Maladi ren kwonik ogmante microbleeds serebral nan sourit ak moun
Mar 15, 2022
Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Wei Ling Lau1,2 & Ane CF Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H Cribbs3 & Mark Fisher6,7
Resevwa: 25 Out 2018 / Revize: 28 Janvye 2019 / Aksepte: 22 Fevriye 2019 / Pibliye sou Entènèt: 4 Me 2019
# Otè a (yo) 2019
Résumé
Microbleeds nan sèvo yo ogmante nankwonikrenmaladi(CKD) ak prezans yo ogmante risk pou n bès mantal ak konjesyon serebral. Nou egzamine entèraksyon ki genyen ant CKD ak mikwoemoraji nan sèvo (substra neropatolojik nan mikrobleeds) nan modèl kilti sourit ak selil yo epi etidye pwogresyon fado mikrobleed sou seri D nan sèvo imen. Etid sourit: Yo te envestige de modèl CKD: nefrit tubulointerstitial adenine-induit ak nefrektomi chirijikal 5/6. Etid kilti selil yo: bEnd.3 selil endothelial nan sèvo sourit yo te grandi nan konfluans, epi yo te mezire entegrite monokouch apre yo fin ekspoze a 5-15 pousan serom uremik imen oswa ogmante konsantrasyon ure. Etid imen: Pwogresyon mikwosenyen nan sèvo yo te evalye sou seri MRI soti nan kontwòl, pre-dyaliz CKD, ak pasyan dyaliz. Mikwoemoraji yo te ogmante 2-2.5-pliye nan sourit ki gen CKD endepandan de tansyon ki pi wo nan modèl nefrektomi 5/6 la. Yo te ogmante tach IgG nan bèt CKD, ki konsistan avèk ogmante pèmeyabilite baryè san-sèvo. Enkubasyon nan selil bEnd.3 ak serom uremik oswa ure ki wo pwodui yon gout ki depann de dòz nan rezistans elektrik trans-endothelial. Olè ure pwovoke deranjman sitoskelèt aktin ak diminye ekspresyon claudin-5. Nan sijè imen, prévalence de microbleeds te 50 pousan nan tou de kòwòt CKD konpare ak 10 pousan nan kontwòl laj matche. Plis pasyan nan kòwòt dyaliz la te ogmante microbleeds sou swivi MRI apre 1.5 ane. CKD deranje baryè san-sèvo a epi ogmante mikwoemoraji nan sèvo nan sourit ak mikwosenyen nan imen. Ure ki wo chanje cytoskeleton aktin ak pwoteyin junction sere nan selil andothelial kiltive yo, sijere ke mekanis sa a eksplike (omwen an pati) mikwoemoraji yo ak microbleeds obsève nan syans bèt ak imen.
Mo kle Maladi ren kwonik. Microbleeds. Modèl sourit. Kilti selil andothelial. BrainMRI
pou soulajekwonikrenmaladi aksistanch
Entwodiksyon
Youn nan dekouvèt newoloji konjesyon serebral ki pi enpòtan nan dènye ane yo se aparisyon nankwonikrenmaladigen yon enpak ki ale pi lwen pase faktè risk tradisyonèl tankou tansyon wo ak dyabèt [10, 11]. Etandone gwo prévalence (apeprè 50 pousan) nan microbleeds serebral ak andikap mantal nan pasyan ki gen CKD avanse [2-4, 6, 7], relasyon sa a merite plis etid.
Microbleeds serebral yo se ti fokis emosiderin-fè ki demontre sou imaj sonorite mayetik (MRI), yo kwè reflete mikwoemoraji serebral ki kache [12, 13], ak indicative de risk ogmante pou konjesyon serebral, tou de emorajik ak iskemik [9, 14]. Sekans MRI spesifik (eko gradyan ak imaj pondéré ak sansiblite) demontre zòn fokal sa yo nan pèt siyal nan parenchyma nan sèvo ki mezire mwens pase oswa egal a 10 mm [12, 15]. Microbleeds serebral yo depann de laj, ak prévalence apwoche 20 pousan pa laj 65 [16]. Anplis laj, tansyon wo ak anjyopati amiloyid serebral yo se faktè risk ki pi byen dekri pou devlopman microbleeds [13, 17]. Nan fen etap CKD, mikrosenyen yo prezan nan jiska 50 pousan nan popilasyon an [2-4].
