UPLC-Q-Orbitrap HRMS konbine avèk molekilè ancrage pou envestige baz materyèl nan gou anmè ak relasyon gou-efè nan Cistanchia desertica ⅱ
Dec 18, 2024
2 metòd ak rezilta yo
2.1 Idantifikasyon nan sibstans ki sou deserticola Cistenche
2.1.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS Deteksyon Kondisyon Kromatografik Kondisyon:
Phenomenex kinetex c18 kolòn (2.1 mm × 1 0 0 mm, 2.6 μm); Faz mobil A (faz akeuz, ki gen 0.1% asid acetic), B (izopropanol-acetonitrile 1: 1), gradyan elution (0-1 min, 1% b; {{13} min, 1% {{15} 99% -1% b; to koule 0.2 ml · min -1; Tanperati kolòn 30 degre; Piki volim 2 μl.
Kondisyon spectrometry mas: OrbitRap Exploris 120 mas spèktromètr te itilize yo kolekte done primè ak segondè spèktrometri mas anba kontwòl la nan lojisyèl (Thermo syantifik XCalibur lojisyèl, vèsyon: 4.4). Vòltaj nan espre te 3.8 kV (pozitif) oswa -3. Mòd la analysis te plen eskanè/done-depandan eskanè segondè (plen MS/DD-MS2), rezolisyon prensipal la te 60 000, rezolisyon an segondè te 15 000, seri a Ion optik te m/z100 ~ 1 500, ak gradyan nan enèji kolizyon, 30, 30, 40.
Bon jan kalite materyèl cistanche ak pi woEchinacoside, Verbascoside, Tubuloside A, Isoverbaceous Glycoside
2.1.2 Preparasyon nan solisyon referans
Avèk presizyon peze kantite lajan ki apwopriye nanEchinacoside, Verbascoside, Tubuloside A, Isoverbaceous Glycoside, Gentianoside, ak sibstans ki sou referans geniposide, ajoute 50% methanol fè yon solisyon referans melanje ak yon konsantrasyon mas nan 500 ng · ml -1, souke byen, ak jwenn.
2.1.3 Preparasyon nan solisyon tès la
Peze 1. 0 g nan echantiyon poud (M1) kolekte nan sezon prentan ak 1. 0 g nan poud echantiyon (M5) kolekte nan otòn, ajoute solisyon ekstrè (methanol-dlo 4: 1), tranpe nèt, ultrasonicate nan 250 W ak 35 kHz pou 1 h nan tanperati chanm, Lè sa a, Lè sa a, Lè sa a, Lè sa a) r · min -1 pou 10 min, ak filtre pou jwenn alkòl ekstrè nan Cistanche Deserticola.
2.1.4 Idantifikasyon sibstans
Lè yo konpare done prensipal yo ak segondè spèktrometri enfòmasyon done nan chak echantiyon cistenche deserticola, ak konbine ak literati ki enpòtan ak materyèl referans, li te idantifye ke echantiyon diferan nan dezè Cistanche gen 69 konpozan chimik an komen, gade nan tablo 2, ak dyagram nan koule total nan cistancheolaola yo montre nan figi 2.
Tablo 2 Constituents nan Cistanche Deserticola Ekstrè idantifye ki baze sou UPLC-Q-Orbitrap HRMS
| Non. | Konpoze | Fòmil molekilè | Valè mezire (m/z) | Erè (× 10⁻⁶) | Mòd ion | Iyon fragman | Lèt |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.02 | Isomenthone | C₁₀H₁₈O | 223.06 | -8.7 | [M + H]⁺ | 223.06, 207.02, 137.02 | Monoterpenoids |
| 0.57 | Urakil | C₄H₄N₂O₂ | 157.04 | 1.8 | [M + H]⁺ | 157.03, 59.02, 49.01 | Lòt |
| 0.67 | Glikozamin | C₆h₁₃no₅ | 195.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 75.01, 195.05, 59.01 | Idrat kabòn |
| 0.68 | Galaktosamin | C₆h₁₃no₅ | 181.07 | 1.1 | [M + H]⁺ | 181.07, 71.01, 89.02 | Idrat kabòn |
| 0.81 | Asid caprylic | C₈H₁₆O₂ | 144.11 | 1.0 | [M + H]⁺ | 104.11, 103.08, 87.03 | Lòt |
