Cistanoside nan Cistanche Herba Amelyore Ipoksi-pwovoke domaj repwodiksyon gason atravè sipresyon nan estrès oksidatif-Ⅰ
Apr 01, 2024
Entwodiksyon
Kounye a, apeprè 48.5 milyon (15%) koup ki gen laj repwodiktif atravè lemond afekte pa lakòz, pami ki 40-50% nan ka yo atribiye a lakòz gason, yon kondisyon ki asosye fòtman ak faktè anviwònman ak fòm. Prèv sijere ke sansiblite nan tèstikul la mamifè a ba presyon oksijèn se yon faktè kozatif nan kèk fòm lakòz gason. Jan sa te demontre nan etid anvan yo, spermatogenèz gen pwoblèm ak redwi lè ekspoze a ipoksi ipobarik.
NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMELIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Pou eksplore mekanis ki kache a, etid yo montre ke ekspoze a ipoksi ipobarik ogmante pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS). ROS jwe yon wòl enpòtan nan sistèm repwodiktif gason an. Nan nivo ki ba yo, yo nesesè pou kapasite espèm, reyaksyon akwosòm, ak fizyon espèmatozoy ak oosit [10]. Sepandan, twòp ROS ka pwovoke espèm nikleyè / mitokondriyo domaj ADN ak domaj peroksidatif manbràn plasma, ki an vire se gwo faktè etyolojik pou la.ogmante risk pou lakòz gason. Kidonk, akimilasyon ROS ki pwovoke ipoksi ta ka youn kòz lakòz gason.
Cistanches Herba, yon plant medsin parazit kontinuèl, lajman distribiye nan zòn arid epi yo itilize lajman akòz aktivite famasi li yo. Pami tout sa ki efikas nanCistanches Herba, PhG yo te konsidere kòm eleman prensipal aktif. Pou dat, 34 PhG yo te izole dePlant Cistanches. Cistanoside(Cis), yon PhG aktif izole deCistanches Herba, te resevwa atansyon pou efè antioksidan li yo.
Lè nou konsidere efè antioksidan Cis ak wòl ROS nan sterilite gason ipoksi pwovoke, Cis konsidere kòm yon potansyèl kandida dwòg pou tretman an.ipoksi pwovoke lakòz gason. Sepandan, kèk rapò yo te adrese efè antioksidan Cis extrait nan Cistanches Herba nan tretman ipoksi lakòz lakòz gason oswa chemen siyal yo enplike. Nan etid sa a, yo te konstwi modèl eksperimantal ipoksi in vitro ak in vivo ak konpozan efè diferan Cis yo te evalye.
Materyèl ak metòd
Kilti selil ak reyaktif
Liy selil spermatogonia sourit GC-1spg (GC-1) te achte nan men American Type Culture Collection (ATCC) epi yo te kiltive nan DMEM (Invitrogen, USA) ak 10% serom fetis bovin, 1% L-glutamin (100 mM), penisilin (100 U/mL), ak streptomycin (100 ug/mL) nan 37 degre nan yon enkibatè imidite ak 5% CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) te achte nan men Chengdu Gelipu Biotechnology co, Ltd (Lachin).
NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMELIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Tès viabilite selilè
Vitabilite selil yo te teste pa tès twous konte selil{{0}} (CCK-8). An brèf, selil GC-1 yo te simen nan 96-plak byen nan 1.5×103 pou chak pi, epi yo te kiltive nan 37 degre pou 24 èdtan. Lè sa a, selil yo te trete ak konsantrasyon diferan (20%, 15%, 10%, 5%) nan oksijèn oswa konsantrasyon diferan (2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM) nan Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-). C, Cis-H) pou tan ki nesesè yo. Lè sa a, yo te jete sipènatan an, epi yo te detekte viabilite selil yo lè l sèvi avèk yon twous CCK-8 (Dojindo Japon). Yo te mezire absorbans chak pi nan 450 nm lè l sèvi avèk yon lektè mikwoplak (BioRad USA). Finalman, yo te kalkile viabilite selil yo dapre fòmil sa a: Selil viabilite=(Oexperimental group - ODblank group)/ (ODcontrol group - ODblank group) × 100%.
Analiz Western blot
Selil rekòlte oswa tisi yo te omojeneize nan tanpon RIPA pou ekstrè pwoteyin (RIPA Beyotime Lachin; Cocktail Roche Switzerland). Supernatant yo te kolekte, epi konsantrasyon nan pwoteyin yo te teste pa metòd la BCA (Beyotime). Apeprè 40 ug nan pwoteyin yo ekstrè ki soti nan chak echantiyon yo te separe pa SDS-PAGE ak electrotransferred sou yon manbràn filtre nitrocellulose (NC) (Beyotime Lachin). Manbràn filtre NC yo te bloke ak 5% lèt san grès pou 1.5 èdtan epi yo te enkube ak antikò espesifik (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1. :1000, anti-GAPDH 1:1000 tout antikò yo te achte nan Cell Signaling Technology, USA) lannwit lan nan 4 degre. Lè sa a, tout manbràn NC yo te enkube ak antikò segondè ki korespondan peroksidaz-konjige pou 1.5 èdtan nan tanperati chanm ak imaj ak yon sistèm D (Tannon, Lachin).
