Ekstrè Cistanche Deserticola ogmante fòmasyon zo nan osteoblasts--Pati I

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Résumé
Objektif Nou te envestige efè aCistanchedeserticolaMa. (CD) souzofòmasyonpa osteoblast kiltive. Metòd Yo te itilize tès fòmasyon nodil mineralize pou egzamine efè in-vitro CD(Cistanchedeserticola)souzofòmasyon. Fosfataz alkalin (ALP), pwoteyin morfogenetik zo (BMP)-2, ak ekspresyon mRNA osteopontin (OPN) yo te analize pa reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl. Mekanis nan aksyon nan CD(Cistanchedeserticola)ekstrè te envestige lè l sèvi avèk Western blotting. Efè anti-osteyoporotik in-vivo CD(Cistanchedeserticola)ekstrè te evalye nan sourit ovariectomized.
Konklizyon kle yo

CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pa te gen okenn efè sou pwopagasyon, migrasyon, oswa geri blesi nan osteoblast kiltive, men ogmante ALP, BMP-2, ak OPN mRNA ak mineralizasyon zo. Mitogen-aktive pwoteyin kinaz (MAPK) oswa faktè nikleyè (NF) -kB inhibiteurs redwi CD(Cistanchedeserticola)ekstrè-pwovokefòmasyon zoak ekspresyon ALP, BMP-2, ak OPN. Sepandan, CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pa t 'afekte osteoclastogenesis. Anplis de sa, CD(Cistanchedeserticola)ekstrè anpeche pèt nan zo pwovoke pa ovariectomy nan vivo.
Konklizyon

CD(Cistanchedeserticola)ka yon womanfòmasyon zoajan pou tretman osteyopowoz la.

Mo klefòmasyon zo; Cistanchedeserticola; Chinwa zèb; osteoblasts

Cistanche deserticola is good for bone formation

Cistanche deserticolase bon poufòmasyon zo

Entwodiksyon

Zo se yon tisi konplèks ki konpoze de plizyè kalite selil ki sibi yon pwosesis kontinyèl nan renouvèlman ak reparasyon ki rele 'renovasyon zo'. De gwo kalite selil ki responsab pou renovasyon zo yo se osteoclasts, ki resorb zo, ak osteoblasts, ki fòme zo nouvo. Remodelaj zo yo kontwole pa plizyè òmòn sistemik (egzanp òmòn paratiwoyid, 1, 25-dihydroxy vitamin D3, òmòn sèks, ak kalsitonin) ak faktè lokal yo (egzanp oksid nitrique, prostaglandin, faktè kwasans, ak sitokin).[1] Osteyopowoz la rezilta lè resorption ak fòmasyon nan zo yo pa kowòdone epi depase pann zo depase bilding zo.[2] Tretman aktyèl pou maladi osteyopowoz la gen ladan bisfosfonat, kalsitonin, ak estwojèn, ki se inibitè resorption zo ki kenbe mas zo nan anpeche aktivite osteoclast.[3] Sepandan, efè dwòg sa yo nan ogmante oswa rekipere mas zo se relativman ti, sètènman pa plis pase 2 pousan pa ane.[3] Se poutèt sa, gen yon bezwen pou ajan pou konstriksyon zo, tankou teriparatide, ki ankouraje nouvozofòmasyonepi korije chanjman nan mikrochitekti trabekilè ki karakteristik osteyopowoz la etabli.[4,5] Paske nouvozofòmasyonse prensipalman yon fonksyon nan osteoblast la, ajan ki aji nan swa ogmante pwopagasyon nan selil nan liy lan osteoblastic oswa pwovoke diferansyasyon nan osteoblast yo ka amelyore fòmasyon zo.[5,6]
Malgre ke mekanis osteyopowoz la rete klè, yo gen anpil chans ki gen rapò ak disponiblite a diminye oswa efè nan faktè kwasans zo, tankou pwoteyin zo morphogenetic (BMPs).[7] BMP yo, ki gen rapò estriktirèl ak sipèfanmi faktè kwasans transfòmasyon-b, yo te idantifye orijinal pa kapasite yo pou pwovoke ektopik.zo fòmasyonnan rat yo.[8] BMP yo jwe yon wòl enpòtan nanzofòmasyonak diferansyasyon selil zo nan estimile aktivite fosfataz alkalin (ALP) ak sentèz proteoglikan, kolagen an, ak osteopontin (OPN).[9] Yon etid resan te jwenn yon lyen ant maladi osteyopowoz la ak polimorfism espesifik nan jèn BMP-2, ALP, ak OPN, ki sijere yo asosye ak devlopman osteyopowoz la.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; abreje kòm CD)(Cistanchedeserticola)se yon zèb natif natal nan Lachin epi li lajman itilize nan medikaman tradisyonèl kòm yon ajan terapetik akòz sedatif, analgesic, ak pwopriyete imunostimulatory li yo.[11] Etid famasi modèn yo te montre ke CD(Cistanchedeserticola)Ekstrè yo ka ankouraje iminite,[12] elimine radikal gratis[13], epi ogmante aktivite superoksid dismutase.[14] Ajan anti-enflamatwa ak antioksidan gen potansyèl pou trete maladi osteyopowoz la lè yo ogmantezo fòmasyonak/oswa siprime resorption zo.[15,16] Sepandan, efè CD(Cistanchedeserticola)sou fonksyon selil zo poko te detèmine. Isit la, nou rapòte ke CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pa te afekte pwopagasyon, migrasyon, oswa aktivite geri blese osteoblast kiltive yo, men li te ogmante ekspresyon ALP, BMP-2, ak OPN ak mineralizasyon zo yo. Anplis de sa, nou montre ke mitogen-aktive pwoteyin kinaz (MAPK) ak faktè nikleyè (NF)-kB siyal chemen yo ka patisipe nan ogmantasyon CD-medyatè nan ekspresyon jèn ak mineralizasyon zo. Kontrèman, CD la(Cistanchedeserticola)ekstrè pa t 'siprime osteoclastogenesis nan vitro. Miyò, tretman sourit ak CD(Cistanchedeserticola)ekstrè anpeche pèt zo pwovoke pa ovariectomy nan vivo. Done nou yo, Se poutèt sa, sijere ke CD(Cistanchedeserticola)ka itilize pou ankourajezofòmasyonpou tretman osteyopowoz la.

