -MSH. Apre yo fin lave de fwa ak glas frèt D-PBS, selil yo te lysed nan 200 μL nan tanpon tès radyo-imunoprecipitation (RIPA) (Sigma-Aldrich) ki gen inibitè proteaz ak fosfataz. Apre santrifugasyon nan lisat selil yo kolekte nan chak pi nan 15, 000 g pou 15 min, 100 μL nan supernatant la te melanje ak 100 μL nan 1 mM L-DOPA nan PBS (pH 6.8) ki te swiv pa enkubasyon pou 30 min nan 37 degre. . Yo te mezire absorbans dopachrome nan 475 nm lè l sèvi avèk microplatereader la. Done yo te nòmalize ak konsantrasyon pwoteyin detèmine pa tès la asid bicinchoninic.

Izolasyon ak Karakterizasyon Konpoze Bioaktif Sèvi ak HPLC.

Yo te fè HPLC sou YL{{0}}(Young Lin Instrument, Kore di), ekipe ak yon kolòn TC-C18 (4.6 mm, 250 mm, ak 5 μm, Agilent, USA), enkonjonksyon ak yon sistèm gradyan ki konpoze de sòlvan A(0.2 pousan asid fòmik) ak sòlvan B (MeOH). Solvantratio pant lan te fikse a 0-5 min, 15 pousan B; 5−10 min, 15−20 pousan B; 10−15 min, 20−30 pousan B; 15−30 min, 30−40 pousan B; 30−37 min, 40−60 pousan B; 37−40 min, 60−100 pousan B; 40−45 min, 100 pousan B; 45−50min, 100−15 pousan B; ak 50-55 min, 15 pousan B. Pou idantifye engredyan yo nan fraksyon sòlvan, yo te delivre faz mobil nan yon vitès koule 1 mL/min, epi deteksyon an nan elisyon te fèt nan 330 nm. Pou kolekte engredyan bioaktif fraksyon fache yo, faz mobil lan te delivre nan yon vitès koule 15.0 mL / min, epi deteksyon an nan elisyon te fèt nan 330 nm lè l sèvi avèk prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Kore di). ), ekipe ak yon kolòn prep-C18 (4.6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, USA), an konjonksyon avèk yon sistèm gradyan ki konpoze de sòlvan A (0.2 pousan asid fòmik) ak sòlvan B (MeOH). Yo te fikse rapò sòlvan pant lan sou 0−10 min, 10 pousan B; 10−20 min, 10−15 pousan B; 20−40 min, 15 pousan B; 40−60 min, 15−20 pousan B; ak 60−70 min, 30 pousan B.

Modeling molekilè.

Estrikti kristal mushroomtyrosinase pou modèl molekilè se te yon Agaricustyrosinase (PDB fè: 2Y9X) jwenn nan Pwoteyin DataBank (PDB). Yo te prepare anzim nan lè l sèvi avèk workflow preparasyon proteinwizard entegre nan Maestroprogram (Maestro, vèsyon 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019). Yo te retire dlo ak tout lòt molekil ki prezan nan dosye PDB yo. Yo te fè anchaj molekilè lè l sèvi avèk pwotokòl induced fit docking (IFD) (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking pwotokòl), jan yo te rapòte deja.21

Abilite Copper Chelating.

Yo te detèmine kapasite kòb kwiv mete chelating nan konpoze ki izole nan L. thunbergianus dapre rapò anvan an.22 Chak derivatif asid kafeoylquinic (1 0 μL) nan konsantrasyon endike a te melanje ak 280 μL nan 50 mM tanpon sodyòm acetate (pH 6.0), 6 μL of4 mM pyrocatechol vyolèt solisyon prepare nan menm tanpon an, ak 10 μL nan 1 ug / μL CuSO4·5H2O. Yo te obsève disparisyon koulè ble a lè w mezire absòbe a nan 632nm lè l sèvi avèk SpectraMax M5 multimode microplate reader.Water te itilize kòm yon kontwòl olye pou yo yon echantiyon. Aktivite chelating Percentcopper te kalkile nan absòbe a nan 632 nm, ki se jan sa a

kapasite kòb chelating (pousan)=1- (Yon echantiyon/Yon kontwòl)×100 (2)

Analiz estatistik.

Tout done ki nan etid sa a te eksprime kòm mwayèn ± devyasyon estanda (SD) soti nan twa eksperyans endepandan. Analiz estatistik yo te fè ak GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Diferans ki genyen ant valè mwayèn nan kontwòl la ak gwoup ekspoze yo te analize lè l sèvi avèk yon analiz yon sèl-way nan divèjans (ANOVA) ki te swiv pa post hoctest Dunnett la. Papòt la pou siyifikasyon estatistik pou tout analiz te p < 0.05="">

KONKLIZYON

Nan etid sa a, nou te demontre ke L. thunbergianus extractscavenges radikal ABTS epi montre yon efè inhibitor ki pisan sou biosentèz melanin san sitotoksisite enpòtan. Engredyan abyoaktif ki egziste nan L. thunbergianus ak inhibitingmelanogenesis te izole nan fraksyon n-BuOH.Anplis de sa, nou te jwenn ke twa kafeoylquinic acidderivatives yo se pi gwo konpoze ki egziste nan n-BuOHfraction a e ke 5-asid kafeoylquinic se yon engredyan enpòtan pou siprime melanogenesis nan selil melanom pa anpeche aktivite tirozinaz selilè a. Isit la, nou izole yon inibitè konpoze natirèl 5-asid kafeoylquinic nan ekstrè L.thunbergianus la pou anpeche ipèpigmantasyon ak revele mekanis anpèchman li yo ki kache melanogenesis. Kidonk, rezilta nou yo sijere ke 5-asid kafeylik ak fraksyon n-BuOH izole nan L. thunbergianus ka itil nan pwodui kosmetik kòm ajan blanchi po.

tranch cistanche