Klonaj, idantifikasyon fonksyonèl ak analiz ekspresyon nan Chalcone Synthase soti nan Cistanche Tubulosa

Abstract: Objektif

Pou etidye fonksyon an nanchalcone sentaz soti nan Cistanche tubulosaak modèl ekspresyon jèn CtCHS nan flè blan, wouj ak koulè wouj violèt.

MetòdJèn CtCHS la te klonaj pa RT-PCR ak analiz byoenfòmatik te pote soti. Plasmid pET-28a-CtCHS te transfere nan Escherichia coli pou pwovoke ekspresyon pwoteyin pa IPTG. Pwoteyin recombinant CtCHS la te enkube ak substrats p-coumaroyl CoA ak malonyl CoA, epi HPLC ak MS te detekte pwodwi yo. Yo te transfere plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS nan pwotoplas Arabidopsis thaliana pou obsève lokalizasyon subselilè pwoteyin CtCHS la. Modèl ekspresyon jèn CtCHS nan flè C. tubulosa ak twa koulè te detekte pa qRT-PCR.

Rezilta yoYon jèn CtCHS te klonaj. Longè ankadreman lekti ouvè a (ORF) te 1173 bp, ki kode 390 asid amine, ak pwa molekilè pwoteyin lan te 42 8000.

ÒGANIC CISTANCHE EXTRÈ AK 30% ECHINACOSIDE AK 12% ACTEOSIDE

CtCHS te genyen résidus katalitik Cys164, His303, Asn336, ki te konsève nan chalcone synthase. Pwoteyin CtCHS te eksprime nan E. coli ak pirifye pou jwenn pwoteyin recombinant la. CtCHS pwoteyin ka katalize p-coumaroyl CoA ak malonyl CoA pou pwodwi naringenin chalcone. Pwoteyin CtCHS te lokalize sitou nan sitoplasm la. Jèn CtCHS te trè eksprime nan flè koulè wouj violèt ak wouj, ak nivo ekspresyon relatif yo te 8.44 ak 3.21 fwa pi wo pase sa ki nan flè blan, respektivman.

Konklizyon Yon jèn CtCHS te klonaj nan flè C. tubulosa ak pwoteyin yo te eksprime. Pwoteyin CtCHS gen fonksyon chalcone synthase, ak ekspresyon jèn CtCHS pi wo nan flè ki pi fonse, sa ki endike ke jèn CtCHS ka kontwole koulè flè C. tubulosa, ki mete yon fondasyon pou plis rechèch sou mekanis règleman koulè flè C. .

Mo kle: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalcone sentaz; analiz aktivite anzim; lokalizasyon subselilè; analiz ekspresyon

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT se genus Pyreal plant, ki natirèlman distribye nan sid Xinjiang [1] nan zòn Hetian nan Xinjiang [2]. Flè tiyo yo gen anpil valè medsin. Tij vyann li yo se youn nan sous vèsyon 2020 la nan "Farmakope Chinwa". [3] Rechèch sou tij vyann yo flè cordonus ogmante, men gen relativman kèk rechèch byolojik sou flè li yo. Peryòd flè nan flè yo tiyo se soti nan avril rive me [4], sitou Gen twa koulè nan blan. , wouj, ak koulè wouj violèt Flè tiyo yo rich nan koulè, men yo pa te rapòte mekanis koulè flè yo ki gen rapò ak kalite, kontni, kontni, ak distribisyon estrikti tisi petal, pigman, ak règleman nan faktè anviwònman an. ak faktè jenetik [5] Pigman nan flè plant sitou gen ladan twa kategori: flavonoid, karotèn, ak koulè beetine, ki pi lajman ranje koulè a ​​[7] ak kontni flavonoid yo afekte koulè a ​​nan anpil plant kòm twa varyete Paeonia Lactiflora Pall.