Deteksyon sik selilè
Yo te fè yon tès sitometrik koule (FCM) pou analize sik selil la. Selil yo te trete nan diferan kondisyon pou 72 èdtan ak rekòlte. Lè sa a, selil yo te lave ak PBS, fiks nan 75% etanòl, ak tache ak yòd propidium (PI). Pou chak echantiyon, 1 × 104 selil yo te kolekte epi analize pa sikometri koule (FACS Calibur, BD Biosciences). Lè sa a, yo te kalkile pwopòsyon selil faz G1 / S / G2 ak endèks pwopagasyon [Faz (S + G2) / Faz (G1+ S + G2) × 100%].
Ki-67 tach
Selil yo te kiltive nan yon plat konfokal epi yo te trete ak ipoksi oswa diferan subtip Cis pou 72 èdtan. Apre yo fin fikse tout selil yo ak 4% paraformaldeyid, yo te enkube ak yon antikò anti-Ki-67 (1:200, Teknoloji siyal selil). Lè sa a, tout selil yo te enkube ak yon CY-3-konjige antikò IgG anti-lapen (1:200, Boster, Lachin) ak solisyon DAPI (1.0 ug/mL, Beyotime). Yo te obsève fliyoresans ak yon mikwoskòp konfokal Fluoview FV1000 (Olympus, Japon).
TOP-TIER CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT POU BOOSTING TESTOSTERONE PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Deteksyon ROS
Yo te prezante FCM pou mezire nivo ROS intraselilè lè l sèvi avèk DCFH-DA. Selil ki sispann yo te simen nan 6-plak byen epi yo te sibi tretman diferan. Apre 72 èdtan nan tretman, selil yo te sispann nan DMEM san serom ak 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Lè sa a, kontni ROS yo te detèmine pa klasman selil fluoresans aktive sou yon Beckman Coulter Flow Cytometry System ak yon longèdonn eksitasyon 488 nm ak longèdonn emisyon 525 nm [18].
Detèminasyon peroksidasyon lipid (LPO)
Yo te fè tès asid thiobarbituric sibstans reyaktif (TBARS) pou detekte LPO. Tout etap operasyon yo te fèt dapre enstriksyon yo (Sigma USA). Konsantrasyon yo te kalkile lè l sèvi avèk yon koyefisyan disparisyon molè nan 1.56 × 105 / (M · cm), ki te jwenn itilize malondialdehyde kòm yon estanda. Rezilta yo eksprime kòm nmol nan ekivalan MDA/mg nan pwoteyin.
Detèminasyon aktivite anzim yo
Aktivite anzim yo te teste lè l sèvi avèk twous tès ki gen ladan glutatyon reduktaz (GR), glutatyon peroksidaz (GPx), ak superoksid dismutaz (SOD). Tout etap opere yo te fèt dapre enstriksyon yo bay (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute Lachin).
Bèt ak pwotokòl eksperimantal
Rat Wistar gason ki gen matirite (180-220 g, 8 w fin vye granmoun) yo te jwenn nan sant bèt nan katriyèm Inivèsite Medikal Militè a, Xi'an, Lachin. Yo te jwenn pèmisyon pou itilize bèt yo nan Komite Etik Inivèsite a (Nimewo Referans: 20190506). Eksperyans bèt la te fèt dapre direktiv inivèsite pou swen ak itilizasyon bèt laboratwa yo.
Tout rat yo te pèmèt yo adapte pou apeprè 1 semèn anvan kòmansman eksperyans la. Apre aklimatasyon, rat yo te distribye owaza nan 6 gwoup ak 5 bèt nan chak gwoup. Rat yo nan gwoup kontwòl la te leve anba presyon nòmal (PO2: 20%; presyon lè a: 101.3 kPa), pandan y ap rat yo nan modèl la ak gwoup trete Cis yo te leve soti vivan nan yon chanm oksijèn ba-presyon (presyon entèn nan 61.6 kPa). , ekivalan a yon wotè 4000 mèt anwo nivo lanmè PO2: 14.55%) pou simulation yon anviwònman ipoksik wo-altitid; Tout rat te gen aksè gratis nan manje ak dlo nan kaj plastik nan 22 ± 2 degre ak kondisyon imidite ak yon sik otomatik 12-h limyè / fè nwa. Rat yo nan gwoup modèl yo ak gwoup trete Cis yo te rete anba kondisyon ipobarik men yo te transfere nan kondisyon normobarik chak 96 èdtan, nan moman sa a yo te ba yo manje ak dlo epi yo netwaye kaj yo. Dire tranzisyon an soti nan ipobarik nan ipobarik te apeprè 2 èdtan. Tout gwoup tretman yo te trete ak Cis ki koresponn lan (8 mg / kg / d) atravè gavaj oral pou 8 semèn, tandiske kontwòl ak rat modèl yo te trete ak yon volim egal dlo.
