Pwofil chimik ak etid metabolit nan Cistanche Deserticola kri ak trete nan rat pa UPLC-Q-TOF-MSE

Kontakte Imèltina.xiang@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé

Background: Pwosesis Chinwa materia medica se yon teknik pharmaceutique distenge ak inik nan Medsin Tradisyonèl Chinwa (TCM) yo itilize pou diminye efè segondè, epi ogmante oswa menm chanje efikasite ki ka geri remèd fèy yo anvan tout koreksyon. Chanjman nan eleman esansyèl yo pwovoke pa yon pwosedi pwosesis optimize yo prensipalman responsab pou ogmante efikasite plant medsin yo. Efè nan ren-yang dinamize nan diri diven-vapèCistanche deserticola(C.deserticola) te pi fò pase kri C.deserticola (CD).

Metòd: Yo te fè yon analiz konparezon lè l sèvi avèk UPLC-Q-TOF-MS ak platfòm enfòmatik UNIFl pou detèmine enfliyans pwosesis la. Etid in vitro yo te fèt pou karakterizasyon elektè yo kòm byen kemetabolitan vivo. Konpozan chimik yo te detèmine nan CD ak pwodwi trete li yo. Analiz estatistik miltivarye yo te fèt pou evalye varyasyon ant yo pandan ke yo te itilize OPLS-DA pou konparezon par.

Rezilta yo: Rezilta etid sa a te revele varyasyon konsiderab nan glikozid feniletanoid (PhGs) akiridoidapre pwosesis. Yon total de 97 konpoze yo te detekte nan ekstrè yo nan CD ak pwodwi trete li yo. PhGs ki gen 4-O-kafeoyl gwoup nan 8-O{- -D-glucopyranosyl pati a, tankou acteoside, cistanoside C, campneoside Il, osmanthuside diminye apre yo fin trete, pandan y ap PhG ak 6' -O-caffeoyl gwoup nan 8-O- -D-glucopyranosyl pati a, tankou isoacetoside, isocistanoside C, isocampneoside l, isomartynoside ogmante, espesyalman nan gwoup CD-NP. Entansite echinacoside ak cistanoside B ki gen estrikti posede 6'-O- -D-glucopyranosyl moyete ogmante tou. Nan etid in vivo, yo te detekte 10 eleman pwototip ak 44 metabolit nan plasma rat, poupou ak pipi. Rezilta yo jwenn te revele ke pwosesis la mennen nan varyasyon konsiderab nan eleman chimik yo nan CD ak afekte dispozisyon konpoze yo nan vivo, ak faz Ⅱ pwosesis metabolik yo se kaskad kle yo nan chak konpoze, ak pi fò nan metabolit yo asosye ak echinacoside oswa acteoside.

Konklizyon: Sa a se premye rechèch konparezon mondyal nan CD anvan tout koreksyon ak trete. Konklizyon sa yo ajoute nan konpreyansyon nou sou enpak la nan pwosesis CD ak bay done enpòtan pou envestigasyon efikasite nan lavni.

Mo kle: Cistanche deserticola, Processing, UPLC-Q-TOF-MS5, Des Chimik, Metabolit in vivo

Entwodiksyon

Pwosesis Chinese materia medica (CMM) te demontre siyifikatif aplikab nan pratik klinik Tradisyonèl Chinwa Medsin (TCM), epi li te konsidere kòm yon tretman solid pou plizyè syèk. Sa a se yon teknoloji pharmaceutique inik ki te sòti nan teyori a nan TCM. Apre pwosesis, yo te idantifye diferans siyifikatif nan aparans, konstitiyan chimik, karakteristik, ak siyifikasyon medsin nan tout kalite TCMs, ki mennen nan sipozisyon ke pwosesis la ka amelyore efikasite oswa diminye efè toksik TCM a.

Pandan plizyè santèn ane,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong an Chinwa, CD) se souvan itilize nan pratik klinik TCM pou konplete fonksyon ren an. Li ede tou nan idrate nan trip la ki mennen nan ap detann entesten [1].Cistanchete premyèman anrejistre nan ShenNongBencaoJing. Li souvan jwenn nan abita arid ak semi-arid atravè Eurasia ak Afrik Dinò, tankou Iran, Lachin, peyi Zend, ak Mongoli [2]. Te pwosesis CD yo te pote soti nan vapè ak diri-diven anba presyon nòmal, ki se yon metòd preparasyon dokimante nan famakope Chinwa a (Jiucongrong nan Chinwa, apre sa yo rele "CD-NP"). Ak CD vapè ak diri-diven anba presyon ki wo se yon metòd preparasyon ki pi efikas (ki rele "CD-HP") [3, 4]. Plizyè etid yo te revele ke efè famasi CD yo diferan de pwodwi trete li yo [5]. CD ka tonifye ren-yang ak detann entesten, pandan y ap apre yo te fin vapè pa diri-diven, efè a nan ranplir ren-yang ta dwe ranfòse. Nan etid anvan nou an, li te jwenn ke CD-NP te kapab amelyore tonifasyon nan ren an ak sipò yang, ak soulaje efè a nan mwatir trip ak defèkasyon [6-8]. Nan pratik klinik, pwodwi trete yo se fòm ki pi souvan itilize.

Jiska dat, plizyè etid te analize konpozan chimik CD yo, ki te swiv pa izòlman ak idantifikasyon plis pase 100 konpoze [9-11], tankou glikozid phenylethanol (PhGs),iridoid, lignan, ak oligosakarid kòm eleman prensipal chimik li yo. Li te rapòte tou ke gen anpil aktivite famasi nan PhG ki gen ladan imunomodulateur, neuroprotective, epatoprotective, anti-enflamatwa, anti-oksidatif, elatriye[12-14]. Iridoid posede aktivite anti-enflamatwa [15, 16]. Li te tou te revele pa etid pi bonè ke kèk eleman chimik te montre varyasyon pandan pwosesis la [17-20]. Ki baze sou rapò sa yo, li ka sipoze ke apre-pwosesis, varyasyon yo nan konpozisyon chimik mennen nan divès efè famasi, ki bezwen plis eksplore.

