Efè apoptotik polisakarid Cistanche sou lesemi

Otè:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Mongoli enteryè, Lachin

Pou envestige efè apoptotik nanCistanche polisakarid( CDP) sou mounlesemi egiliy selilè selil Jurkat.MetòdYo te aplike tès MTT pou detekte efè CDP sou pwopagasyon selil yo, Western blotting yo te itilize pou detekte aktivasyon kaspas-9 ak kaspas-3, ak molekil siyal apoptotik yo te teste tou.Ｒ rezilta yoPwopagasyon selil T te anpeche pa 1 mg / ml ak 2 mg / ml CDP, Apoptoz selil T te pwovoke pa 5 mg / ml CDP, epiekspresyon pro-caspase-9 ak pro-caspase-3 yo te redwi anpil. Ekspresyon yo nan reseptè sifas selil CD45 ak CD71 yo te siyifikativman inibit pa 5 mg / ml CDP, Fosforilasyon EＲK te pwovoke, ak fosforilasyon JNK te anpeche.

Konklizyon

【Mo kle】Cistanche polisakarid; Apoptoz; Ｒeceptor; kaspas-9; kaspas-3

Lesemi lenfoblastik egi (ALL) se yon maladi klonal malfezan nan sistèm lenfatik la ak yon wo degre de eterojenite imunofenotip. , fasil pou rplonje, ak sou sa. Kounye a, metòd tretman souvan itilize yo enkli transplantasyon mwèl zo, terapi endiksyon, imunoterapi, chimyoterapi konbine, elatriye. Akòz kapasite limite pifò dwòg chimyoterapi pou vize ak touye timè yo, yo ka lakòz gwo domaj nan sistèm dijestif la, sistèm san, kadyovaskilè ak serebwo vaskilè, elatriye Pandan w ap resevwa tretman, li souvan akonpaye pa gwo reyaksyon negatif, kèk nan yo ki menm fatal. Kòm chimyoterapi pwogrese, kò a gen tandans devlope tolerans nan dwòg chimyoterapi, ogmante risk pou yo repete maladi.

Se poutèt sa, rechèch la pou trè efikas, ba toksisite, ak trè vize terapi lesemi oswa terapi adjuvant yo te vin konsantre nan atansyon aktyèl la.Cistancheyo rele Chagangaoya nan Mongolyen. Li fè pati fanmi Ledangaceae ak genus Cistanche. Li se parazit sou rasin yo nan pye bwa dezè epi li gen repitasyon nan "dezè ginseng".

Prensipal engredyan aktif nan Cistanche gen ladan glikozid phenylethanoid, lignan, betain, sterol, asid amine, ak polisakarid. Anti-enflamatwa, antiviral, antioksidan, règleman iminitè ak lòt efè.

Etid yo te jwenn saCistanche polisakarid (CDP),kòm youn nan eleman prensipal aktif li yo,gen efè anti-timè ak imunomodulateur.Chèchè yo te jwenn ke CDP gen yon gwo efè touye sou selil lesemi K562 ak THP-1, epi li sijere ke CDP gen yon sèten wòl nanprevansyon oswa tretman lesemi. Anplis de sa, nan konpoze an medikaman tradisyonèl Chinwa, cistanche, pou tretman an egilesemi, Cistanchetou jwe yon wòl kòm youn nan eleman enpòtan yo. Sepandan, mekanis espesifik nan aksyon nanCistanchepa konnen. Nan papye sa a, izòlman an ak pirifikasyon nanCistanche CDPyo te etidye, ak efè a touye ak mekanis ki gen rapò nan CDP sou liy imen an egi lesemi selil Jurkat yo te envestige.