| 0.83 | L - asid aspartic | C₄h₇no₄ | 132.03 | 0.7 | [M + H]⁺ | 132.03, 115.00, 71.01 | Asid amine |
| 0.97 | Ethyl acetate | C₄H₈O₂ | 198.19 | 1.4 | [M + H]⁺ | 197.02, 54.02, 153.02 | Lòt |
| 0.98 | Asid malik | C₄H₆O₅ | 155.00 | 0.0 | [M + H]⁺ | 111.00, 49.00, 68.99 | Asid òganik |
| 0.99 | D - galaktoz | C₆H₁₂O₆ | 180.16 | 1.1 | [M + H]⁺ | 179.06, 89.02, 59.01 | Idrat kabòn |
| 1.00 | L - asid glutamik | C₅h₉no₄ | 188.09 | -0.4 | [M + H]⁺ | 118.09, 119.09, 72.08 | Asid amine |
| 1.01 | L - isoleucine | C₆h₁₃no₂ | 132.10 | -0.9 | [M + H]⁺ | 132.10, 86.03, 115.07 | Asid amine |
| 1.05 | Gank | C₂h₅no₂ | 182.08 | -0.9 | [M + H]⁺ | 182.08, 95.04, 29.03 | Asid amine |
| 1.48 | Pipi | C₉H₁₂N₂O₆ | 243.06 | 0.3 | [M + H]⁺ | 243.06, 103.01, 102.10 | Nucleosides |
| 1.93 | Metil d - iodid | C₂H₅I | 131.03 | 0.0 | [M + H]⁺ | 131.03, 59.00, 41.01 | Lòt |
| 2.29 | Naringin | C₂₇H₃₂O₁₄ | 345.12 | 3.2 | [M + H]⁺ | 345.12, 327.11, 147.05 | Flavonoid |
| 3.29 | Asid protocatechuic | C₇H₆O₄ | 153.02 | 1.1 | [M + H]⁺ | 153.02, 109.02, 41.00 | Asid fenol |
| 3.46 | Triacontanol | C₃₀H₆₂O | 445.10 | 2.7 | [M + H]⁺ | 445.10, 271.08, 101.00 | Alkanol |
| 3.47 | Kaempferol - 3 - o - glukozid | C₂₁H₂₀O₁₁ | 373.11 | 2.3 | [M + H]⁺ | 123.01, 149.06, 167.07 | Flavonoid |
| 3.48 | Quercetin | C₁₅H₁₀O₇ | 109.03 | 0.6 | [M + H]⁺ | 109.03, 79.05, 77.03 | Flavonoid |
| 3.66 | Asid klorojenik | C₁₆H₁₈O₉ | 375.09 | -0.7 | [M + H]⁺ | 375.11, 359.07, 309.03 | Asid fenol |
| 3.70 | Asid kannèl | C₉H₈O₂ | 347.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 347.13, 181.09, 113.07 | Asid fenol |
| 3.74 | 8 - epigallocatechin - 3 - Gallate | C₂₂H₁₈O₁₁ | 315.37 | 13.6 | [M + H]⁺ | 315.37, 136.05, 103.04 | Flavonoid |
| 3.76 | Limonene | C₁₀H₁₆ | 163.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 163.04, 93.07, 62.03 | Monoterpenoids |
| 3.77 | Hesperidin | C₂₈H₃₄O₁₅ | 299.11 | -1.9 | [M + H]⁺ | 299.11, 181.08, 101.04 | Flavonoid |
| 3.91 | Vanilin | C₈H₈O₃ | 307.81 | 3.8 | [M + H]⁺ | 307.83, 173.03, 149.02 | Asid fenol |
| 4.11 | Isoquercitrin | C₂₁H₂₀O₁₂ | 419.13 | 4.1 | [M + H]⁺ | 419.13, 149.02, 101.00 | Flavonoid |
| 4.21 | Izopropil methylphenidate | C₁₄h₂₁no₂ | 221.08 | -0.8 | [M + H]⁺ | 221.08, 205.09, 104.00 | Lòt |
| 4.22 | Asid syringic | C₉H₁₀O₅ | 785.25 | 1.4 | [M + H]⁺ | 785.25, 663.21, 661.19 | Asid fenol |
| 4.30 | Eugenol | C₁₀H₁₂O₂ | 179.04 | 0.2 | [M + H]⁺ | 179.04, 153.03, 113.03 | Asid fenol |
| 4.40 | Kafein | C₈H₁₀N₄O₂ | 769.26 | 1.4 | [M + H]⁺ | 769.26, 629.24, 622.14 | Alkaloid |
| 4.43 | Krizin | C₁₅H₁₀O₄ | 442.05 | 1.1 | [M + H]⁺ | 442.05, 173.03, 113.03 | Flavonoid |
2.2 Depistaj Molekilè ancrage nan sibstans ki sou anmè kou fièl nan Cistanche Deserticola
2.2.1 Konstriksyon baz done ligand
Dapre eleman chimik yo nan Cistanche Deserticola idantifye nan 2.1.4, estrikti SDF yo te telechaje nan baz done a PubChem etabli yon bibliyotèk ligand ti molekil konpoze. Tout molekil ti ligand yo te struktural optimisé lè l sèvi avèk pwogram nan mekanik molekilè minimize.