Nan etid aktyèl la, yon metòd sansib ak efikas sa vle di, ultra-wo pèfòmans likid chromatografi makonnen ak TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) te fèt pou analiz konparatif, ak etid in-vitro yo te fèt pou analize kalitatif ekstrè yo. CD, CD-NP, ak CD-HP pou elisid pwofil chimik yo. Anjeneral, yo te konsidere pwodwi chimik ekzojèn ki gen gwo ekspoze nan ògàn sib yo kòm konpozan efikas. Se poutèt sa, nan rat, CD ak pwodwi trete li yo te administre oralman respektivman, ki te swiv pa karakterizasyon yo. Etid la ki deja egziste revele yon etid konparatif (tou de nan vitro ak nan vivo) nan CD anvan tout koreksyon ak trete pou premye fwa. Rezilta yo jwenn yo ta elaji konpreyansyon nou konsènan efè pwosesis CD, ki ta ka itil pou plis etid.

Materyèl ak metòd

Materyèl

Konpoze estanda nan ajugol(180120) ak 2'-acetyl-acetoside(M0601AS) te bay Chendu Pure Chem-Standard co, Ltd (Chengdu, Lachin). Cistanoside F(MUST-17022620), echinacoside (D1105AS), cistano-side A (M0906AS), ak isoacteoside (M0106AS) te bay konpayi Must (Sichuan Lachin); acteoside (O0618AS), salidroside (J0526AS), catalpol. (S0728AS), jeniposid (A0407AS), ak asid jeniposidik (MB6001-S) yo te akeri nan Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, Lachin).8-Epide oxyloganic acid (B31123) te jwenn nan Shanghai Yuanye Byolojik Teknoloji co, Ltd, Lachin. Methanol ak asetonitrile te nan MS-klas epi yo te jwenn nan Merck KGaA, Darmstadt, Almay. Merck KGaA (Darmstadt, Almay) te bay asid metanoik (CH, O,) nan HPLCgrade. Dlo a, ki te itilize nan etid la ki deja egziste te trete atravè sistèm nan Milli-Q (18.2 MQ, Millipore, Ma, USA). Diven diri te bay Brand Tower Shaoxing Wine Co, Ltd.(Zhejiang, Lachin).

Cistanch deserticola te ranmase nan men Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Echantiyon yo te idantifye pa Pwofesè Yanjun Zhai (lekòl nan famasi, Liaoning University of TCM). Espesimèn yo te soumèt nan Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

Bèt

Rat gason Sprague-Dawley (klas SPF) ak 180-220 g nan pwa total kò yo te bay Liaoning Changsheng biotechnology Co Ltd (Laboratwa Animal Resous Sant nan pwovens Liaoning, nimewo lisans: SCXK-2015-0001). Rat sa yo te loje nan yon chanm elvaj ak tanperati ki byen konsève, ak imidite sa vle di, 20-26 degre, 50-70 pousan pou yon semèn. Rat yo te manje ak manje laboratwa abityèl ak dlo anvan eksperimantasyon. Bèt yo te fè jèn lannwit lan, sepandan, yo te bay dlo ad libitum anvan eksperimantasyon an. Te rat yo te egzekite ak yon 10 pousan nan anestezi idrat chloral. Komite Enstitisyonèl Etik Animal nan Liaoning Pwovens Lopital Medsin Chinwa te apwouve tout pwotokòl eksperimantal yo (2019.3.25, 2019015).

Preparasyon CD, CD-NP, ak CD-HP ekstrè

CD-NP, CD-HP te trete nan menm pakèt Cistanch deserticola. Pou prepare CD-NP, moso CD sèk (5 mm epè, 100 g) yo te idrate ak diri-diven (30 mL) epi yo te vapè nan 100 degre pou 16 èdtan, ki te swiv pa siye nan 55 degre atravè fou siye. Pandan ke CD-HP te prepare atravè enfiltrasyon nan moso CD sèk (5 mm epè, 100 g) ak diri-diven (30 mL), ki te swiv pa vapè nan 1.25 presyon atmosferik pou 4 èdtan. ak Lè sa a, seche nan yon fou siye nan 55 degre.

Nan yon flacon mezire 100 ml, yon gram poud lan te tamize atravè Van #4, ki te swiv pa ajoute 50 pousan nan metanol (50 ml) ak Lè sa a, byen sere kouvri ak melanje. Melanj sa a te peze, ki te swiv pa mwatye èdtan. maserasyon. Apre maserasyon, melanj lan te ultrasonicated (pouvwa 250 W, frekans 35 kHz) pou 40 min, ki te swiv pa refwadisman, ak peze ankò. Pèt la nan pwa a te ranplir ak 50 pousan metanol, byen melanje, ak pèmèt yo kanpe, ki te swiv pa filtraj supernatant la ak Lè sa a, sèvi ak filtrate a jwenn kòm solisyon tès la.

MSE analiz de konpozan aktif

Preparasyon sibstans estanda: tubuloside-A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2'-acetylatteoside (2.34 mg), acteoside (2.45 mg), izoakteozid (0.61). mg), cistanoside-F (2.14 mg), salidroside (3.39 mg), geni-poside (2.84 mg), ajugol (1.58 mg), catalpol (2.39 mg), asid jeniposidik (2.56 mg), ak 8-epideoxyloganic. asid (2.34 mg) yo te ajoute nan yon fask volumetrik 10 mL, te ajoute metanol volim konstan nan echèl, konfgured nan yon solisyon referans konsantrasyon korespondan. Chak nan 100 μL yo te konfgure nan yon solisyon referans melanje.