Cistanche deserticola boost the immunity

Cistanche deserticolaranfòse iminite a

Materyèl ak Metòd

Cistanche deserticola ekstrè ak materyèl

CD(Cistanchedeserticola)ekstrè te achte nan men Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Ekstraksyon ak izolasyon CD(Cistanchedeserticola)yo te swiv jan sa dekri deja (sou baz done espèk yo te idantifye konpozisyon chimik la ki gen ladan beta-sitosterol, daucosterol, asid suksinik, triakontanol, acteoside, betaine, ak polisakarid).[17] Antikò poliklonal lapen espesifik pou p-extracellular siyal-reglemante kinases (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminal kinases (JNK), JNK, p-p65, ak p65 te achte nan men Santa Cruz Biotechnology. Santa Cruz, Etazini). Osteocalcin ELISA twous la te achte nan men Biosource Technology (Nivelles, Bèljik). Telopeptides C-tèminal yo nan twous ELISA kolagen tip-I yo te jwenn nan Cross Laps (Herlev, Denmark). Doktè J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA) te bay mutan p38 dominan-negatif la. Doktè M. Karin (University of California, San Diego, USA) te bay mutan JNK dominan-negatif la. Doktè M. Cobb (South-Western Medical Center) te bay mutan ERK2 dominan-negatif la. Tout lòt reyaktif yo te jwenn nan Sigma-Aldrich (St Louis, USA).

Kilti selilè

Liy selil osteoblast murin MC3T3-E1 te achte nan men American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Selil yo te kiltive nan 95 pousan lè, 5 pousan CO2 ak a-MEM ki te complétée ak 20 mm HEPES ak 10 pousan serom ti towo bèf fetal inaktive chalè, 2 mm-glutamin, penisilin (100 U / ml), ak streptomycin (100 mg). /ml).

Mezi fòmasyon nodil mineralize

Yo te evalye fòmasyon nodil mineralize jan sa dekri.[18] An brèf, osteoblast yo te kiltive nan yon mwayen ki gen vitamin C (50 mg / ml) ak b-glycerophosphate (10 mm) pou de semèn, epi yo te chanje mwayen an chak twa jou. Apre enkubasyon ak CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pou 12 jou, selil yo te lave de fwa ak 20 mm Tris-tampon saline ki gen 0.15 m NaCl (pH 7.4), fiks nan glas-frèt 75 pousan (v/v) etanòl pou 30 min, ak lè- seche. Depozisyon kalsyòm yo te detèmine lè l sèvi avèk alizarin wouj-S tach. Yon ti tan, selil etanòl-fiks ak matris yo te tache pou 1 èdtan ak 40 mm alizarin wouj-S (pH 4.2) epi rense anpil ak dlo. Yo te elimine tach la mare ak 10 pousan (w/v) klori cetylpyridinium ak alizarin wouj-S nan echantiyon yo te quantifier pa mezire absorption nan 550 nm ak konpare ak yon koub estanda. Yon mòl alizarin wouj-S seleksyonman mare apeprè de mòl kalsyòm.