Apre 8 semèn, rat yo te sakrifye anba anestezi. Tès, epididim, ak vesik seminal yo te separe epi peze, epi yo te kalkile endèks ògàn yo dapre fòmil sa a: (pwa ògàn/pwa bèt) × 100%. Imedyatman, yo te kolekte espèm nan epididim yo, epi yo te teste mobilite yo ak aktivite anzim akwosòm yo. Menm jan an tou, tisi testikil yo te kolekte pou etid istopatolojik ak ROS, LPO, ak deteksyon aktivite anzim antioksidan.
CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT CISTANCHE ZÈB OGMANTE SEX POWER PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Evalyasyon pousantaj espèm vivan
Epididim la te ensize ak sizo chirijikal, epi yo te prepare sispansyon espèm nan nan saline nòmal. Pou evalye pousantaj espèm vivan an, yo te melanje ak anpil atansyon 5 μL nan sispansyon espèm ak yon volim egal nan tach eosin-Y. Lè sa a, yo te konte espèm yo anba yon mikwoskòp limyè. Pousantaj espèm vivan yo te evalye lè yo kalkile tou de tache (espèm ki mouri) ak espèm san tach (espèm vivan).
Detèminasyon aktivite anzim akwosòm espèm
Egzamen aktivite anzim akwosòm espèm yo te itilize pou evalye anzim akwosòm espèm [19]. Rezilta yo nan chak gwoup yo te kalkile ak fòmil sa a: Akwosòm aktivite anzim (μIU)=(ODExperiment group - ODBlank group)/(247.5 × 10) × 106.
Rezilta yo
Efè ipoksi sou selil GC-1
Pou detèmine efè ipoksi sou selil jèm yo, nou te premye egzamine chanjman ki fèt nan viabilite selil apre tretman ipoksi ak diferan konsantrasyon oksijèn (20%, 15%, 10%, ak 5%) pou 1, 3, 5. , ak 7 jou, respektivman. Rezilta tès CCK-8 yo te montre ke konpare ak gwoup kontwòl la (20% konsantrasyon oksijèn), selil ki ekspoze a ipoksi montre yon diminisyon enpòtan nan viabilite (P <0.01; Figi 1A). Anplis de sa, pousantaj siviv yo te envès pwopòsyonèl ak konsantrasyon oksijèn ak plis diminye ak tan endiksyon. Pou evite yon efè sitotoksik twòp, yo te chwazi yon konsantrasyon oksijèn 10% ak tan endiksyon 3-jou kòm kritè modèl ipoksik pou eksperyans ki vin apre an vitro.
Apre sa, yo te fè FCM ak tach imunofluoresan pou plis evalye chanjman pwopagasyon selil GC{{0}} anba tretman ipoksi. Rezilta yo te montre ke ipoksi ka pwovoke arestasyon selil GC-1 nan faz G1, kidonk diminye antre selil nan faz S la epi anpeche replikasyon ADN. Kidonk, ipoksi siyifikativman redwi endèks pwopagasyon selil GC -1 (P <0.01; Figi 1B). Pozitif Ki-67 tach se yon lòt byomarkè espesifik nan selil k ap pwopagasyon. Se poutèt sa, nou te egzamine tou rapò selil Ki-67-pozitif yo avèk oswa san tretman ipoksi. Konpare ak gwoup kontwòl la, tretman ipoksi redwi konsiderableman selil Ki-67-pozitif yo, jan yo montre nan Figi 1C.
Apre sa, nou te vize pou envestige mòd GC{{0}} anpèchman viabilite selil ki pwovoke pa ipoksi. Jan yo te rapòte nan literati a, nivo ROS ogmante kòm rat yo te ekspoze a yon anviwònman hypobaric hypoxic [8, 20]. Pakonsekan, nivo ROS andojèn nan selil GC-1 yo te mezire lè l sèvi avèk tès FCM la. Rezilta yo te montre pi wo nivo ROS anba ipoksi an konparezon ak gwoup oksijèn nòmal la (P <0.01; Figi 1D). ROS akimile lakòz defisyans ADN ki make, ki an vire lakòz deklanchman chemen apoptoz selilè epi li ta ka pi gwo faktè etyolojik pou ogmante risk pou lakòz gason [21, 22]. Apre sa, nou te detekte efè aktivasyon apoptotik ipoksi sou selil GC-1 pa tach TUNEL. Jan yo montre nan Figi 1E, tretman ak ipoksi te lakòz yon ogmantasyon nan fluoresans TUNEL konpare ak gwoup kontwòl la, ki endike yon ogmantasyon nan apoptoz nan gwoup modèl la.
Piske ROS-pwovoke domaj selilè anjeneral ki te koze pa OS, nou plis teste OS selil GC-1 yo. Jan yo prezante nan Figi 1F, nivo LPO selil GC-1 nan gwoup modèl la te ogmante ansibleman konpare ak nivo LPO selil GC-1 nan gwoup kontwòl la. Konklizyon sa yo sijere ke blesi selil GC-1 ipoksi-induit ta ka gen rapò ak OS, ki se pwovoke pa akimilasyon ROS.