1.1 Pwensipal réactifs ak enstriman

Cistanche poud te achte nan men Sichuan WecistancheGroup Co, Ltd., liy selil lesemi egi imen Jurkat te achte nan bank selil Shanghai Enstiti Biyoloji selilè, thiazole ble (MTT) ak sodyòm dodecyl sulfat (SDS) te achte nan men Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology co, Ltd., fetal bovine serum (FBS) te achte nan Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., ki gen sistein ki gen caspase-3, caspase-9, CD71, CD45, Phosphorylated c-Jun amino-terminal kinase (p -JNK) ak antikò kinaz kinaz (p-ERK) ki gen siyal ki reglemante fosforil (p-ERK) yo te achte nan men Cell Signaling Technology, USA, epi yo te achte antikò aktin nan Shanghai Biyuntian Biotechnology Co, Ltd Electrochemical Substra luminesans (ECL) la te achte nan men Thermo. Konpayi syantifik nan peyi Etazini, ak lòt reyaktif yo te nan klas analyse domestik. Gel-View 6000 plis estasyon imaj entèlijan (pwodwi Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), Revolve FL mikwoskòp fluoresans tèt anba (pwodwi Echo Laboratories, USA), lektè microplate EPOCH (pwodwi Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd.).

1.2 Separasyon ak pirifikasyon nan CDP Pran 500 g nanCistanche ekstrè poud, tranpe l 'nan 95 pousan etanòl lannwit lan, filtre li ak twal gaz, kolekte rezidi nan filtre, bouyi li ak dlo cho nan 60 degre pou 2 h / tan, yon total de 3 fwa. Apre fen a, filtraj yo te konbine twa fwa, konsantre anba presyon redwi a 2/3 nan volim orijinal la, te ajoute 3 fwa volim nan 95 pousan etanòl, ak pèmèt yo kanpe nan 4 degre lannwit lan. Nan demen, santrifize nan 4 000 r/min pou 10 minit, kolekte presipite a, retire pwoteyin pa metòd Sevag, presipite ak etanòl absoli, friz-sèk pou jwenn CDP.

1.3 Kilti selil Liy selil lesemi imen imen an te estoke nan nitwojèn likid nan laboratwa Jurkat. Lè yo itilize, selil yo te rapidman refè nan yon beny dlo 37 degre ak kiltive nan mwayen RPMI1640 (ki gen 100 U / ml penisilin ak 100 U / ml streptomycins) ak 10 pousan FBS. Selil yo te kiltive nan yon enkibatè selil 37 degre, 5 pousan CO2, pase chak 2 a 3 jou, epi eksperyans yo te fèt lè selil yo te antre nan faz kwasans logaritmik.

1.4 MTT eksperyans selil Jurkat nan faz kwasans logaritmik yo te pran, santrifuje yo jwenn grenn selil, epi konte nan 5 × 105 selil / ml. Pran yon 96-plak kilti selil byen, bay 100 ul selil nan chak pi, epi ajoute 100 ul RP-MI1640 mwayen konplè kòm yon gwoup kontwòl; gwoup eksperimantal la te divize an 3 gwoup, premyèman lè l sèvi avèk RPMI1640 mwayen pou prepare diferan konsantrasyon nan CDP, ak Lè sa a, ajoute 100 ul nan mwayen RP-MI1640 nan chak pi. Selil ul Jurkat ak 100 ul CDP solisyon yo te itilize pou fè konsantrasyon final CDP nan 1, 2, ak 5 mg/ml, respektivman. Chak gwoup te mete kanpe ak 5 pwi kopi ak enkubasyon nan yon enkibatè selil 37 degre pou 48 èdtan. Apre enkubasyon an, ajoute 20 ul nan MTT (konsantrasyon an nan solisyon an stock se 5 mg / ml) nan chak pi, mete l 'tounen nan enkibatè selil la, epi kontinye enkubasyon pou 4 èdtan, epi finalman ajoute 100 ul nan 20 pousan. SDS pou fonn formazan nan 37 degre lannwit lan, epi sèvi ak li jou kap vini an. Yon lektè microplate te detekte absorbans nan 570 nm chak gwoup, epi yo te kalkile pousantaj anpèchman diferan konsantrasyon CDP sou pwopagasyon selil Jurkat pa fòmil.