An menm tan, andikap mantal se tou de pi répandus ak pi grav nan nivo ki pi ba yorenfonksyon[18], rive nan yon prévalence de 30-70 pousan nan pasyan dyaliz kwonik [6, 7]. Nan yon analiz transvèsal 338 pasyan emodyaliz ki gen laj 55 ane ak plis ki gen kontwòl laj matche, 34 pousan nan pasyan dyaliz te gen gwo defisyans mantal konpare ak 12 pousan nan kontwòl [6]. Yon lòt 35 pousan nan kòwòt dyaliz la te gen defisyans mantal modere [6].
Plizyè etid nan kowòt ki pa CKD yo te demontre yon asosyasyon fò ant microbleeds serebral ak dekline fonksyon mantal [19-22]. Done epidemyolojik sipòte ko-egzistans fado MRI mikrobleed ak malfonksyònman mantal nan pasyan ki nan fen etap maladi ren (ESRD) [8, 23]. Anplis, yon rapò resan sou 28 pasyan dyaliz kwonik ak seri MRI nan sèvo te montre yon asosyasyon ant nouvo microbleeds ak yon bès nan nòt mini-mantal egzamen eta (MMSE) [4]. Anplis de sa, pasyan ESRD yo gen yon 3- a 4-pliye to ensidans ki pi wo nan kou ischemik ak emorajik konpare ak popilasyon jeneral la [5]. Nan yon gwoup pasyan emodyaliz Japonè ki pa t gen konjesyon serebral nan debaz, prezans mikwosenyen serebral se te yon prediktè endepandan nan emoraji entraserebral pandan yon peryòd swivi 5-ane [9].
Isit la nou rapòte rezilta nan etid sou sourit ak nan pasyan CKD. Nou te jwenn ogmantasyon mikwoemoraji nan sèvo nan sourit CKD epi nou dekri junction andothelial sere ak dezòd aktin cytoskeleton kòm mekanis potansyèl pou fòmasyon mikwoemoraji nan milye CKD. Analiz retrospektiv seri MRI nan sèvo ki soti nan matyè ki pa CKD, pre-dyaliz, ak emodyaliz kwonik konfime ESRD kòm yon faktè risk enpòtan pou pwogresyon fado mikwòb.
Metòd
Eksperyans sourit
Bèt eksperimantal ak gwoup tretman
Yo te envestige de modèl sourit CKD. (1) Modèl nefrit tubulointerstitis Adenine: Sourit Gason C57BL/6J ki soti nan Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) ki gen laj 10– 12 semèn yo te manje yon rejim ki gen 0.2 pousan adenine pandan 18 jou pou pwovoke nefropati entèstitis kwonik, tounen sou manje regilye pou 2 semèn, ak Lè sa a, re-ekspoze ak rejim alimantè adenin pou 1 semèn pou kenbe CKD (Fig. 1a). Sourit kontwòl yo te kenbe sou manje regilye. (2) Modèl nefrektomi 5/6: Sourit gason C57BL/6J ki gen laj 10 semèn te sibi operasyon de etap nan Jackson Laboratories ki te enplike nefrektomi pasyèl gòch ki te swiv pa nefrektomi total dwat 1 semèn pita. Bèt yo te lage nan laboratwa a 1 semèn apre
dezyèm operasyon. Yo te itilize de modèl sa yo pou detèmine efè tansyon wo; tansyon wo se yon mak nan modèl nefrektomi 5/6, tandiske adenine-CKD pa ipètansif [24].
Bèt CKD yo te randomized pa gen okenn lipopolysaccharide (LPS) oswa piki LPS. (Nan etid pilòt yo, nou te detèmine ke yo te bezwen yon dire pi long nan uremi pou detekte yon fado ki pi wo nan mikwoemoraji espontane nan bèt CKD ki pa trete yo; sourit sou rejim adenin pou sèlman 10 jou apre premye 18 jou yo. ekspoze te gen 3.0 ± 0.4 mikwoemoraji pou chak cm2.)
Senk semèn apre premye endiksyon CKD ak nan yon laj ekivalan nan kontwòl, sourit yo te bay piki LPS intraperitoneal (ip) (Salmonella enterica serotip Typhimurium, L{{0}}MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. ) pou pwovoke microbleeds nan sèvo. LPS te administre nan twa dòz, 1 mg / kg nan 0, 6, ak 24 èdtan [25]. Sourit trete LPS yo te bay hydrasyon ak piki saline lar de-twa fwa pa jou pandan 3 jou apre tretman LPS. Tansyon (BP) te mezire 2 jou anvan piki LPS atravè plethysmography ke-manchèt (CODA-S2 milti-chanèl, Kent Scientific). Tout eksperyans yo te apwouve pa University of California, Irvine Institutional Animal Care, and Use Committee.