Cistanche is good for bone formation

Cistanche deserticolase bon poufòmasyon zo

Kantitatif reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl

RNA total yo te ekstrè nan osteoblasts lè l sèvi avèk yon twous TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Transkripsyon ranvèse te fèt lè l sèvi avèk 2 mg RNA total ak yon oligo (dT) Jadendanfan.[19,20] Yo te fè reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl (qPCR) lè l sèvi avèk TaqMan® yon sèl-etap PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Yo te ajoute cDNA total (100 ng pou chak 25-ml reyaksyon) ak premye sekans espesifik ak sond Taqman®. Tout primè jèn sib ak sond yo te achte komèsyalman, ki gen ladan b-aktin kòm yon kontwòl entèn (Applied Biosystems). Yo te pote tès qPCR an triple sou yon sistèm deteksyon sekans StepOnePlus (Applied Biosystems). Kondisyon yo monte bisiklèt yo te 10-min deklanchman polymerase nan 95 degre ki te swiv pa 40 sik nan 95 degre pou 15 s ak 60 degre pou 60 s. Yo te fikse papòt la pi wo pase background kontwòl ki pa modèl la ak nan faz lineyè anplifikasyon jèn sib la pou kalkile nimewo sik kote yo te detekte transkripsyon an (ki endike CT).

Analiz Western blot

Lysates selil yo te prepare jan sa dekri anvan an.[21,22] Pwoteyin yo te rezoud pa SDS-PAGE epi yo te transfere nan manbràn Immobilon polyvinyl difluoride (Millipore, Billerica, USA). Blots yo te bloke ak 4 pousan albumin serom bovin pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak Lè sa a, sonde ak lapen anti-moun antikò kont p-65, oswa p-p65 (1: 1000) pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Apre twa lave, blots yo te enkube ak peroksidaz-konjige bourik anti-lapen segondè antikò (1: 1000) pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Yo te vizyalize tach yo pa chemiluminescence amelyore lè l sèvi avèk fim X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).

Osteyopowoz la pwovoke nan òvèj

Sourit ICR fi, kat semèn, 22 ~ 28 g, yo te itilize pou etid sa a. Sourit yo te ovariectomized bilateralman anba trichloroacetaldehyde (100 mg / kg) anestezi ak sourit kontwòl yo te sham-opere (Sham) pou konparezon. Dansite mineral zo ak kontni mineral zo yo te mezire apre administrasyon oral divès kalite konsantrasyon nan CD(Cistanchedeserticola)ekstrè chak de jou pou kat semèn. Dansite mineral zo total ak kontni mineral zo yo te detèmine pa yon absòpsyon radyografi ki gen doub enèji (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) lè l sèvi avèk yon mòd pou ti matyè jan sa dekri deja.[18, 23] Tout pwotokòl respekte direktiv enstitisyonèl yo epi yo te apwouve pa Komite Swen Animal nan Inivèsite Medikal Lachin.

Analiz estatistik

Yo te fè analiz estatistik lè l sèvi avèk Prism 4.01software. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Valè yo bay yo vle di SEM. Analiz estatistik ant de echantiyon yo te fèt lè l sèvi avèk tès t Elèv la. Konparezon estatistik plis pase de gwoup yo te fèt lè l sèvi avèk yon analiz yon sèl-fason nan divèjans ak tès posthoc Bonferroni a. Nan tout ka yo, P <0.05 te="" konsidere="" kòm="">