1.5 Western blotting selil Jurkat nan faz kwasans logaritmik yo te pran epi simen nan yon plak 6-byen nan yon dansite 2 × 105 selil / ml, 500 ul / pi, epi yo te ajoute 500 ul RPMI1640 mwayen konplè nan kontwòl la. gwoup. Mete kanpe 3 gwoup eksperimantal, 1, 2, ak 5 mg / ml gwoup tretman polisakarid, CDP

Fonn nan RPMI1640 mwayen konplè alavans, 500 ul selil ak 500 ul solisyon CDP nan diferan konsantrasyon yo te ajoute nan plak la 6-byen epi enkube a 37 degre pou 48 èdtan. Apre kilti a, yo te kolekte sispansyon selil chak gwoup, santrifuje nan 1 500 r/min pou 5 min pou jwenn granules selilè, epi lave de fwa ak saline tampon fosfat (PBS) pre-refwadi. Apre lave yo, yo te ajoute 20 ul tanpon selil liz nan chak gwoup, epi selil yo te lysed sou glas pou 30 min. Pwoteyin total te ekstrè epi konsantrasyon selil la ajiste lè l sèvi avèk metòd Bradford la. Yo te pran 20 ug pwoteyin nan chak gwoup pou elektwoforèz jèl SDS-polyacrylamide (PAGE), epi yo te transfere pwoteyin nan nan manbràn polyvinylidene fliyò (PVDF) pa elektwoporasyon. Bloke ak poud lèt san grès nan tanperati chanm pou 1 èdtan, te ajoute antikò lapen anti-moun kaspas-3 ak kaspas-9 nan yon rapò dilution de 1:1 000, enkubate nan tanperati chanm pou 1. h, rense 3 fwa ak yon shaker tanpon fosfat Tween (PBST) (10 min/tan), ajoute antikò segondè ki gen etikèt sou peroksidaz refor (HRP) (1:1 000), enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm, rense. 3 fwa ak PBST, rense 1 fwa ak PBS, ajoute ECL substrate, epi sèvi ak estasyon travay imaj entelijan an te itilize pou D, ak chanjman gwoup yo nan chak gwoup yo te konpare ak etidye apoptoz nan selil Jurkat pwovoke pa CDP. Pou deteksyon pwoteyin ki gen rapò ak wout apoptoz, kilti selil ak kondisyon tretman CDP yo te menm jan ak pi wo a. Apre reyaksyon an, selil yo te lysed pou quantification pwoteyin. Pwoteyin nan te transfere nan manbràn PVDF pa SDS-PAGE ak elektwoporasyon. Apre bloke ak poud lèt ekreme pou 1 èdtan, yo te ajoute antikò anti-CD71, CD45, p-JNK ak p-ERK (1:1 000), epi yo te enkube nan tanperati chanm pou 1 èdtan. Antikò segondè ki make HRP a (1:1 000) te enkube pou 1 èdtan, epi finalman, yo te itilize estasyon travay imaj entèlijan an pou imaj pou etidye molekil siyal ki gen rapò ak CDP-pwovoke apoptoz selil Jurkat. Gwoup eksperimantal ki te lakòz yo te gri-echèl ak Imaj J (1.8.0).

Klike la a pou konnen efè Cistanche sou efè anti-timè ak anti-kansè

1.6 Analiz estatistik SPSS21.0 Yo te itilize lojisyèl pou tès t ak analiz divèjans.

2 rezilta Cistanche fonksyon soulesemi

2.1 Nivo pwopagasyon selilè

CDP a te izole avèk siksè, ak plis pase 9{{20}} pousan kontni sik ak mwens pase 5 pousan kontni pwoteyin. Pousantaj anpèchman pwopagasyon selil yo nan gwoup CDP 1 mg/ml te (19. 1 ± 2. 1) pousan, pandan ke nan gwoup CDP 2 mg/ml ak 5 mg/ml yo te (44. 2 ± 5. 2). ) ) pousan ak ( 47. 8 ± 4. 4) pousan , ki endike ke CDP ka siyifikativman anpeche pwopagasyon selil Jurkat nan yon fason ki depann de dòz la. 2.2 Konpare ak gwoup kontwòl la (0.62±0.04, 0.56±{{0}}.{{49 }}7), nivo apoptoz nan selil Jurkat trete ak 5 mg/ml CDP te lakòz anzim kaspas-9 ak kaspas{{30}}. Pro-form pro-caspase-9 ( 0. 09 ± 0. 02) ak pro-caspase-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) te siyifikativman redwi, ak gwoup CDP 1 mg/ml ak 2 mg/ml yo te siyifikativman mwens efikas pou pro-caspase-3 nan selil yo. Caspase-9 (0.58±0.04, 0.51±0.01) ak pro-caspase-3 kontni (0.48±0.04, 0.44±0.05) pa te gen okenn efè enpòtan, se sa ki ba, konsantrasyon nan CDP pa t 'pwovoke. apoptoz nan selil Jurkat, men sitou anpeche pwopagasyon selil, jan yo montre nan Figi 1.