Rekòlte Tisi ak Chimi San
Sourit yo te elimine 1 semèn apre piki LPS oswa nan yon laj ekivalan nan bèt ki pa trete pa exsanguination lè l sèvi avèk ponksyon kadyak anba anestezi izoflurane respire. Yo te itilize yon 26-zegwi kalib kòm yon kanul epi yo te antre nan vantrikul gòch la, epi yo te aplike solisyon PBS ki frèt ak glas nan yon vitès koule 7-8 ml/min. Apre
perfusion pou 5 min, emisfè nan sèvo gòch te menen-jele pou Western blot. Emisfè nan sèvo dwat ak tou de ren yo te fiks lannwit lan nan 4 pousan paraformaldehyde ak Lè sa a, estoke nan PBS frèt anvan seksyon. Serom te aliquoted pou san chimiques. Yo te mezire nitwojèn ure nan san (BUN) lè l sèvi avèk twous kolorimetri ki soti nan BioAssay Systems (Hayward, CA). Yo te mezire kreyatinin serik lè l sèvi avèk elektwoforèz kapilè nan O'Brien Kidney Research Core Center (UT Southwestern, Dallas, TX).
Deteksyon Mikwoemoraji
Sèvo yo te monte nan 1.5 pousan agaroz epi seksyone ak yon vibratome pou jenere seksyon koronèl (40 μm). Chak 5yèm seksyon te kolekte pou tach ble Prussian pou detekte mikwoemoraji [26]. Pwisyen ble tach te fèt lè l sèvi avèk frèch prepare 5 pousan potasyòm hexacyanoferrate-tri idrat ak 10 pousan asid idroklorik. Ven minit pita, seksyon yo te rense nan dlo ak counterstained ak nikleyè vit wouj, dezidrate, ak coverslipped. Mikwoemoraji yo te idantifye nan agrandisman × 20 kòm depo koulè wouj violèt-ble konte pa twa piki yo te bay nan 0,6 ak 24h. Yo te bay idratasyon saline anba lar pou 3 jou apre piki LPS. Yo te mezire tansyon ke (BP) anvan piki LPS. Sourit yo te sakrifye 1 semèn apre piki LPS. b Reprezantan H & E tache seksyon ren demontre adenine-induit blesi tubulointerstitial CKD sourit (panèl dwat) konpare ak ren nòmal soti nan CTL bèt (panèl gòch), × 20 agrandisman. Ba echèl=100 μm
obsèvatè endepandan, ak Lè sa a, yo te kalkile mwayèn nan. Imaj nan seksyon yo obsève tache pozitivman yo te kaptire lè l sèvi avèk yon fotomikwoskòp (Nikon Eclipse, Japon) pou twa bèt pou chak gwoup yo kalkile zòn nan mikwoemoraji. Tout imaj glisad yo te tcheke epi yo te itilize lojisyèl ImageJ gratis (vèsyon 10.2) ki soti nan Enstiti Nasyonal Sante (www.imagej.nih.gov/ij/) pou
kalkile sipèfisi total nan sèvo. Kantite mikwoemoraji yo te nòmalize nan zòn sifas nan sèvo total pou chak bèt.
Western Blotting
Emisfè nan sèvo pou analiz pwoteyin yo te jele nan moman koleksyon tisi yo epi yo te omojeneize nan reyaktif ekstraksyon tisi frèt I (Thermo Fisher Scientific) ki te konplete ak bwason inibitè proteaz (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Konsantrasyon pwoteyin yo te mezire ak yon twous tès pwoteyin BCA (Thermo Fisher Scientific). Elektwoforèz jèl SDS-PAGE te fè ak 100 ug pwoteyin pou chak echantiyon. Pwoteyin yo te transfere sou manbràn PVDF ak Lè sa a, bloke pou
1 h nan 5 pousan lèt ekreme sèk ki pa gen anpil grès prepare nan tanpon TBS-T (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, ak 0.1 pousan Tween-20) epi enkubate ak antikò prensipal ki vize claudin. -5 (dilye 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludin (dilye 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific), ak nòmalize nan kontwòl entèn GAPDH (dilye 1:10,000, Abcam, Cambridge, MA) nan 5 pousan lèt ki pa gen anpil grès TBS-T lannwit lan nan 4 degre. Lè sa a, blots yo te enkube ak respektif anti-lapen oswa anti-sourit segondè antikò yo pou 2 èdtan nan tanperati chanm. Apre lave ak TBS-T, bann yo te detekte lè l sèvi avèk Luminescent Image Analyzer LAS -3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT).