2.2.2 Seleksyon reseptè anmè kou fièl
Reseptè a gou anmè (TAS2R) se yon manm nan fanmi an GPCRS ak medye pwosesis la pèsepsyon gou anmè nan selil boujon gou sou lang lan. Gen 25 subtip reseptè. Pami yo, tas2r1, tas2r7, tas2r8, ak tas2r14 ka aktive pa yon varyete de sibstans ki sou anmè ak fè pati nan gwo-spectre reseptè yo pèsepsyon anmè [14-15]. Se poutèt sa, etid sa a te chwazi TAS2R1, TAS2R7, TAS2R8, ak TAS2R14 pwoteyin reseptè gou anmè pou ancrage ak konpozan chimik yo nan dezè Cistanche, ak estrikti nan kristal pwoteyin anmè te jwenn nan baz done a Alphafold.
2.2.3 Molekilè ancrage
Eleman chimik la nan dezè Cistanche idantifye pa UPLC-Q-Orbitrap HRMS te itilize kòm yon ligand, ak subtip yo reseptè gou anmè Tas2R1, Tas2R7, Tas2R8, ak Tas2R14 yo te itilize kòm reseptè pwoteyin. Docking molekilè a te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl an Vina Autodock. Pi piti a nòt la ancrage, pi bon an enèji nan obligatwa. Pwoteyin reseptè a te pre-trete lè l sèvi avèk Auto Dock Zouti (ADT), ki gen ladan dezidratasyon ak idrogenasyon. Lig la te tou trete lè l sèvi avèk ADT, ki gen ladan idrogenasyon, kalkil chaj, deteksyon, ak seleksyon nan lyezon rotatable. Te sit la aktif nan reseptè a detèmine lè l sèvi avèk ADT, epi yo te bwat la ancrage mete asire ke gwosè a bwat te ase ki gen sit la aktif. Apre yo fin ancrage a te konplete, yo te lojisyèl an vizyalizasyon Pymol itilize yo wè ak analize rezilta yo ancrage. Yo nan lòd yo diminye rezilta yo fo pozitif nan ancrage molekilè, etid sa a te itilize nòt la ancrage nan kinin ligand pozitif ligand kòm kritè a tès depistaj ak eleman chimik chwazi ki mare byen nan omwen de reseptè anmè kou fièl kòm sibstans ki sou yo anmè nan Cistanche Deserticola. As a result, a total of 20 chemical components were potential bitter substances, including 6 phenylethanoid glycosides, 5 flavonoids, 3 phenolic acids, 2 cyclopentadiene ether terpenes, 2 alkaloids and 2 other components, indicating that phenylethanoid glycosides and flavonoids are the main bitter substances in Cistanche deserticola. Nòt yo ancrage yo montre nan tablo 3.
