Klonaj jèn, idantifikasyon fonksyonèl, analiz estriktirèl ak ekspresyon nan sikwoz sintaz ki soti nan Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analiz ekspresyon CtSus nan diferan pati nan Cistanche tubulosa ak nan sistèm kilti selil anba estrès sechrès.

4.1 Analiz ekspresyon CtSus nan diferan pati nan Cistanche tubulosa

Eksperyans transfòmasyon selil antye nan vitro ak eksperyans reyaksyon anzimatik katalitik konfime ke pwoteyin ki kode pa jèn CtSus la gen kapasite pou katalize sentèz UDP-glikoz. Yo nan lòd yo eksplore plis korelasyon ki genyen ant jèn sa a ak byosentèz la nan konpoze glikozid nan Cistanche tubulosa, nivo ekspresyon jèn sa a nan diferan pati nanCistanche tubulosate analize.

GWO KALITE CISTANCHE MATERYAL BRITÈ POU VANN

Sèvis Sipò Wecistanche-Kontakte nou jwenn enfòmasyon sou rabè:

Imèl:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Echinacosidese konpoze glikozid ki pi reprezantan nan Cistanche tubulosa, ak kontni li yo ka rive jwenn plis pase 30% pwa sèk nan plant Cistanche tubulosa [23]. Gwoup rechèch la te deja mezire kontni an nan echinacoside nan diferan pati nan plant Cistanche tubulosa, ak pèfòmans espesifik la te: kontni an nanechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>pati ayeryen; pami yo, kontni an nan echinacoside nan haustorium te pi wo a. Yo te fè PCR quantitative fluoresans an tan reyèl lè l sèvi avèk cDNA ki soti nan diferan pati nan Cistanche tubulosa kòm modèl, ak rezilta yo te analize pa 2 a.–ΔΔCT metòd, ak analiz diferansye te fèt. Rezilta yo montre nan Figi 4A. Nivo ekspresyon jèn CtSus nan haustorium la te pi wo a, 1.5 fwa sa ki nan pati anlè tè a, ak nivo ekspresyon nan pati anba tè a te siyifikativman pi wo pase sa ki nan pati anlè tè a, ki konsistan avèk modèl akimilasyon glikozid phenylethanol. reprezante pa echinacoside nan diferan pati nanCistanche tubulosa.

Figi 4 Nivo ekspresyon relatif CtSus nan diferan pati nan C. tubulosa ak nan selil sispansyon trete pa PEG6000. A: Nivo ekspresyon relatif CtSus nan diferan pati nan C. tubulosa; B: Nivo ekspresyon relatif CtSus nan selil sispansyon C. tubulosa trete pa PEG6000 nan diferan pwen tan n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0.05,***P ＜ 0.001

GWO-KALITE CISTANCHE MATERYÈL BRITÈ

4.2 Analiz ekspresyon CtSus nan selil sispansyon Cistanche deserticola nan kondisyon estrès sechrès

Rechèch preliminè sou pwojè a te montre saestrès sechrès pwovoke pa PEG6000kapabogmante siyifikativmanlaakimilasyon nan glikozid phenylethanolnan selil sispansyon Cistanche. Soti nan 3 a 9 jou apre endiksyon, kontni an echinaceaside ogmante anpil. Soti nan 12yèm rive 15yèm jou, lato kwasans echinaceasidekontni ralanti epi li rive nan valè maksimòm nan 15yèm jou a. Lè sa a, kòm tan kilti a ogmante, kontni an echinaceaside ogmante anpil. Kontni fructoside piti piti diminye [24]. Sou baz rechèch sa a, papye sa a te itilize cDNA nan selil sispansyon Cistanche deserticola ki pa trete ak selil sispansyon Cistanche deserticola ki te pwovoke PEG6000- kòm modèl pou fè deteksyon PCR quantitative fluoresans an tan reyèl pou egzamine jèn CtSus nan sispansyon Cistanche deserticola. selil anba kondisyon estrès sechrès. chanjman nan nivo ekspresyon yo. Rezilta yo montre nan Figi 4B. Nan selil sispansyon Cistanche deserticola pwovoke pa PEG6000, ekspresyon CtSus ogmante siyifikativman nan 6yèm jou apre endiksyon, e li te rive nan valè ki pi wo a nan 9yèm jou a, ak Lè sa a, te tonbe nan menm nivo ak kontwòl la. gwoup menm nivo. Rezilta ki pi wo yo montre ke estrès sechrès ka siyifikativman ogmante ekspresyon jèn CtSus nan liy selil sispansyon Cistanche deserticola, ki konsistan avèk modèl akimilasyon echinaceaside anba estrès sechrès. Sepandan, ekspresyon pik nan jèn CtSus parèt pi bonè pase pik kontni echinaceaside, paske donatè glikozil aktif sentèz pa kataliz CtSus se yon précurseur enpòtan ki nesesè pou reyaksyon glikozilasyon milti-etap nan chemen biosentetik ki vin apre nan echinaceaside. , Se poutèt sa li espekile ke apre yo fin sibi estrès sechrès, òganis yo pral preferansyèlman mobilize jèn ki gen rapò ak metabolis prensipal yo reyalize akimilasyon nan donatè aktif, ak Lè sa a, reyalize akimilasyon nan metabolit segondè enpòtan.