Imunohistochimi
Pou detekte flit baryè san-sèvo (BBB), seksyon yo te enkube ak antikò segondè IgG anti-sourit biotinylate nan 1:100 pou 1 èdtan nan tanperati chanm (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Apre lave ak PBS, seksyon yo te enkube pou 30 minit ak konplèks avidin-biotin-peroksidaz (laboratwa vektè) nan yon dilution 1:200. Yo te devlope tach lè l sèvi avèk 3′,3′- diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories) kòm chromogen. Pousantaj zòn ki tache ak IgG te analize lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ nan sèvo ki pa LPS CTL ak CKD. Yo te chwazi yon papòt pou tach IgG pozitif nan evalye manyèlman yon bèt kontwòl pou tach IgG, epi yo te kenbe papòt sa a egal pou tout bèt enkli [27].
Cistanche deserticola anpeche maladi ren
Eksperyans Kilti Selil
Kilti selil andotelyal nan sèvo ak tretman serom
Selil bEnd.3 sourit imòtalize yo te achte nan men Koleksyon Kilti Kalite Ameriken (ATCC, Manassas, VA). Fenotip selil endothelial te konfime atravè imunostaining pou faktè von Willebrand.
Kilti selil yo te enkube nan mwayen Eagle's Dulbecco ki gen anpil glikoz konplè (DMEM, ATCC 30-2002) ki gen 25 mM glikoz ki te konplete ak 10 pousan serom fetal bovine (FBS) ak 1 pousan penisilin-streptomycin nan yon enkibatè imidite a 37 degre nan yon atmosfè 5 pousan CO2 ak 95 pousan lè. Selil yo te itilize nan pasaj 5 pou tout eksperyans. Selil yo te simen nan 5 × 106 dansite sou 12-byen Polyester Transwell foure (0.4 μm pò, Costar) ak konfluyans te reyalize nan 24-48 èdtan. Lè sa a, yo te chanje mwayen kilti a pou ekspoze selil yo nan diferan konsantrasyon FBS, serom nòmal imen (HNS), oswa serom uremik (CKD) ki soti nan pasyan dyaliz yo. Lekti TEER yo te mezire lè l sèvi avèk EVOM2 volt/Ohm Meter (World Precision Instruments, Sarasota, FL) nan twa kote pou chak pi pou jwenn yon mwayèn. Eksperyans yo te kontinye pandan 21 jou, epi yo te rafrechi mwayen kilti a chak 3-4 jou. NHS ak serom uremik te soti nan echantiyon ki te deja bankye yo te jwenn apre apwobasyon IRB ak konsantman enfòme.
Eksperyans Kilti Selil Ure
Pou egzamine efè ure (toksin ki pi abondan kenbe nan CKD), selil bEnd.3 yo te enkube nan DMEM ki wo glikoz ak 10 pousan FBS pou kont li oswa nan mwayen ki konplete ak 42 oswa 72 mg/dL (70 oswa 120 μm) ure ( Sigma- Aldrich). Konsantrasyon ure sa yo apwoksimatif valè pre-ak apre-emodyaliz jeneralman yo jwenn nan pasyan ESRD, epi yo konsidere yo dwe klinikman enpòtan [28]. Nan konklizyon yon peryòd enkubasyon 24-h, yo te mezire TEER a epi yo te rekòlte ak trete selil yo pou analiz Western blot. Pou vizyalize sitoskelèt aktin an, selil bEnd.3 yo te grandi sou kouvèti vè ak ekspoze a konsantrasyon ure ki anwo yo pou 24 èdtan, yo te fikse pou 10 min nan 4 pousan formalin/PBS frèt, epi yo te trete pou tach imunofluoresan lè l sèvi avèk actistain 488 fluorescent. phalloidin ak tach nikleyè DAPI (katalòg # PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Triplicate glisad yo te fè pou chak gwoup, ak twa ankadreman yo te imaj pou chak glisad sou lojisyèl ImageJ pou kalkile zòn nan tach phalloidin nòmalize nan zòn nan DAPI.
Western Blotting
Selil bEnd.3 ki soti nan eksperyans yo ure yo te pellet, Lè sa a, lysed nan Tissue Extraction Reagent I (Thermo Fisher Scientific) complétée ak bwason inibitè proteaz (Roche Applied Science). Konsantrasyon pwoteyin yo te mezire ak yon twous tès pwoteyin BCA, epi Western blotting te fè jan sa dekri pi wo a ak claudin -5 (dilye 1:500) ak occludin (dilye 1:500) nòmalize nan kontwòl entèn GAPDH (dilye 1:20). ,000). Western blots yo te repete omwen twa fwa pou chak echantiyon.