Kondisyon analiz MS: Te valè mas korije anvan eksperyans lan, epi yo te itilize mòd iyon negatif la. Ranje mas la te 50–1200 Da, epi echantiyon an te sou fòm piki nan yon ponp piki koule. Vitès kòn lan te 100 L / èdtan, pousantaj koule nan dissolvan yo te mete nan 800 L / h. Yo te fikse vòltaj kapilè ak kòn yo nan 2500 ak 40 V, kòmsadwa. Tanperati sous ion ak gaz dissolvan te 100 degre ak 400 degre respektivman, ak frekans akizisyon siyal te 0.5 S-1.

UPLC-Q-TOF-MS analiz de CD ekstrè (15-16 min), 65 pousan a 55 pousan A (16-18 min). Pousantaj koule a te 0.3 mL min-1, pandan y ap tanperati chanm oto-sampler la ak kolòn te 30 degre ak 8 degre separeman. Volim piki a te 1.0 μL.

Evalyasyon mas spectrometric yo te fèt atravè Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), ki gen ladan yon sous ESI. Yo te fikse to koule gaz nitwojèn nan 800 L·hrs-1 ak yon tanperati 400 degre, tanperati sous la te fiks nan 100 degre, epi gaz kòn lan te fikse nan 50 L h-1. Yo te ajiste vòltaj la nan kòn ak kapilè nan 40 ak 2000 V, kòmsadwa. Enèji kolizyon ranp lan te itilize nan ranje 20-30 V. Yo te jwenn done santreyed tout echantiyon yo ant 50 ak 1200 Da, ak yon 5-tan eskanè 0.5 s sou yon tan analiz 10 min. . LockSpray TM te anplwaye pou validation nan presizyon an mas. Te [M-H]-ion nan enkephalin leucine (200 pg·μL-1 koule perfusion 10 μL min-1) nan m / z 554.2615 te itilize kòm mas la fèmen. Te MassLynx V4.1 lojisyèl (Waters Co., Milford, USA) te anplwaye pou mas la egzat, konpozisyon an nan iyon yo précurseur, ak kalkil la iyon fragman.

Analiz done nan platfòm Masslynx

Anplis de sa, yon bibliyotèk andedan kay la ki gen ladan non konpoze an, estrikti li yo ak fòmil molekilè a (an mol.) te etabli ki baze sou literati. Tout konpoze yo te note nan yon modèl espesyal, te fè nan Excel. Anplis de sa, fichye mol yo (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge mou, USA) ak fichye Excel nan tout estrikti konpoze endividyèl yo te sove tou sou PC lokal la. Te etabli fèy Excel la ki gen done enpòtan dirèkteman enpòte nan bibliyotèk la syantifik nan UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK te anplwaye pou evalyasyon karakteristik estriktirèl yo, patikilyèman pou fragman karakteristik yo ak MS fragmantasyon. Yo te fikse yon zòn pik minimòm 500 pou deteksyon pik 2D. Pandan revele pik 3D yo, yo te chwazi yon entansite pik enèji ki ba ki gen plis pase 300 konte ak entansite pik enèji ki wo ki gen plis pase 80 konte. Erè a nan mas yo te jwenn jiska ± 10 ppm pou konpoze li te ye, ak tolerans nan tan retansyon yo te mete nan seri a nan ± 0.1 min. Nou te chwazi aduk negatif ki gen -H, plis HCOOH. Pwosesis done anvan tout koreksyon yo te jwenn nan MS te fèt atravè lojisyèl UNIFI rasyonalize pou byen vit idantifye konpozan chimik yo ki te satisfè nòm yo ak baz done pwòp tèt ou bati ak Bibliyotèk Medsin Tradisyonèl nan kay la.

Apre sa, pou verifye estrikti chimik chak konpoze sib yo, izomè yo te distenge pa modèl fragmantasyon MS karakteristik yo ki te revele nan etid yo rapòte, epi lè yo konpare tan retansyon estanda referans yo.

Analiz metabolomik ki baze sou analiz estatistik miltivarye

Anvan yo te trete done anvan tout koreksyon yo, yo te fikse paramèt yo, tankou mas ki sòti nan 150 rive 1200 Da, ranje tan retansyon (0 a 20 min), entansite papòt ( 2000 konte), tolerans mas sa vle di, 5 MDA, pandan y ap mas ak fenèt tan retansyon te 0.20 min ak 0.05 Da, respektivman. Nan lis ki vin apre a nan baz done a, idantifyan an nan iyon yo te RT-m/ pè yo ki gen rapò ak fwa elisyon yo. Menm valè yo pou RT ak m/z nan divès pakèt echantiyon yo te konsidere kòm menm konpoze an.

Yo te fè analiz estatistik miltivarye pou evalye biomaketè efikas ki konsiderableman kontribye nan varyasyon nan mitan diferan gwoup. Pandan analiz la, yo te itilize analiz eleman prensipal (PCA) pou endike diferans maksimòm yo ak rekonesans modèl pou jwenn yon apèsi ak klasifikasyon. OPLS-DA a se yon zouti modèl ki bay vizyalizasyon chajman eleman prediksyon OPLS-DA pou ede evalyasyon modèl. Enpòtans varyab pou pwojeksyon an (VIP) te itilize pou evalye evalyasyon divès eleman, akmetabolitwith VIP values>1.0 ak P-valè<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Eksperyans sou bèt rat yo te klase owaza nan kat gwoup (n{0}} pou chak gwoup), ki te swiv pa administrasyon oral divès ekstrè: (1) Gwoup kontwòl vid: yo te bay rat yo saline nòmal (2 mL/100 g) ; (2) Gwoup CD: yo te bay rat yo CD ekstrè (2 mL/100 g); (3) Gwoup CD-NP: yo te bay rat yo CD-NP ekstrè (2 mL/100 g); (4) Gwoup CD-HP: yo te bay rat yo CD-HP ekstrè (2 mL/100 g). Yo te fè plis kategorizasyon tout gwoup yo an twa sous-gwoup pou plasma, pipi, ak poupou, kòmsadwa. De zè de tan pita, chak rat yo te administre oralman ak menm kantite lajan an nan ekstrè.