1-4: gwoup referans,

1 mg / ml gwoup CDP, 2 mg / ml gwoup CDP, 5 mg / ml gwoup CDP; menm jan ak figi sa a

Figi 1 Efè CDP sou kaspas-9 ak kaspas-3 nan selil Jurkat

Enfliyans polisakarid Cistanche Efè sou lesemi

2.3 Nivo ekspresyon relatif CD71 ak CD45 nan gwoup kontwòl reseptè apoptoz la te 1.00±0.04, {{10}}.54± 0.{{20}}2. Gwoup CDP 5 mg/ml ta ka siyifikativman anpeche CD71 (0.05±0.02). 01) ak CD45 (0. 13 ± {{4{0}}. 03); 1 mg/ml ak 2 mg/ml CDP gwoup yo te kapab anpeche ekspresyon CD71 (0. 52 ± 0. 06, 0. 43 ± 0. 07) nan yon sèten limit Pa te gen okenn efè enpòtan sou ekspresyon CD45 (0.51). ±0.01, 0.48±0.02). Gade figi 2.

Figi 2 Efè CDP sou ekspresyon reseptè yo sou sifas manbràn selilè a

2.4 Chemen ki gen rapò ak apoptoz

Nivo ekspresyon relatif p-JNK ak p-ERK nan gwoup referans lan te 1.20±0.08 ak 0.21±0 .03, respektivman. Gwoup CDP 5 mg/ml pwovoke apoptoz ak siyifikativman redwi nivo fosforilasyon JNK. (0. 32 ± 0. 04), siyifikativman ogmante nivo fosforilasyon ERK (1. 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP ogmante nivo fosforilasyon JNK (1. 12 ± 0. 06, 1. 06 ± 0. 06) pa te gen okenn efè enpòtan, men yo toujou ogmante nivo fosforilasyon ERK. (0. 54 ± 0. 04, 0. 63 ± 0. 02). Gade figi 3.

Figi 3 Efè CDP sou fosforilasyon JNK ak ERK

3 Diskisyon

Nan dènye ane yo, etid yo te jwenn ke CDP gen yon sèten efè inhibition sou liy selil lesemi, men mekanis espesifik aksyon an poko konnen.

Nan pwosesis apoptoz la, kaspas-9 se youn nan molekil siyal en nan pwosesis apoptoz ki depann de kaspas la. Apre eksitasyon siyal, pro-caspase-9 idrolize twouve pou pwodui yon fòm aktive nan kaspas kliv-9, ki kontinye transmèt siyal apoptotik anba pou ankouraje pwosesis apoptoz la. Caspase-3 se yon molekil kaspase ki kalite efèktè e li se yon molekil siyal kle nan pwosesis apoptoz selilè ki depann de kaspas. Li egziste tou nan fòm pro-anzim (pro-caspase-3) nan kondisyon nòmal. Yon fwa aktive pa idroliz, se yon gwo kantite cleaved-caspase pwodui. -3, li pral lise yon varyete molekil pwoteyin kle nan selil yo epi evantyèlman pwovoke apoptoz. CDP fè pati polisakarid aktif makromolekil byolojik epi li pa ka antre nan selil yo nan manbràn selilè a. Se poutèt sa, CDP pwovoke apoptoz pa afekte ekspresyon ak distribisyon reseptè sou sifas manbràn selil Jurkat, kidonk transmèt siyal nan enteryè selil yo, epi finalman aktive fanmi caspase la. pwoteyin, ki mennen nan apoptoz selilè. Etid sa a montre ke konsantrasyon ki ba nan CDP pa pwovoke apoptoz nan selil Jurkat, men sitou inibit pwopagasyon selil yo. CD71, ke yo rele tou reseptè transferrin, se yon reseptè glikoprotein transmembrane tip II ki enplike nan absòpsyon fè ak règleman kwasans selil ak devlopman. CD71 trè eksprime nan pasyan ki gen lesemi egi epi li asosye ak rezistans dwòg prensipal, se sa ki ekspresyon CD71. Plis valè a pi wo, se pi mal efè premye chimyoterapi a. Se poutèt sa, CD71 se youn nan makè yo pou dyagnostik oksilyè. CD45 eksprime sou sifas tout kalite lekosit, ke yo rele tou lekosit antijèn komen. Li fè pati glikoprotein transmembrane tip I epi li gen rapò ak devlopman ak diferansyasyon selil T yo. CD45 gen diferan nivo ekspresyon ak kalite allosteric nan diferan kalite lesemi, kidonk li ka itilize kòm youn nan makè yo pou dyagnostik diferans ak imunofenotip nan lesemi. Antikò monoklonal CD45 te lajman itilize nan tretman lesemi, espesyalman lesemi ki reziste dwòg. Friesen et al. te jwenn ke radyonukleid