Etid Imèn
Revizyon Tablo MRI nan sèvo retrospektiv
Dosye medikal elektwonik ant 1ye janvye 2008, ak 31 desanm 2014, nan University of California-Irvine Medical Center yo te fè tès depistaj lè l sèvi avèk sistèm Honest Broker ak UCReX (University of California Research Exchange) apre apwobasyon IRB. CKD anvan dyaliz (n =8) ak pasyan kwonik emodyaliz (n =9) ki te gen omwen de analiz MRI nan sèvo nan moman separe yo te idantifye (nan 10 pasyan emodyaliz te idantifye okòmansman, 1 te retire nan analiz final la akòz imaj ki manke nan sistèm radyoloji PACS la). Kontwòl ak fonksyon ren nòmal (n=10) te manyèlman matche ak pasyan CKD emodyaliz yo pa sèks ak laj ± 5 ane.
Revizyon MRI pou Microbleeds serebral
Yon neuroradiologist (DF) te konte mikrobleeds epi analize pou pwogresyon sou tan. MRI nan sèvo ak imaj T2*-weighted ak sansiblite-weighted (SWI) ak FLAIR (likid-attenuated inversion recovery) imaj yo te fèt sou eskanè 1.5T ak 3T MRI. Kouch epesè pou sekans SWI te fèt nan 2 mm, ak yon entèval interlayer nan 0. Mikrosenyen yo te konte baze sou 2-mm SWI axial. FLAIR te per-
fòme pou detekte blesi matyè blan nan 3 mm epesè tranch, tou ak yon entèval interlayer 0.
Analiz estatistik
Pa te gen okenn done ki abitye sou tès depistaj ak tès Grubbs '(metòd devye elèv ekstrèm, http://graphpad.com/quick calls/grubbs1/). Diferans ki genyen ant gwoup nan sourit ak nan moun yo te konpare pa tès chi-kare (egzak Fisher a) pou varyab kategorik ak t-tès ak ANOVA pou varyab kontinyèl. Done kontinyèl yo rapòte kòm mwayen ± SEM. Pou done sourit, nou te fè tou de yon Kruskal-Wallis ki pa parametrik ak yon ANOVA yon sèl-fason ak tès Tukey HSD. De-fason ANOVA (CKD-wi/non ak LPS-wi/non) te itilize pou teste entèraksyon CKD. Yo te konsidere diferans ki genyen ant gwoup yo enpòtan si P < 0.05.="" figi="" yo="" te="" pwodwi="" lè="" l="" sèvi="" avèk="" lojisyèl="" graphpad="" prism="" 4="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">
Rezilta yo
Siviv ak LPS Tretman
Sourit CKD ki te trete ak LPS te gen yon pousantaj siviv 80 pousan. Sèlman sourit ki te siviv jiska 1 semèn apre tretman LPS yo te
enkli nan analiz final yo. Tout sourit nan lòt gwoup yo te siviv jouk nan fen eksperyans lan.
CKD Siyifikativman Ogmante Mikwoemoraji nan sèvo
Fado Apre Tretman LPS
Bèt ki gen CKD adenin-induit ak 5/6 nephrectomy te montre siyifikativman elve nitwojèn san urey (BUN) ak valè kreyatinin serik konpare ak bèt CTL (Tablo 1). Tail BP te siyifikativman pi wo nan bèt nefrektomi-CKD konpare ak bèt CTL ak adenine-CKD (Table1); sepandan, konte microbleed nan de gwoup CKD yo te menm jan an. H & E tach konfime adenine-induit blesi tubulointerstitial nan ren yo soti nan sourit CKD (Fig. 1b).
Fado mwayèn nan mikwoemoraji nan sèvo a te 2.0 ± 0.5 pou chak cm2 nan sourit ki pa LPS CTL e li te ogmante 2-2.5-pliye nan bèt ki pa LPS CKD (adenine- CKD sourit 4.5 ± 0.9 pou chak cm2;
nephrectomy-CKD sourit 4.2 ± 1.1 pou chak cm2) (Tablo 1; Fig. 2a). Pou gwoup ki pa LPS yo, yon ogmantasyon nan microhemorrhages te enpòtan pou adenine-CKD konpare ak CTL men se pa pou nefrektomi-CKD. Tretman LPS ogmante fòmasyon microhemorrhage nan menm degre nan bèt CTL ak CKD pa