Apre administrasyon an, koleksyon echantiyon san yo te fèt nan 1.0 è, 2.0 è, ak 4.0 è nan tib eparinize 1.5 mL polietèn (ki soti nan venn òbital yo) , ki te swiv pa santrifujasyon (nan 4500 rpm) nan tout echantiyon pou 15 min.

Pou echantiyon pipi ak poupou, rat yo te kenbe nan kalòj metabolis, ak Lè sa a, koleksyon an nan echantiyon pipi ak poupou te pote soti pou 24 èdtan apre administrasyon an. Santrifijasyon echantiyon pipi yo te fèt nan 45 00 rpm pou 15 min, pandan y ap echantiyon poupou yo te cheche nan lonbraj la, yo te mouye an poud, epi yo te pran 0.2 g, epi yo te ajoute nan 0.5 mL saline. solisyon, ultrason pou 5 min, epi santrifuje a 12,000 rpm pou 15 min. Tout biosamples yo te kenbe nan -80 degre jiskaske analiz.

Preparasyon echantiyon byolojik. Anplis de sa nan plasma, pipi, ak poupou echantiyon te pote soti ak 3 volim nan metanol, ki te swiv pa vortexing pou 3 min. Apre sa, santrifijasyon (nan 12, 000 rpm) melanj yo te pote soti pou 10 minit, ki te swiv pa transfere supernatant nan tib EP a, ak Lè sa a, seche pa nitwojèn nan 37 degre. Anplis de sa, adisyon a nan 200 μL nan solisyon HCN-H2O (50 pousan) te pote soti. Dis, toubiyon an te itilize pou melanje (1 min), ki te swiv pa santrifugasyon (nan 12, 000 rpm) pou 5 min. Supernatant (5 μL) echantiyon trete yo te sou fòm piki nan sistèm UPLC-Q-TOF-MSE.

Likid chromatographic ak mas spectrometric kondisyon analiz la poumetabolitenstriman Waters UPLC te fè tou atravè yon koòdone ESI. Separasyon yo te fèt lè l sèvi avèk yon kolòn Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2.1 mm, 1.8 µm), faz mobil la te 0.1 pousan asid fòmik (A): Acetonitrile (B), la. kondisyon elisyon gradyan te 0-3 min (99.8 pousan →98 pousan A).3-5 min (98 pousan →95 pousan A),5-8 min (95 pousan →90 pousan A), { {18}} min (90 pousan →85 pousan A),12-17 min (85 pousan →70 pousan A), 17-22 min (70 pousan →60 pousan A), 22-23 min (60 pousan →58 pousan A), 23-25 min (58 pousan A), 25-32 min (58 pousan →45 pousan A), ak 32-37 min (45 pousan →35 pousan A) ),0.4 mL min-1 se to koule a. Tanperati pou kolòn ak echantiyon chanm lan te fikse nan 40 degre ak 8 degre respektivman. Yo te itilize kondisyon espektometri mas yo mansyone pi wo a.

Yo te itilize estrateji pou analiz sistematik metabolit nan echantiyon bio UNIFI (1.8.2) lojisyèl pou tretman done. Fonksyon Binary Compare te itilize pou idantifikasyon metabolit efikas. Metabolit evalye yo pa t egziste nan echantiyon kontwòl ekivalan a oswa egziste nan entansite iyon ki ba. Yo te fikse papòt entansite relatif la nan 3 oswa 5, epi yo ka evalye metabolit ki satisfè kritè souliye yo. Lè sa a, EIC te detèmine metabolit komen ak previzib. Pou chèche metabolit de-faz, yo te aplike fonksyon NLF. Pou egzanp, nan lojisyèl an UNIFI, paramèt yo ta ka mete nan 176.0321 pou chèche posib konjige asid glukuronik. Post-traitement, yon pèt net ka mete nan metòd la oswa idantifye. MassFragment te itilize pou detèmine oswa karakterize estrikti metabolit detekte yo, fonksyon entèpretasyon espektral UNIFI a se fonksyon prensipal yo itilize pou analize fwagmantasyon segondè konpozan paran yo. Fonksyon sa a ka itilize pou verifikasyon rapid nan chemen an fwagmantasyon si wi ou non rezonab.

Rezilta yo

Règ fragmantasyon mas nan glikozid feniletanoid ak iridoid

Phenylethanoid glikozid yo se eleman prensipal chimik nan CD. Solisyon estanda izoakteozid,

Cistanoside F, tubuloside A, echinacoside, acteoside, ak 2'-acetyl-acteoside yo te pran, ki te swiv pa bay yon nivo diferan nan enèji kolizyon (Tablo 1), ak Lè sa a, kat MS2 korespondan yo te jwenn (Fig. 1).

Analiz mas spectrometric revele ke phenylethanoid glycosides gen menm jan an mas spectre fwagmantasyon modèl, chemen yo klivaj nan mòd negatif-ion sitou gen ladan (1) klivaj kosyon Ester: pèt nan gwoup net cafeoyl (C, H, O162.03) ak net asetil. gwoup (C, H, O, 42. 00); (2) klivaj glikozidik: pèt rezidi netral rhamnose (C.HIO, 146.05) ak rezidi glikoz net (CgHO, 162.05). Soti nan espektometri mas segondè-rezolisyon, kafeoyl (162.03) ak rezidi glikoz (162.05) ta ka distenge.