Li parèt tankou blan, ak koulè prensipal la nan koulè a ​​gen koulè a ​​nan konpetans nan wouj ak bèl fè flè yo prezante kòm koulè wouj violèt - wouj [8]. Koulè flè se yon karakteristik enpòtan nan anpil plant dekoratif, epi li se tou faktè kle ki atire ensèk woz yo [9]. Etid yo montre ke li se transmèt Pi gwo frekans nan vizit ensèk se plant la fon wouj violèt cistanche [10]. Pou rechèch byolojik sou rechèch jenetik sentetik nan cistanoids nan flè tib flè cistanosaurus, li se fezab pou klarifye mekanis kontwòl koloran kòdon flè tib, bay baz teyorik pou amelyore koulè teknoloji jeni jenetik, pwomosyon koulè pi rich li yo, ogmante gade, elaji dimansyon aplikasyon yo.

Chemen biosentetik la nanflavonoidkòmanse ak lachemen fenilpropanoid. Phenylalanine premye konvèti nan asid cinnamic anba aksyon an nan fenilalanin amonyalyaz (PAL), ak asid cinnamic 4-hydroxylated pa asid cinnamic. Anzim (asid cinamik-4-idroksilaz, C4H) ak 4-coumarate coenzyme A ligase ({4-coumarate coenzyme A ligase, 4CL) katalize reyaksyon an pou jenere 4-coumaroyl-CoA. [11]. Yon molekil 4-coumaroyl-CoA ak twa molekil malonyl-CoA katalize pa chalcone synthase (CHS) pou jenere naringenin chalcone, ki genkonpoze flavonoid.Kilè eskèlèt debaz chalcone izomeraz, flavanon-3-idroksilaz, dihydroflavonol 4-reductase, elatriye jenere yon varyete flavonoid tankou izoflavon, flavonol, anthocyanins, elatriye [12]. Kòm yon anzim kle nan chemen biosentetik flavonoid la, CHS kontwole kontni flavonoid nan plant yo epi tou li jwe yon wòl enpòtan nan reglemante koulè flè plant [13]. Pou egzanp, silans jèn apre transkripsyon Gentiana scabra Bunge CHS ka anpeche byosentèz anthocyanins ak lakòz blanchi espesifik nan lòb corolla [14]. CHS silans jèn nan Actinidia eriantha Benth. CHS diminye kontni antosyanin nan petal epi lakòz koulè petal wouj yo vin pi lejè [15]. Se poutèt sa, nan etid sa a, yo te klonaj yon jèn CtCHS soti nan flè Cistanche deserticola, ak analiz bioenfòmatik, ekspresyon prokaryotik ak pirifikasyon, analiz aktivite anzim, analiz lokalizasyon subselilè ak analiz ekspresyon nan twa koulè nan flè yo te fèt sou li yo eksplore fonksyon an nan CtCHS. Pwoteyin ak modèl ekspresyon jèn CtCHS yo te itilize pou eksplore preliminè relasyon ki genyen ant CtCHS ak koulè flè Cistanche deserticola, ki te mete fondasyon pou etid la nan mekanis regilasyon nan koulè flè Cistanche deserticola.

1 Materyèl ak enstriman

1.1 Materyèl

Flè Cistanche tuberosa yo te ranmase nan Konte Yutian, Hotan Prefecture, Xinjiang nan mwa me 2018. Yo te swiv prensip o aza a pandan pran echantiyon, epi yo te chwazi flè Cistanche tuberosa ki gen bon estati fizyolojik ak wotè plant ki konsistan. Pwofesè Tu Pengfei nan Peking University School of Pharmacy te pran twa souch Cistanche deserticola ak twa koulè flè blan, wouj ak koulè wouj violèt epi idantifye kòm Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Yo te byen vit jele nan nitwojèn likid, estoke sou glas sèk, epi transpòte nan Beijing. Selil E. coli DH5 konpetan chimikman yo te achte nan men Nanjing Novezan Biotechnology Co, Ltd., ak E. coli BL21 (DE3) selil chimik konpetan yo te achte nan Beijing Quanshijin Biotechnology Co, Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektè a te achte nan men Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA te achte nan men Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin. -chalcone te achte nan men Shanghai Yuanye Biotechnology co, Ltd., ak naringenin te achte nan men Shanghai McLean Biochemical Technology Co, Ltd.