cistanche is good for bone formation

Cistanche deserticolase bon poufòmasyon zo

Rezilta yo

Cistanche deserticolaekstrè ogmante mineralizasyon zo pa osteoblasts Adisyon nan CD la(Cistanchedeserticola)ekstrè pou 24 oswa 48 èdtan pa te afekte pwopagasyon selil osteoblast MC3T3-E1 sourit nan yon tès MTT (done yo pa montre). Paske diferansyasyon osteoblast se yon pwosesis konplèks ki enplike pwopagasyon selilè ak migrasyon, nou te teste tou kapasite migratè selil MC3T3-E1 apre tretman ak CD.(Cistanchedeserticola)ekstrè. Sèvi ak Transwell ak tès geri blesi, nou jwenn CD sa a(Cistanchedeserticola)ekstrè pa t 'afekte migrasyon osteoblast (done yo pa montre). Fòmasyon nan nodul mineralize se youn nan makè yo nan spirasyon osteoblast. Alizarin wouj S tach te montre ke mineralize nodul fòme lè osteoblasts yo te kiltive pou de semèn nan yon mwayen ki gen vitamin C (50 ug / ml) ak -glycerophosphate (10 mm), fason ki depandan konsantrasyon nan adisyon nan CD.(Cistanchedeserticola)(Figi 1a). Se poutèt sa, CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pwovoke fòmasyon nodil zo pa osteoblast kiltive, men se pa pwopagasyon oswa migrasyon yo. Nou te egzamine tou wòl CD(Cistanchedeserticola)ekstrè nan RANKL-induit osteoclastogenesis men yo pa jwenn okenn efè (done yo pa montre).

Ekstrè Cistanche deserticola ogmante fosfataz alkalin, pwoteyin mòfogenetik zo -2, ak ekspresyon osteopontin nan osteoblast kiltive.

Osteoblasts diferansye montre aktivite ALP ki wo, ki gen rapò ak nivo ekspresyon anzim ki wo yo.[18] Nou te jwenn ke tretman ak CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pou 72 h siyifikativman ogmante aktivite osteoblast ALP (Figi 1b). Etandone wòl enpòtan BMP-2, ALP, ak OPN nan diferansyasyon osteoblast, nou teste si CD(Cistanchedeserticola)ekstrè egzèse efè li sou diferansyasyon osteoblast pa reglemante ekspresyon BMP-2, ALP, ak OPN. Tretman nan selil ak CD(Cistanchedeserticola)Ekstrè ogmante ekspresyon mRNA nan ALP, BMP -2, ak OPN nan yon fason ki depann de konsantrasyon (Figi 1c), ki demontre ke CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pwovoke diferansyasyon osteoblasts pa upregulating ekspresyon ALP, BMP -2, ak OPN.

Cistanche deserticola is good for bone formation

Ekstrè Cistanche deserticola ogmante fòmasyon nodil zo atravè chemen pwoteyin kinaz mitogen aktive

Yo te rapòte ke MAPK jwe yon wòl enpòtan nanzofòmasyon[24,25] se konsa nou pwochen egzamine si chemen siyal sa a enplike nan CD(Cistanchedeserticola)mineralizasyon zo ekstrè-pwovoke. Pretretman nan selil ak ERK inhibitor U0126, p38 inhibitor SB203580, oswa JNK inhibitor SP600125 redwi CD(Cistanchedeserticola)ekstrè-ogmante mineralizasyon zo (Figi 2a, 3a, ak 4a). Anplis de sa, inhibiteurs yo tou bloke CD(Cistanchedeserticola)Ekstrè-induit ALP, BMP -2, ak ekspresyon OPN (Figi 2b-4c). Transfeksyon nan selil ak ERK2, p38, oswa JNK mutant redwi CD(Cistanchedeserticola)ekstrè-ogmantasyon nan ekspresyon ALP, BMP -2, ak OPN mRNA (Figi 2c, 3c, ak 4c). Apre sa, nou dirèkteman egzamine deklanchman ERK, p38, ak JNK apre CD(Cistanchedeserticola)ekstrè tretman. Enkubasyon selil ak CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pwovoke ERK, p38, ak JNK fosforilasyon (Figi 2d, 3d, ak 4d). Se poutèt sa, ERK, p38, ak JNK medyatè ogmante azofòmasyonpwovoke pa CD(Cistanchedeserticola)tretman osteoblast.