Tablo 3 nòt molekilè ancrage nan sibstans ki sou anmè prezante nan Cistenche Deserticola Ekstrè ak reseptè gou anmè kcal · mol -1
| Non. | Sibstans anmè | Tas2r1 | Tas2r7 | Tas2r8 | Tas2r14 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Prunasin | -7.6 | -6.6 | -7.8 | -7.1 |
| 2 | Trifolirhizin | -8.8 | -7 | -8.7 | -8.5 |
| 3 | Asid benzoik | -7.9 | -6.9 | -8.2 | -7.1 |
| 4 | Vitexin | -7.6 | -6.8 | -8.5 | -7.1 |
| 5 | Trifolin | -8.4 | -7.5 | -8.2 | -7.7 |
| 6 | Isoquercitrin | -9.2 | -7.5 | -8.1 | -7.8 |
| 7 | Isomenthone | -7.3 | -6.7 | -7.4 | -6.9 |
| 8 | Curcumin | -9.2 | -8.1 | -8.3 | -7.4 |
| 9 | Asid dehydroacetic | -6.6 | -6 | -7.8 | -7.9 |
| 10 | Jinsenoside | -7.3 | -7.9 | -8.8 | -8.3 |
| 11 | Piperine | -8.8 | -7.9 | -7.9 | -7.9 |
| 12 | Epicatechin | -9.8 | -6.9 | -9.1 | -8.7 |
| 13 | Isoquercitrin (ankò) | -8.1 | -8 | -8.2 | -8 |
| 14 | Rein | -8.7 | -7 | -8.9 | -8.5 |
| 15 | Asid izosalisilik | -8.7 | -6.5 | -8.3 | -9.3 |
| 16 | Pinocembrin | -9.1 | -7.6 | -8.1 | -8.6 |
| 17 | Eriocitrin | -7.9 | -7.6 | -8.2 | -8.4 |
| 18 | Genistin | -8.1 | -8.2 | -9.1 | -8.2 |
| 19 | Kaempferol | -8.4 | -8.1 | -9.1 | -8.4 |
| 20 | Isoquercitrin (twazyèm mansyone) | -8.2 | -8.4 | -7.9 | -8.7 |
2.3 Evalyasyon lang elektwonik nan anmè a nan Cistanche Deserticola
2.3.1 akizisyon siyal
Gade nan metòd literati a epi optimize li [16]. Paramèt yo se: Koleksyon Tanperati 25 degre, Done Koleksyon Tan 120 s, Peryòd Koleksyon 1 s, vibran vitès 1 R · S -1, lè l sèvi avèk dlo ultrapure kòm likid la netwayaj, anvan chak mezi echantiyon netwaye Capteur a pou 10 segonn.
2.3.2 Detèminasyon Egzanp
Peze 1. 0 g nan poud echantiyon cistanche dezè a respektivman, peze li avèk presizyon, ajoute 80 ml dlo, rflu ak ekstrè pou 1 h, kite fre, santrifijez, filtre, pran 40 ml nan filtraj, ajoute dlo distile fè volim nan 100 ml. Mete echantiyon an prepare nan yon vaz a bèk 100 mL nan enstriman an ak fè mezi a. Repete mezi a twa fwa pou chak echantiyon.
2.3.3 Rezilta evalyasyon anmè lè l sèvi avèk lang elektwonik
Apre enspeksyon metodolojik, relatif devyasyon estanda a (RSD) nan presizyon, repetabilite a, ak {{0}} H eksperyans estabilite yo te 1.7%, 3.6%, ak 1.4%respektivman, tout mwens pase 5.0%, ki endike ke metòd sa a se posib. Valè yo anmè quantitative nan diferan echantiyon dezè Cistancola varye soti nan 8.856 27.32, jan yo montre nan tablo 4, ak diferans enpòtan.
3 Diskisyon
Nan etid sa a, yo te idantifye 69 konpozan chimik nan Cistenche Deserticola lè l sèvi avèk UPLC-Q-Orbitrap HRMS teknoloji, ak 20 sibstans ki sou anmè ki ankouraje reseptè gou anmè nan cistenche dezè yo te tès depistaj soti nan konbine 2 molekilè teknoloji, ki gen 3 fenilin, yo te fè fenilolin yo, ki gen 2 alkolin, ki gen 5 an, yo te fè fenilolin yo, yo te fè fas a 2 alkolin, ki gen 5 an, yo te fè fenilolin, ki gen 6 alkolin, ki gen 6 an, yo te fè yon tiyo, ki gen 6 alkolin, yo te fè fenilolin yo. ak 2 lòt konpozan, ki gen ladan echinacoside, verbascoside, tubuloside A, isoverboscoside, geniposide, elatriye; 9 lo nan echantiyon fre dezè Cistanticola soti nan orijin nan menm nan diferan mwa yo te ranmase ak divize an diferan mwa ak diferan pati. Te metòd la lang elektwonik itilize detèmine valè a quantitative nan anmè a nan echantiyon yo, ak HPLC te itilize detèmine 6 potansyèl konpozan yo anmè famasi (echinacoside, verbascoside, tubuloside) nan echantiyon yo. Yon, iso-vèbascoside, jinshicanoside, geniposide) kontni, ak UV-vizib spektrofotometri te itilize detèmine glikozid yo fenilethanoid total, polisakarid total, alkaloid total, flavonoid total, ak total kontni asid fenol nan Samples yo. Sou baz sa a, konbine avèk analiz chemometrik, analiz korelasyon Pearson, analiz korelasyon gri, OPLS-DA, elatriye yo te itilize pou jwenn eleman anmè nan Cistanche Deserticola. Rezilta yo analiz korelasyon te montre ke kontni an nan glikozid total fenilethanoid ak flavonoid total nan Cistenche dezè te pozitivman Koehle ak valè a repons anmè, ak polisakarid yo total de cistanche deserticola yo te negatif korelasyon ak valè a repons anmè kou fièl. Pami yo, kontni an nan eleman fenylethanoid glikozid echinacoside, verbascoside, ak jinshicanoside te siyifikativman pozitivman Koehle ak valè a repons anmè, ki te konsistan avèk rezilta yo ancrage molekilè, verifye presizyon nan rezilta yo molekilè. De metòd yo te sipòte youn ak lòt epi yo te bay yon referans pou koreksyon ki vin apre a ak koreksyon gou nan Cistenche Deserticola.