1.2 Enstriman

Nanodrop 2000C spectrophotometer (Thermo Fisher Company, USA); enstriman PCR gradyan (Konpayi Eppendorf, Almay); CFX 96 fluoresans PCR quantitative enstriman, UVP jèl imager, jèl elèktroforèz enstriman, pwoteyin elèktroforèz enstriman (BioRad Konpayi, USA) ;EnSpire

Microplate reader (Konpayi PerkinElmer, USA); enkibatè tanperati konstan (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D gwo-kapasite plen-tanperati osilator (Taicang Eksperimantal Ekipman Faktori); THZ -82Yon beny dlo konstan tanperati osilateur (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra-pwòp workbench (Suzhou Antai Air Technology Co, Ltd.); esterilizè vapè wo-presyon (TOMY Company, Japon); Milli Q pi bon kalite enstriman dlo (Millipore, Etazini); LC-20Yon chromatograph likid ki gen gwo efikasite (Shimadzu Company, Japon); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-wo rezolisyon espektrometri mas (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 lazè konfokal mikwoskòp (Olympus Company, Japon).

2 Metòd eksperimantal

2.1 Ekstraksyon RNA ak sentèz cDNA. Flè Cistanche deserticola yo te piye nan nitwojèn likid ak Lè sa a, sibi tès ekstraksyon RNA.

Total RNA te ekstrè lè l sèvi avèk yon twous (Norgen, Cat 17200), konsantrasyon an RNA ak bon jan kalite yo te detekte pa NanoDrop 2000C, ak echantiyon RNA ak yon rapò A260 / A280 ant 1.8 ak 2.1 yo te chwazi pou sentèz transcription ranvèse nan cDNA. M-MLV ranvèse transkriptaz (Promega, M170B) te itilize pou ranvèse transkripsyon total RNA kalifye nan cDNA. Operasyon eksperimantal yo te fèt dapre enstriksyon yo.

2.2 Klonaj jèn CtCHS

Dapre done transcriptome flè Cistanche deserticola gwoup rechèch nou an [16], yo te teste yon CtCHS ki gen yon ankadreman lekti ouvè, epi yo te itilize lojisyèl SnapGene pou konsepsyon primè espesifik ki baze sou sekans jèn yo (Tablo 1). Anplifikasyon PCR te fèt lè l sèvi avèk Cistanche deserticola flè cDNA kòm yon modèl. Sistèm anplifikasyon an se te 2 × Phanta Max Tanpon 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, en ak en (10 μmol/L) 2 μL chak, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity.

ADN Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Kondisyon reyaksyon yo te: pre-denaturasyon nan 95 degre pou 3 min; 25 sik denaturasyon nan 95 degre pou 15 s, annealing nan 55 degre pou 15 s, ak ekstansyon nan 72 degre pou 1 min; ak ekstansyon reyaksyon a 72 degre pou 5 min. Pwodwi PCR la te detekte pa elektwoforèz jèl agarose 1%, epi yo te itilize twous pou pirifye ADN (Novizan, Cat DC301-01) pou rekiperasyon jèl, epi apre sa yo te pirifye ADN ki te refè a pa yon twous klonaj rapid (Novizan, Cat). C601-01). Te fragman ADN nan ligated ak vektè pCE2 TA/Blunt-Zero, transfòme nan Escherichia coli DH5 selil konpetan, epi apre yo fin kiltive lannwit lan nan 37 degre, yo te chwazi souch klonaj sèl epi voye bay konpayi an pou sekans.