Tagged CD45 mAb ka pwovoke apoptoz nan liy selil lesemi ki reziste dwòg lè yo aktive pwoteyin fanmi kaspase (ki gen ladan caspase-3, kaspase-8, ak kaspase-9). CDP pwovoke apoptoz nan selil Jurkat, premyèman pa aji sou reseptè sifas manbràn selilè CD45 ak CD71, ki afekte ekspresyon ak distribisyon de yo, transmèt siyal apoptoz nan selil yo, epi finalman aktive caspase-9 ak kapase{{8. }}, deklanche apoptoz. Sepandan, tou de kaspas-9 ak kaspas-3 yo lokalize anba chemen apoptotik la, epi molekil siyal ki amont yo bezwen plis eksplore. Nan etid sa a, CDP nan yon konsantrasyon nan 5 mg / ml pwovoke apoptoz nan selil Jurkat pandan y ap anpeche ekspresyon nan CD45, ki te menm jan ak sa yo ki nan antikò monoklonal CD45 ki dekri pi wo a. Se poutèt sa, nan pèspektiv nan reseptè ki gen rapò ak apoptoz CD45 ak CD71,Cistanchegen yon sèten potansyèl pou tretman oswa tretman adjuvant nan lesemi.Sistèm mitogen aktive pwoteyin kinaz (MAPKs) yo eksprime nan tout selil ekaryotik.

Tablèt Cistanche pou amelyore sistèm iminitè nan tretman lesemi

Li se yon chemen transmisyon enfòmasyon trè enpòtan ki fè transdiksyon siyal eksitasyon ekstraselilè nan entraselilè a epi li konpoze de serine / treonin pwoteyin kinaz, ki gen ladan ERK, JNK, ak p38MAPK. Fosforilasyon li yo ak dephosphorylation yo se switch nan aktivite lavi selil yo epi yo patisipe nan Ak kontwole pwosesis la nan kwasans selil, pwopagasyon, diferansyasyon, aktivasyon ak apoptoz. Etid sa a sijere ke JNK dephosphorylation patisipe nan CDP-induit apoptoz selil T, pandan y ap fosforilasyon ERK patisipe nan de pwosesis yo nan ke CDP inibit pwopagasyon selil ak pwovoke apoptoz.

An konklizyon,Cistanche CDPgen yon efè sitotoksik sou liy selil T-lenfositik lesemi Jurkat, ki montre ke konsantrasyon ki ba (anba a 2 mg / ml) anpeche pwopagasyon selil, pandan y ap konsantrasyon segondè (5 mg / ml) pwovoke apoptoz.Cistanche CDPpwovoke apoptoz nan selil Jurkat sitou lè yo afekte ak chanje selil yo.

Ekspresyon reseptè ki gen rapò ak apoptoz CD71 ak CD45 sou sifas manbràn transmèt siyal nan enteryè selil yo, sa ki lakòz plis fosforilasyon ERK ak defosforilasyon JNK, epi finalman deklanchman caspase-9, ki an vire aktive kaspase{{4} } pou pwovoke apoptoz.