Atravè prediksyon rezo famasi, 245 objektif sibstans anmè te jwenn, ak objektif yo kle yo te EGFR, PIK3CB, PTK2, PIK3CD, PIK3R1, PTPN11, IK3CA, SRC, JAK2, PDGFRB, elatriye; Chemen an KEGG ak ale fonksyon anrichisman rezilta nan objektif yo sibstans ki anmè te montre ke rezistans ensilin, wòl nan PI3K-Akt chemen siyal nan konplikasyon dyabetik, ak AGR-Rage chemen siyal nan konplikasyon dyabetik yo te chemen yo kle nan sib yo sibstans ki sou anmè nan Cistanche deserticola. Yo te jwenn yon total 267 fonksyon GO pou objektif sibstans anmè yo. Ki gen ladan 123 pwosesis byolojik, 75 fonksyon molekilè ak 69 konpozan selil; by performing Wayne analysis on the bitter substance targets and the disease targets of the bitter effect of Cistanche deserticola, the results showed that 54.69%, 65.30%, 48.16%, 40.40%, 20.40% and 19.59% of the bitter substance targets may have bitter effects of anti-diabetic nephropathy, neuroprotection, immunomodulation, anti-oxidation, Anti-aje ak anti-osteyopowoz. Sa montre ke sibstans ki sou anmè nan Cistanche Deserticola gen yon baz materyèl sèten pou efè anmè.
Nan etid sa a, yo te ekstrè nan Cistanche deserticola itilize kòm objè rechèch la, ak sibstans ki sou yo anmè kou fièl nan Cistanche deserticola yo te fè tès depistaj soti nan UPLC-Q-Orbitrap RMS ak ancrage molekilè; HPLC te itilize pou detèmine kontni prensipal konpozan medsin yo, epi yo te itilize spektrofotometri UV-vizib pou detèmine kontni chak gwo kategori sibstans anmè. Te lang elektwonik la itilize evalye degre nan anmè, ak eleman yo anmè te verifye pa chemometrics. Metòd modèn rechèch teknik yo te konplètman itilize yo eksplore enfòmasyon an gou nan Cistanche Deserticola ak revele baz materyèl anmè li yo, ki pral bay yon referans pou debite yo ki vin apre ak koreksyon gou nan Cistanche Deserticola. Atravè etid la nan famasi rezo a, mekanis nan aksyon nan sibstans ki sou anmè nan Cistanche Deserticola ak relasyon li yo ak sib la nan efikasite anmè kou fièl yo te preliminè eksplore, ki pral bay lide ak referans pou etid la nan lavni nan "gou-efè" relasyon ki genyen nan senk gou yo nan medikaman Chinwa. Sepandan, gen toujou kèk enpèfeksyon: eksperyans sa a sèlman chwazi plant ki gen bon kalite nan sezon rekòt tradisyonèl la ki mezire kontni an sibstans anmè kou fièl ak anmè nan diferan pati. Gen yon sèten degre nan gwosè echantiyon ase, ak rezilta yo nan diferans ki genyen nan anmè nan diferan pati manke sèten fyab. Li te planifye pou itilize echantiyon gwo echèl pou verifikasyon ak fè rechèch pi sistematik nan lavni; Li se jeneralman kwè ke eleman alkaloid yo anmè, men analiz la korelasyon nan eksperyans sa a te montre ke alkaloid ak anmè yo negatif Koehle, ki ka paske eleman nan alkaloid nan Cistanche Deserticola se sitou betaine, ak molekilè déchires montre ke li mare mal nan reseptè anmè. Anplis de sa, rezilta yo anmè tès depistaj pa ancrage molekilè mank espesifik anmè evalyasyon quantitative done verifikasyon eksperimantal, ak rezilta yo tès depistaj ka gen fo positifs, ak plis rechèch ak eksplorasyon nan eksperyans lan ki nesesè.