Iridoids ajugol, catalpol, asid jeniposidik, jeniposid, ak 8-epide asid oksiloganik solisyon estanda yo te pran, ki te swiv pa bay enèji kolizyon diferan, ak MS'maps korespondan yo te jwenn (figi 2).

Glikozid iridoid gen menm modèl fragmentasyon mas spectre, chemen klivaj nan mòd negatif-ion sitou gen ladan (1) klivaj glikozidik: Pèt rezidi glikoz net (CHoO, 162.05); (2) Pèt CO net, (43.99) ak H. , O(18.01).

Idantifikasyon konpoze yo nan ekstrè CD, CD-NP, ak CD-HP

Analiz UPLC-QTOF-MSE

Te optimize kondisyon kwomatografik yo te pote soti. Apre sa, konpoze yo nan CistancheHerba yo te evalye nan tou de negatif ak pozitif mòd ion ak segondè osi byen ke ba CEs. Rezilta yo jwenn revele ke konpatibilite nan mòd negatif la te pi wo parapò ak mòd pozitif pou konpoze sa yo. Figi 3 te montre MS de baz pik ion (BPI) chromato-gram remonte ak pik nimewote. Entansite chak iyon detekte nan analiz UPLC-Q-TOF-MS yo te nòmalize parapò ak kantite iyon antye pou jenerasyon yon matris done ki gen ladan valè m/z, zòn pik nòmalize a ak tan retansyon.

Evalyasyon konpozan nan CD ak pwodwi trete li yo sou platfòm UNIFl la

Yon total de 97 konpoze yo te idantifye ak -SEM (n=6) mòd soti nan CD ak pwodwi trete li yo (Tablo 2), ki gen ladan glikozid feniletanoid (PhGs), iridoid, lignans, ak oligosakarid. Konpozan 95,91, ak 94 yo te detekte nan CD, CD-NP, ak CD-HP kòmsadwa. Pami yo, 64 yo te feniletanoid, 13 yo te iridoid, ak 20 lòt kalite konpoze yo te detèmine. Te gen yon resanblans nan konpozisyon chimik CD ak pwodwi trete li yo, sepandan, kantite eleman yo te jwenn yo diferan nan mitan CD ak pwodwi trete li yo.

Varyasyon nan konpozan chimik pwodwi trete yo te itilize lojisyèl Simca-P 13.0 pou analize matris done miltivarye a. Anvan PCA, tout varyab yo te santre mwayen ak Pareto-echèl, ki te swiv pa idantifikasyon varyab potansyèl diskriminatwa. Nan yon konplo nòt PCA, chak pwen te montre yon echantiyon endividyèl. Echantiyon ki te montre resanblans nan eleman chimik yo te gaye adjasan youn ak lòt, pandan y ap sa yo ki te montre varyasyon nan eleman yo te divize. Jan yo wè nan PCA (Fig.4), gwoup CD-HP te separe de gwoup CD ak CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 ak P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Soti nan Fig.8, nou jwenn entansite nan acteoside (54), cistanoside C (74), campneoside I (43), osmanthuside (75), ak 2'-actylactoside (80) ki gen 4'-O-caffeoyl gwoup nan 8-O- -pati D-glucopyranosyl la (gade Fig. 9) diminye apre yo te trete pa diri-diven, pandan y ap entansite isoacetoside (60), se castanoside (71), iso-campneoside I. (69), izomartynoside (86) ki gen gwoup 6'-O-kafeoyl (gade Fig. 9) ogmante, espesyalman pou gwoup CD-NP. Menmsi tubuloside B (72) gen yon gwoup 6'-O-caffeoyl, menm jan ak isoacteoside, entansite a diminye akòz gwoup 2'-acetyl li yo. Entansite echinacoside(38) ak cistanoside B ki gen gwoup 6'-O- -D-glucopyranosyl ogmante, men entansite tubuloside A (55) diminye tou akòz gwoup 2'-acetyl li yo.

Ekip rechèch nou an te etidye tou estabilite tèmik acteoside ak isoacteoside epi li te jwenn ke acteo-side te enstab nan dlo, metanol, ak solisyon diven diri jòn, epi yo ka konvèti nan isoacteoside an pati nan kondisyon chofaj. Men, thermostabilité isoacteoside te pi bon, espesyalman nan jòn diri diven solisyon. Figi 10 te montre chanjman posib PhG nan CD pandan pwosesis la:

Idantifikasyon metabolit yo nan rat Soti nan done espektometri mas-wo rezolisyon, pwa molekilè egzat ak konpozisyon eleman pou metabolit ak konpoze molekil proto yo te analize ak konpare. Kòm menm kalite konpoze nan TCM te montre resanblans nan modifikasyon metabolik, korelasyon yo nan elektè fitochimik nan vitro ka pwolonje nan metabolit yo nan vivo. Pandan se tan, ki baze sou chemen biotransformation konvansyonèl yo, yo te dedwi yon chanjman rezonab nan pwa molekilè. Finalman, metabolit yo te idantifye lè yo analize spectre mas MSE metabolit yo ak chemen fragmentasyon proto-konpoze nan spectre mas la [21, 22]. Konpare ak echantiyon vid la, eleman li yo te idantifye nan vivo ki baze sou enfòmasyon yo bay nan spectre chromatogram-mas, posibilite pou yon reyaksyon metabolik, karakteristik sa yo nan estrikti nan konpoze, ak règ la fwagmantasyon nan spectre mas li yo. Gade Tablo 3.