Tablo 1 Primer sekans

2.3 Analiz byoenfòmatik

Sèvi ak lojisyèl sou entènèt ProtParam pou analize pwopriyete fizik ak chimik pwoteyin; itilize zouti sou entènèt Prot Scale pou analize idrofilisite/idrofobisite pwoteyin; sèvi ak zouti sou entènèt SOPMA pou predi estrikti segondè pwoteyin; itilize lojisyèl analiz sou entènèt SWISS-MODEL pou predi estrikti siperyè pwoteyin; itilize lojisyèl sou entènèt TMHMM Predi estrikti transmembran pwoteyin nan; itilize lojisyèl DNAMAN pou konpare omoloji CtCHS ak sekans asid amine CHS lòt espès yo; itilize lojisyèl MEGA-X pou konstwi yon pye bwa filojenetik, lè l sèvi avèk vwazen-joining (NJ) ak koreksyon Poisson Distans evolisyonè a kalkile ak metòd Bootstrap la, epi kantite repetisyon Bootstrap se 1000 fwa.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS te itilize pou plis deteksyon. Kondisyon faz likid yo te Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 kolòn (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm), tanperati kolòn 40 degre, naringenin. , chalcone ak naringenin. Volim loading sibstans kontwòl la se 4 μL, ak volim loading pwodwi reyaksyon anzim la se 7 μL. Dlo (A)-acetonitrile (B) yo itilize kòm faz mobil lan. Gradyan elisyon an se: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 min. , 30% ~ 60% B; 15 ~ 20 min, 60% ~ 100% B; 20 ~ 25 min, 100% B; 25 ~ 31 min, 100% ~ 30% B. Pousantaj nan koule volumetrik se 0.3 mL / min. Kondisyon yo espektometri mas yo se sous electrospray ion, nitwojèn kòm gaz konpayi asirans, presyon gaz djenn 3.5 MPa, presyon gaz oksilyè 1.0 MPa, presyon espre 3500 V, tanperati kapilè 350 degre, tanperati chofaj gaz oksilyè 200 degre, mòd ion pozitif ak negatif, optik. ranje iyon m/z se 100-1500, rezolisyon konplè MS se 35 000, rezolisyon dd-MS2 se 17 500, (N)

CE/steped nce mete a 35, 60.

2.6 lokalizasyon subselilè pwoteyin CtCHS

Ki baze sou sekans CtCHS la ak prensip klonaj san pwoblèm, premye ak sit koupe anzim Kpn Ⅰ ak BamH Ⅰ yo te fèt, ak fragman sib korespondan yo te anplifye pa PCR. Yo te dijere plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP ak endonukleaz restriksyon Kpn Ⅰ ak BamH Ⅰ, epi yo te konekte fragman sib la ak vektè a atravè twous klonaj san pwoblèm (Novizan, Cat C115-01), epi yo te transfere. nan E. coli DH5 selil konpetan. , chwazi yon sèl tansyon klonaj pou sekans, epi ekstrè plasmid soti nan tansyon ki kòrèk yo. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ak pCAMBIA 1300-35S-GFP yo te transfòme an pwotoplas Arabidopsis thaliana lè l sèvi avèk PEG4000, epi yo te kiltive anba limyè ki ba pou 8 a 10 èdtan. Yo te obsève lokalizasyon subselilè pwoteyin CtCHS anba yon mikwoskòp konfokal lazè.

2.7 Analiz modèl ekspresyon CtCHS

Ki baze sou sekans CtCHS la, DNAMAN te itilize pou desine primè quantitative fluoresans an tan reyèl, ak bwat F kòm jèn referans entèn la. Sekans Jadendanfan yo montre nan Tablo 1. Ekspresyon relatif CtCHS nan flè Cistanche deserticola nan diferan koulè te detekte pa PCR quantitative fluoresans an tan reyèl. Sèvi ak TransStart Green qPCR SuperMix (plen lò, AQ101-02) pou mezire ak metòd koloran fluorescent SYBR Green, sistèm reyaksyon: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, en ak en (10).

μmol/L) {{0}}.2 μL chak, cDNA modèl 0.5 μL, nucleotidase-gratis dlo 4.1 μL, yo te itilize yon metòd de etap pou reyaksyon an, epi pwosedi reyaksyon an te baze sou metòd la. nan Dong Xianjuan et al. [18]. Chak echantiyon te genyen 3 replike byolojik, epi yo te repete eksperyans la twa fwa. Done eksperimantal yo te analize lè l sèvi avèk Excel a 2

Ekspresyon relatif CtCHS te kalkile lè l sèvi avèk metòd -ΔΔCt, epi GraphPad Prism 8 te itilize pou fè analiz siyifikasyon ak trase istogram.