FIGURE 2-1

Cistanche deserticola is good for bone formation

figure 3-1

figure 3-2

Cistanche deserticola is good for bone formation

Ekstrè Cistanche deserticola ogmante fòmasyon nodil zo atravè chemen faktè nikleyè kB

Kòm mansyone deja, aktivasyon NF-kB nesesè pouzofòmasyon.[26,27] Nou te trete osteoblast yo ak inibitè NF-kB pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) ak N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) te achte nan men Calbiochem (Darmstadt, Almay) pou detèmine si deklanchman NF-kB se. patisipe nan CD(Cistanchedeserticola)mineralizasyon zo ekstrè-pwovoke. Figi 5a montre ke pretreatman osteoblast ak PDTC oswa TPCK anpeche CD.(Cistanchedeserticola)Ekstrè-induit fòmasyon nodil zo, epi tou li redwi ogmantasyon nan ekspresyon ALP, BMP -2, ak OPN (Figi 5b ak 5c). Fosforilasyon nan subinite NF-kB p65 la se yon endikatè nan aktivasyon NF-kB;[28] ki konsistan avèk sa a, nou te jwenn ke CD(Cistanchedeserticola)ekstrè ogmante fosforilasyon p65 nan osteoblast yo (Figi 5d). Rezilta sa yo endike ke aktivasyon NF-kB enpòtan pou ekspresyon CD ekstrè-pwovoke ALP, BMP -2, ak OPN ekspresyon ak fòmasyon nodil zo.

Cistanche deserticola is good for bone formation

Figi 4 Patisipasyon c-Jun N-terminal kinases (JNK) nanCistanchedeserticola(CD) ekstrè-pwovoke mineralizasyon zo nan osteoblasts. (a) Selil yo te plake nan plak 24-byen epi yo te kiltive nan yon mwayen ki gen vitamin C (50 mg/ml) ak b-glycerophosphate (10 mM) pou de semèn. Selil yo te trete ansanm ak CD(Cistanchedeserticola)ekstrè (26 mg / ml) plis SP600125 (3 mM). Yo te evalye fòmasyon nodil mineralize a pa alizarin wouj-S tach (n=5). (b, c) Selil yo te pretrete ak SP600125 pou 30 minit oswa transfekte ak JNK mutan oswa 24 èdtan ki te swiv pa eksitasyon ak ekstrè CD, ak aktivite fosfataz alkalin (ALP) ak ALP, pwoteyin morfogenetik zo (BMP) -2 ak ekspresyon mRNA osteopontin (OPN) te mezire pa twous ALP ak kantite reyaksyon chèn polymerase an tan reyèl. (d) Selil yo te trete ak ekstrè CD pou entèval tan ki endike yo, epi ekspresyon p-JNK te egzamine pa Western blotting. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)gwoup ekstrè-trete.

figure 5-1

figue 5-2

Anpèchman nan pèt zo pa ekstrè Cistanche deserticola nan sourit ovariectomized

Pou egzamine efè CD(Cistanchedeserticola)ekstrè sou pèt zo, osteyopowoz la te pwovoke nan sourit fi pa ovarectomy. Kòm espere, sourit ovariectomized parèt diminye dansite mineral zo total ak kontni mineral zo (Figi 6a ak 6b). Tretman ak CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pou kat semèn anpeche pèt dansite mineral zo ak kontni mineral zo nan yon fason ki depann de dòz (Figi 6a ak 6b). Konsantrasyon san ALP ka reflete aktivite osteoblastik la.[29] Jan yo montre nan Figi 6c, CD(Cistanchedeserticola)ekstrè inibit diminisyon nan aktivite ALP serik pwovoke pa òvèj. Anplis de sa, CD(Cistanchedeserticola)ekstrè tou ogmante nivo a nan osteocalcin, yon makè nanzofòmasyon, ak redwi nivo C-tèminal telopeptides nan kolagen an tip-I, yon makè nan resorption zo (Figi 6d ak 6e). Konklizyon sa yo sipòte puisans ak efikasite CD(Cistanchedeserticola)ekstrè nan anpeche pèt zo nan vivo.

figure 6-2

figure 6-3

Figi 6 Anpèchman nan ovariectomy-induit diminisyon nan dansite mineral zo ak kontni mineral zo paCistanchedeserticola(CD) ekstrè. Sourit ICR fi yo te bay yon operasyon simulacre oswa yo te ovariectomized. Sourit ovariectomized yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan CD(Cistanchedeserticola)ekstrè pa manje oral. Total de dansite mineral zo kò (a), kontni mineral zo (b), aktivite serik fosfataz alkalin (ALP) (c), serik osteokalcin (d), ak serik C-tèminal telopeptides nan kolagen an tip I (e), yo te detèmine kat. semèn apre operasyon an. Done yo prezante kòm SE vle di, n=8–10 sourit/gwoup. *P < 0.05,="" konpare="" ak="" sham;="" #p=""><0.05, konpare="" ak="" gwoup="">

Cistanche products