Idantifikasyon metabolit phenylethanol glycosides ki gen rapò

Platfòm UNIFI te itilize pou trete. Figi 11 te montre kwomatograf TIC nan pipi, poupou, ak plasma pou CD ak pwodwi trete li yo. Konpare ak echantiyon vid yo, yo te idantifye yon total de 54 metabolit nan rat, ki gen ladan 10 eleman pwototip ak 44 metabolit, nan ki 24, 49, ak 6 te nan poupou, pipi, ak plasma, kòmsadwa.

Dapre mas egzat, kaskad fwagmantasyon, ak pèt net previzib pa biotransformation, yo te evalye yon total de 35 metabolit ki asosye ak glikozid feniletanoid. Metabolit ki gen rapò ak glikozid feniletanoid yo gen menm modèl fragman mas spectre, tankou fragman dekafeoyl tipik m/z 461.1605, Lè sa a, plis idrolize pa lyezon glikozidik ak ester nan vivo, ak metabolize nan idroksitirosol (HT) (m/). z153.0504, C.HO.4.73 min) ak asid kafeyik (CA) (m/z179.0389, CH, O0.77 min), gade Fig.12A.

M11 endike [MH] ~ nan m/153.0504 ak fòmil sa vle di, C.HO, epi idantifye kòm HT. M16 prezante [MH]- nan m/z 329.0851, ki te 176 Da elve pase sa yo ki nan HT, revele ke li ta ka yon metabolit glucuronidated nan HT. [MH]-M26 a te nan m/z 343.1037,14 Da pi wo pase HT-glucuronide. Se poutèt sa, M26 te idantifye kòm HT-methylated glucuronide. M17 te idantifye kòm HT-sulfat ki baze sou li [MH]-nan m/z 233.0112,80 Da sou HT a, ki ta ka plis methylated, Lè sa a, pwodwi M22, ki te montre m/z 247.0278 la, ki endike ke li te HT- metabolit sulfate methylated. M7 (m/167.0335) ak M5 (m/z 167.0762) yo te konsidere kòm pwodwi oksidasyon ak methylated HT, respektivman (Fig.12B).

M1 te endike [MH]- nan m/z 179.0389, elisid fòmil molekilè te CH-O ak idantifye kòm asid kafeyik (CA). ke li ta ka yon metabolit glucuronidated nan CA. M27 te gen m / z 258.994, ki te 80 Da pi wo pase sa yo ki nan CA, se konsa nou elisid li kòm silfat CA, epi li te kapab pwodwi M35 (m / z 273.0064). Kòm M4 bay [MH] 7 a nan m/z 193.0524,14 Da pi wo pase CA, li te idantifye kòm metabolit CA methylated. M39 te CA dehydroxylation metabolit, ak m/z 163.04, epi li te kapab sulfate nan M32 (m/z 242.9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9.06 min) se te pwodwi rediksyon CA, ki se 3,4-dihydroxy-benzènpropionik asid, ki ta ka methylated nan M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 ta ka dezidrate nan M43, sa vle di 3-HPP (m/z 165.0558, C9H10O3, 11.29 min), ak M31 (m/z 341.0942, C15H17O9, 8.90 min) ak M29 (m/z 0125O3, 11.29 min) 8.52 min) yo te pwodwi glucuronidated ak sulfat (figi 12C).

Pou metabolit phenylethanoid glycosides ki asosye, kle kaskad metabolik yo te faz II reyaksyon metabolik, sa vle di, glucuronidation, methylation, ak sulfatasyon. Yo pwopoze kaskad metabolik feniletanoid yo montre nan Figi 13.

Idantifikasyon metabolit ki gen rapò ak iridoid

Lè nou analize konpozisyon elemantè metabolit yo, fwagmantasyon MSE, ak literati ki asosye yo, yo te evalye yon total de 19 metabolit ki asosye ak iridoid. Glikozid iridoid yo te idrolize pa lyezon glikozidik pou fòme aglycones korespondan yo. M/z 185.117 la te pou M8, 162 Da mwens pase ajugol, ki te bay nan pèt rezidi glikoz la.

M40(m/z 199.0641, Rt 10.91 min) se te pwodwi deglycosylated katalpol. M45 m/z 169.0487, Rt 12.15 min) te mwens pase 30 Da sa yo ki nan metabolit deglycosylated catalpol, epi li te idantifye kòm retire nan yon molekil nan CH, O metabolit. M34(m/z 151.0352, Rt 9.08 min), li te genyen plis pèt H, O metabolit.

M44(m/z 211.0665, Rt 11.31 min) se te yon metabolit deglycosylated geniposide, ak M37 (m/z 197.0833, Rt 15.03 min) te deglycosylation nan 8-epideoxyloganic asid. Reyaksyon metabolik pou iridoid yo ta ka revele kòm metabolis faz I nan deglycosylation (figi 12D).

Konparezon pwofil metabolik nan plasma, pipi, ak poupou ant CD ak pwodwi trete li yo

2 pwototip nan plasma, 7 nan pipi, ak 3 nan poupou yo te konpare. Te gen 7 pwototip absòbe nan CD, 7 pwototip absòbe nan CD-NP, ak 8 pwototip nan CD-HP. M21 te sèlman detekte nan gwoup poupou nan CD-NP, ak M38 ak M51 yo te detekte jis nan gwoup pipi nan CD-HP. Konpare ak metabolit, metabolit ki idantik nan plasma, pipi, ak poupou yo te 4, 42, ak 21, respektivman. Te gen 34 metabolit absòbe nan gwoup la CD, 39 nan CD-NP, ak 40 nan gwoup la CD-HP. M5, M7, M40, ak M52 te sèlman detekte nan gwoup CD-NP, pandan y ap M24, M4l, ak M48 te jis detekte nan gwoup CD-HP.