GWO-KALITE CISTANCHE MATERYÈL BRITÈ

5 Etid estrikti twa dimansyon nan pwoteyin CtSus ak analiz sit kle aktif yo

Ki baze sou fonksyon an nan CtSus nan katalize pwodiksyon an nan donatè glycosyl UDP-glikoz, baz estriktirèl nan aktivite katalitik CtSus te plis etidye. Zouti sou entènèt SOPMA te itilize pou predi estrikti segondè pwoteyin lan. Rezilta yo te montre ke estrikti segondè nan CtSus genyen 55.28% -helis, 25.47% bobin o aza, 12.80% fil pwolonje, ak 6.46% -tours (Figi 5A), ki endike ke -helis yo se inite segondè estriktirèl ki pi enpòtan nan pwoteyin CtSus, ki te swiv pa bobin o aza, ki tou kont pou yon gwo pwopòsyon nan pwoteyin lan. Seksyon pwolonje ak -vire yo distribye nan tout pwoteyin lan. Dapre etid ki deja egziste, sikwoz synthase anjeneral egziste nan fòm lan nan yon tetramer, ki konsidere kòm fòm aktif li yo. Se poutèt sa, papye sa a plis itilize AlphaFold2 pou predi estrikti nan pwoteyin CtSus ak jwenn estrikti twa dimansyon li yo nan tetramers pwoteyin. Konparezon baz done PDB (Protein Data Bank) te jwenn ke resanblans sekans ant Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 (PDBID 3S28) ak CtSus ka rive nan 77.93%. Yo te konpare estrikti CtSus prevwa a ak estrikti twa dimansyon AtSus1, ak valè devyasyon kare mwayen rasin (RMSD) apre sipèpozisyon pwoteyin te 1.11 Å, ki endike estrikti espasyal de yo trè konsistan (Figi 5B).

Yo te itilize estrikti konplèks pwoteyin-ligand kristal Arabidopsis AtSus1 ak UDP ak fruktoz (PDBID3S29) kòm yon modèl [16] pou analize mòd obligatwa CtSus ak UDP ak fruktoz. Rezilta molekilè yo montre nan Figi 5C. Li ka obsève ke pòch obligatwa substra nan AtSus1 ak CtSus yo trè menm jan an tèm de kalite asid amine, distribisyon espasyal ak konfigirasyon, ak sipèpoze a wo, pwouve ke sekans nan sikwoz synthase trè konsève nan plant yo. Konfòmasyon yo nan de ligand yo, UDP ak fruktoz, nan pòch la obligatwa substra pwoteyin yo montre nan Figi 5D. Konfòmasyon molekilè ki pi avantaje nan UDP ak CtSus gen yon bon sipèpoze ak konfòmasyon UDP nan konplèks kristal AtSus1-UDP, ki pwouve presizyon rezilta molekilè yo. Entèraksyon ant UDP ak résidus kle asid amine nan pòch obligatwa substrate pwoteyin yo montre nan Figi 5E. UDP ak CtSus yo sitou mare ansanm pa lyezon idwojèn ak entèraksyon idrofob. Résidus kle asid amine nan pòch obligatwa substra a gen ladan yo: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678, ak Glu681.

Referans

[1] Chanson ZH, Lei L, Tu PF. Avans nan rechèch nan aktivite famasi nan plant nan CistancheHoffing. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et al. Chimyom konparezon ant kiltive ak sovaj Cistanchetubulosa lè l sèvi avèk ¹H-NMR espektroskopi [J]. Lachin J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, soti nan yon espès ki an danje nan yon gwo mak nan medikaman Chinwa [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Cistanche deserticola polisakarid pwoteje selil PC12 kont blesi OGD/RP-induit [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evolisyon nan plant nukleotid-sik entèkonvèsyon anzim [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Fòmasyon sik nukleotid plant, entèkonvèsyon, ak sovtaj pa resiklaj sik [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Karakterizasyon byochimik UDP-GlcNAc/Glc4-epimerase nan Escherichia coli O86:B7 [J]. Byochimik, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Idantifikasyon UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase ki enplike nan glikozilasyon pwoteyin exosporium nan Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol,2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Transcriptome-lajè idantifikasyon nan sucrose synthase jèn nan Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Sucrose synthase: yon glikosiltransferaz inik pou devlopman pwosesis glikozilasyon biocatalytic [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. The byosenthesis of sucrose [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.[12]Stein O, Granot