Klonaj, idantifikasyon fonksyonèl ak analiz ekspresyon nan Chalcone Synthase soti nan Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Résumé: Objektif yo etidye fonksyon chalcone synthase soti nan Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) ak modèl ekspresyon jèn CtCHS nan flè blan, wouj ak koulè wouj violèt.
Metòd yo te klonaj jèn CtCHS la pa RT-PCR epi yo te fè analiz bioenfòmatik. Plasmid pET-28a-CtCHS te transfere nan Escherichia coli pou pwovoke ekspresyon pwoteyin pa IPTG. Pwoteyin recombinant CtCHS la te enkube ak substrats p-coumaroyl CoA ak malonyl CoA, epi HPLC ak MS te detekte pwodwi yo. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS te transfere nan pwotoplas Arabidopsis thaliana pou obsève lokalizasyon subselilè pwoteyin CtCHS la. Modèl ekspresyon CtCHSgene nan flè yo nanC. tubulosaak twa koulè te detekte pa qRT-PCR.
Rezilta Yo te klonaj yon jèn CtCHS. Longè ankadreman lekti ouvè a (ORF) te 1173 bp, ki kode 390 asid amine, ak pwa molekilè pwoteyin lan te 42 8000. CtCHSprotein a te eksprime nan E. coli ak pirifye pou jwenn pwoteyin recombinant la. CtCHS pwoteyin ka katalize p-coumaroyl CoA ak malonyl CoA pou pwodwi naringenin chalcone. Pwoteyin CtCHS te lokalize sitou nan sitoplasm la. Jèn CtCHS washighly eksprime nan flè koulè wouj violèt ak wouj, ak nivo ekspresyon relatif yo te 8.44 ak 3.21 fwa pi wo pase sa ki nan w hiteflowers, respektivman.
Konklizyon Yon jèn CtCHS te klonaj nan flè a nanC. tubulosaak pwoteyin te eksprime. CtCHSprotein gen fonksyon chalcone synthase, ak ekspresyon jèn CtCHS pi wo nan flè ki pi fonse, sa ki endike ke CtCHSgene ka kontwole koulè flè C. tubulosa, ki mete yon fondasyon pou plis rechèch sou la.mekanis regilasyon koulè flè C. tubulosa.
Mo kle:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalcone sentaz; analiz aktivite anzim; lokalizasyon subselilè; analiz ekspresyon
KLIKE LA POU JWENN NATIRÈL ÒGANIC ÈKSTRÈ CISTANCHE AK 30% ECHINACOSIDE AK 12% ACTEOSIDE.
Sèvis sipò Wecistanche-Pi gwo ekspòtatè cistanche nan Lachin nan:
Imèl:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Achte pou plis detay espesifikasyon:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-boutik
Biosentetik lachemen flavonoidkòmanse ak chemen fenilpropanoid la.Fenilalaninse premye konvèti nan asid cinnamic anba aaksyon phenylalanine amonyalyaz(PAL), ak asid cinnamic 4-idwoksilatè pa asid cinnamic. Anzim (asid cinamik-4-hydroxylase, C4H) ak 4-coumaratecoenzyme A ligase ({4-coumaratecoenzyme A ligase, 4CL) katalize reyaksyon an pou jenere 4-coumaroyl-CoA [11 ]. Yon molekil 4-koumaroyl-CoA ak twa molekil malonil-CoA katalize pa chalcone synthase (CHS) pou jenere naringenin chalcone, ki gen konpoze flavonoid, kilè eskèlèt debaz chalcone izomeraz, flavanon-3-hydroxylase, dihydroflavonol 4-reductase, elatriye jenere yon varyete flavonoid tankou izoflavon, flavonol, anthocyanins, elatriye [12]. Kòm yon anzim kle nan chemen biosentetik flavonoid la, CHS kontwole kontni flavonoid nan plant yo epi tou li jwe yon wòl enpòtan nan reglemante koulè flè plant [13]. Pou egzanp, silans jèn apre transkripsyon Gentiana scabra Bunge CHS ka anpeche byosentèz anthocyanins ak lakòz blanchi espesifik nan lòb corolla [14]. CHS silans jèn nan Actinidia erianthaBenth. CHS diminye kontni anthocyanin nan petal epi fè petal yo wouj. Petal yo vin pi lejè nan koulè[15]. Se poutèt sa, nan etid sa a, yo te klonaj yon jèn CtCHS soti nan flè Cistanche tubulosa, ak analiz bioenfòmatik, ekspresyon prokaryotik ak pirifikasyon, analiz aktivite anzim, analiz lokalizasyon subselilè ak analiz ekspresyon nan twa koulè flè yo te fèt sou li pou eksplore fonksyon CtCHS. Pwoteyin ak modèl ekspresyon jèn CtCHS yo te itilize pou eksplore relasyon ant CtCHS ak koulè flè Cistanche tubulosa, ki te mete fondasyon pou etid mekanis regilasyon an.Cistanche tubulosa koulè flè.