Varyasyon yo te obsève nan absòpsyon an ak metabolis nan konpoze aktif nan divès pwodwi trete nan CD. Soti nan Fig.14, nou te jwenn ke entansite a nan HT-sulfat konjigezon (M17) te pi wo a nan pipi a, ki te swiv pa 3-HPP silfat konjigezon (M29), methylated HT silfat konjigezon (M22), dehydroxylated silfat CA konjigezon (M32), ak 3,4-dihydroxy benzèn propionik asid silfat konjigezon (M19). Kontni an nan pwodwi metabolik nan gwoup la trete te pi wo pase nan gwoup la CD, espesyalman pou M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Gwoup 6'-O-kafeoyl précurseur yo nan pati 8-O{- -D-glucopyranosyl, konpoze, tankou hydroxytyrosol, gen pwopriyete anti-timè, anti-enflamatwa, anti-bakteri, antiviral ak antifonjik [ 23]. Asid kafeyik posede aktivite anti-enflamatwa, anti-kansè ak antiviral [24]. Li te konsistan avèk itilizasyon klinik CD ak pwodwi trete li yo.

Diskisyon

CD se yon TCM, ak pi gwo konpozan bioaktif li yo, ki gen ladan PhG, iridoid, polisakarid yo te dokimante pa etid rechèch divès kalite. Nan pratik klinik TCM, pwodwi yo trete nan CD yo te lajman itilize parapò ak sa yo anvan tout koreksyon. Konpozisyon chimik la pral chanje pandan pwosesis la, ki ka mennen nan chanjman nan efè medsin yo (figi 14).

PhG yo se yon kalite konpoze fenolik ki karakterize pa yon estrikti -glucopyranoside ki gen yon moye idroksi-phenylethyl kòm aglycone la. Konpoze sa yo souvan gen ladan asid kafeyik ak ramnoz tache ak rezidi glikoz la atravè ester oswa lyen glikozidik respektivman. Nan etid aktyèl la, analiz kalitatif CD, CD-NP. ak CD-HP te pote soti, ak yon total de 97 konpoze, ki gen ladan glikozid phenylethanoid (PhGs), iridoid, elatriye yo te idantifye. Rezilta yo jwenn yo te montre varyasyon nan konpozisyon chimik anvan ak apre pwosesis. Entansite PhGs ki gen gwoup 4'-O-kafeoyl nan pati 8-O{- -D-glucopyranosyl, tankou acteoside, cistanoside C, campneoside II, osmanthus-side diminye apre yo fin trete, pandan y ap PhGs. ak

tankou isoacetoside, isocistanoside, isocampneoside I, isomartynoside ogmante, espesyalman nan gwoup la CD-NP. Entansite echinacoside ak cistanoside B ki gen estrikti posede 6'-O- -D-glucopyranosyl moyete ogmante tou. PhG ki gen yon gwoup 2'-acetyl souvan diminye akòz reyaksyon idroliz pandan pwosesis la, tankou tubuloside B, 2-acetylatteoside.

Envestigasyon nan metabolit absòbe nan vivo te pote soti apre administrasyon oral nan CD ak pwodwi trete li yo. Pwosesis metabolik yo nan faz II yo te kaskad kle yo ak pi fò nan metabolit yo te silfat, glukoronid, ak konjige methylated. Phenylethanol glikozid gen absòpsyon oral ki ba ak itilizasyon. Yo difisil yo dwe absòbe nan san an epi yo aji kòm ansèyman yo jwe wòl yo apre aktivasyon metabolik nan vivo. Feniletanoid ki pwodui nan fenileta-nolaglikon, tankou idroksitirosol (HT) ak asid kafeyik (CA) ak derive li yo 3-hydroxyphenylpropionic acid (3-HPP), metabolit sa yo ka pi fasil absòbe nan plasma a epi yo gen yon pi bon efè medsin.

CD ak pwodwi trete li yo. Konjigezon HT-sulfat (M17) gen entansite ki pi wo nan pipi a, ki te swiv pa 3-HPP silfat konjigezon (M29), methylated HT silfat konjigezon (M22), dehydroxylated CA sulfat konjigezon (M32), ak 3,{{ 7}}dihydroxy benzenepropionic asid silfat konjigezon (M19). Kontni an nan pwodwi metabolik nan gwoup la trete te pi wo pase nan gwoup la CD, espesyalman pou M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Anjeneral, eleman ki gen gwo ekspoze nan ògàn sib yo ta ka efikas. Yon kantite ase nan fenilethanoid ak dérivés yo te evalye ak detèmine nan vitro. Acteoside se karakteristik nan konpoze, ki gen kontni diminye apre yo te trete pa diri-diven, ak kontni an nan isoacteoside, isocistanoside C, isocampneoside I ogmante korespondan. Pwodwi degradasyon PhG yo, tankou CA ak HT dérivés, ta ka evalye nan echantiyon bio yo, ak pwosesis diri-diven ka amelyore absòpsyon metabolit yo nan vivo.

Konklizyon

Nan etid sa a, 97 konpoze yo te detekte nan ekstrè yo nan CD ak pwodwi trete li yo. Degradasyon kèk glikozid te fèt anba yon tanperati ki wo e kòm yon rezilta, kèk nouvo izomè ak konplèks yo te sentèz. Nan etid in vivo, konpozan pwototip (10) ak metabolit (44) yo te detèmine oswa pwovizwaman evalye nan plasma rat, poupou, ak pipi. Faz II pwosesis metabolik yo te kaskad kle yo, pi fò nan metabolit yo te asosye ak echinacoside oswa akteozid, tankou HT, CA ak dérivés yo 3-hydroxyphenylpropionic acid 3-HPP. Metabolit sa yo ka pi fasil absòbe nan plasma a epi yo gen yon pi bon efè medsin. Rezilta yo jwenn yo te montre ke konpozisyon chimik nan CD te diferan ak afekte dispozisyon konpoze an nan vitro ak nan vivo.

Abreviyasyon yo

PhGs: Phenylethanoid glikozid; CD: Cistanche deserticola; CMM: Chinwa Materia Medica; TCM: Medsin tradisyonèl Chinwa; CD-NP: Gistanche deserticola Pwosesis pa vapè ak diri-diven anba presyon nòmal; CD-HP: Cistanche deserticola Pwosesis pa vapè ak diri-diven anba presyon ki wo; UPLC-Q-TOF-MS: Ultra-wo pèfòmans likid chromatografi makonnen ak TOF-MS; PCA: Analiz prensipal eleman; VIP: Varyab enpòtans pou pwojeksyon an;CA: Kafeikasid; HA: Hydroxytyrosol.

Rekonesans

Pa aplikab.

Kontribisyon otè yo

LZ, LBN, SJ te patisipe nan redaksyon, ekri maniskri a. RJ, LPP te ede ak eksperyans bèt yo epi li te ekri ak finalize tout figi ak tablo yo. ZC, HY. ITZ te ede ak konsepsyon ak pèfòmans etid sa a epi li te revize maniskri a. Tout otè li epi apwouve maniskri final la.

Finansman

Travay sa a te sipòte pa Fondasyon Nasyonal Syans Natirèl Lachin nan (sibvansyon No:81874345) ak Fondasyon Syans natirèl nan pwovens Liaoning (sibvansyon No: 2020-MS-223).

Disponibilite done ak materyèl

Ansanm done yo itilize ak/oswa analize pandan etid aktyèl la disponib nan men otè ki koresponn lan sou demann rezonab.

Deklarasyon

Apwobasyon etik ak konsantman pou patisipe

Yo te jwenn apwobasyon etik pou itilize bèt eksperimantal pou etid sa a nan Komite Etik Medikal Liaoning University of Traditional Chinese Medicine (Nimewo apwobasyon: 2018YS(DW)-044-01), Tout pwosedi eksperimantal nan etid sa a te anba estanda etik nan Komite Etik medikal nan Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

Konsantman pou piblikasyon

Pa aplikab.

Enterè konpetisyon

Otè yo deklare ke yo pa gen okenn konfli enterè yo divilge.

Detay otè

'Depatman pharmaceutique, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian, Liaoning, China.'Drog Research Institute of Monos Group, Ulaanbaatar 14250, Mongoli.

Resevwa:31 me 2021 Aksepte:17 septanm 2021 Pibliye sou entènèt: 28 septanm 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 ak Tianzhu Jia1

Referans

1. Chinwa Pharmacopeia Komisyon. Pharmacopeia nan Repiblik Pèp la nan Lachin, vol. I. Beijing: Lachin Medikal Syans Press; 2020. p. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): youn nan pi bon kado pharmaceutique nan medikaman tradisyonèl Chinwa. Devan Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Efè diferan metòd pwosesis siye pou Fresh Cistanche deserticola sou kontni eleman li yo. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimizasyon pwosesis vapeur wo-presyon pou Cistanches Herba. Chin Trad Patant Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Efè Cistanches herba anvan ak apre pwosesis sou fonksyon anti-aje ak fonksyon iminitè nan rat aje D-galaktoz-induit. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Etid sou konstitiyan laksatif nan Cistanche deserticola YMCA. Modèn Chin Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Etid sou fonksyon neuroendocrin-iminitè Cistanche deserticola ak pwodwi vapeur diven diri li yo nan modèl rat glucocorticoid-induit. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Amelyorasyon nan fonksyon dinamize ren nan modèl la sourit pa Cistanches herba cheche rapidman nan yon tanperati mwayen-segondè. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Dezè ginseng": yon revizyon. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Yon apèsi sou pwopriyete chimi, farmakoloji, ak farmakokinetik li yo. J Ethnopharmacol col. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): yon revizyon nan fitochimik li yo ak famasi. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Efè neuroprotective echinacoside nan modèl MPTP sourit maladi Parkinson la. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Efè pwoteksyon tubuloside B sou apoptoz TNF alfa-induit nan selil newòn yo. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Anti-enflamatwa iridoid soti nan tij yo nan Cistanche deserticola kiltive nan dezè Tarim. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Phenylethanoid glikozid ak aktivite anti-enflamatwa soti nan tij yo nan Cistanche deserticola kiltive nan dezè Tarim. Fitoterapia. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoid ak acyclic monoterpene glycosides, kankanosides L, M, N, O, ak P soti nan Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF, et al. Yon nouvo estrateji pou eksplore rapid makè chimik potansyèl pou diskriminasyon ant Radix Rehmanniae kri ak trete pa UHPLC-TOF-MS ak analiz estatistik miltivarye. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Chanjman nan nivo glikozid phenylethanoid, aktivite antioksidan, ak lòt karakteristik kalite nan Cistanche deserticola tranch pa pwosesis vapè. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Chanjman kontni nan sis glikozid phenylethanoid anba tan vapeur ak diven nan Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Efè pwosesis la vapè sou bon jan kalite a nan postharvest cistanche deserticola pou itilizasyon medsin pandan siye solèy la. Biol Pharm ti towo bèf. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolit nan acteoside dyetetik: Des, izolasyon, idantifikasyon, ak kapasite epatoprotective. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Karakterizasyon sistematik metabolit echinacoside ak acteoside soti nan Cistanche tubulosa nan plasma rat, kòlè, pipi ak poupou ki baze sou UPLC-ESI-Q-TOF. - MS. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: yon konpoze natirèl ak aktivite famasi pwomèt. J Biotechnol. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, a versatile pharmaco phore: an overview. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Nòt Piblikatè a

Springer Nature rete net anrapò ak reklamasyon jiridiksyon nan kat pibliye ak afilyasyon enstitisyonèl.