1 Materyèl ak enstriman
1.1 Materyèl
Flè Cistanche tubulosa yo te kolekte nan Konte Yutian, Hotan Prefecture, Xinjiang nan mwa me 2018. Yo te swiv prensip o aza a pandan pran echantiyon, epi yo te chwazi flè Cistanche tubulosa ki gen bon estati fizyolojik ak wotè plant ki konsistan. Twa tansyon nan Cistanche tubulosa ak twa koulè flè nan blan, wouj ak koulè wouj violèt yo te pran ak idantifye kòm Cistanche tubulosa (Schenk) Wight pa Pwofesè Tu Pengfei nan Peking University School of Pharmacy. Yo te byen vit jele nan nitwojèn likid epi yo te transpòte yo nan Beijing nan depo glas sèk. Selil E. coli DH5 konpetan chimikman yo te achte nan men Nanjing Novezan Biotechnology Co, Ltd., ak E. coli BL21 (DE3) selil chimik konpetan yo te achte nan Beijing Quanshijin Biotechnology Co, Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektè a te achte nan men Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA te achte nan men Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin. -chalcone te achte nan men Shanghai Yuanye Biotechnology co, Ltd., ak naringenin te achte nan men Shanghai McLean Biochemical Technology Co, Ltd.
1.2 Enstriman
Nanodrop 2000C spectrophotometer (Thermo Fisher Company, USA); enstriman PCR gradyan (Konpayi Eppendorf, Almay); CFX 96 fluoresans PCR quantitative enstriman, UVP jèl imager, jèl elèktroforèz enstriman, pwoteyin elèktroforèz enstriman (BioRad Konpayi, USA) ;EnSpire
Microplate reader (Konpayi PerkinElmer, USA); enkibatè tanperati konstan (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D gwo-kapasite plen-tanperati osilator (Taicang Eksperimantal Ekipman Faktori); THZ -82Yon beny dlo konstan tanperati osilateur (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra-pwòp workbench (Suzhou Antai Air Technology Co, Ltd.); esterilizè vapè wo-presyon (TOMY Company, Japon); Milli Q pi bon kalite enstriman dlo (Millipore, Etazini); LC-20Yon chromatograph likid ki gen gwo efikasite (Shimadzu Company, Japon); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-wo rezolisyon espektrometri mas (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 lazè konfokal mikwoskòp (Olympus Company, Japon).
2 Metòd eksperimantal
2.1 Ekstraksyon RNA ak sentèz cDNA.
Flè Cistanche tubulosa yo te piye nan nitwojèn likid ak Lè sa a, sibi tès ekstraksyon RNA.
RNA total yo te ekstrè lè l sèvi avèk yon twous (Norgen, Cat 17200), konsantrasyon an RNA ak bon jan kalite yo te detekte pa NanoDrop 2000C, ak echantiyon RNA ak yon rapò A260 / A280 ant 1.8 ak 2.1 yo te chwazi pou transkripsyon ranvèse sentèz cDNA. M-MLV ranvèse transkriptaz (Promega, M170B) te itilize pou ranvèse transkripsyon total RNA kalifye nan cDNA. Operasyon eksperimantal yo te fèt dapre enstriksyon yo.
2.2 Klonaj jèn CtCHS
Ki baze sou done transcriptome flè Cistanche tubulosa nan gwoup rechèch nou an [16], yo te teste yon CtCHS ak yon ankadreman lekti konplè ouvè, epi yo te itilize lojisyèl SnapGene pou konsepsyon primè espesifik ki baze sou sekans jèn (Tablo 1). Anplifikasyon PCR te fèt lè l sèvi avèk Cistanche tubulosa flè cDNA kòm yon modèl. Sistèm anplifikasyon an te 2 × Phanta Max Tanpon 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, en ak en (10 μmol/L) 2 μL chak, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Kondisyon reyaksyon yo te: pre-denaturasyon nan 95 degre pou 3 min; 25 sik denaturasyon nan 95 degre pou 15 s, annealing nan 55 degre pou 15 s, ak ekstansyon nan 72 degre pou 1 min; ekstansyon reyaksyon a 72 degre pou 5 min. Pwodwi PCR la te detekte pa elektwoforèz jèl agarose 1%, epi yo te itilize twous pou pirifye ADN (Novizan, Cat DC301-01) pou rekiperasyon jèl, epi apre sa yo te pirifye ADN ki te refè a pa yon twous klonaj rapid (Novizan, Cat). C601-01). Te fragman ADN nan ligated ak vektè pCE2TA/Blunt-Zero, transfòme nan Escherichia coli DH5 selil konpetan, epi apre yo fin kiltive lannwit lan nan 37 degre, yo te chwazi souch klonaj sèl epi voye bay konpayi an pou sekans.
Tablo 1 Primer sekans
2.3 Analiz byoenfòmatik
Sèvi ak lojisyèl sou entènèt ProtParam pou analize pwopriyete fizik ak chimik pwoteyin; itilize zouti sou entènèt Prot Scale pou analize idrofilisite/idrofobisite pwoteyin; sèvi ak zouti sou entènèt SOPMA pou predi estrikti segondè pwoteyin; itilize lojisyèl analiz sou entènèt SWISS-MODEL pou predi estrikti siperyè pwoteyin; itilize lojisyèl sou entènèt TMHMM Predi estrikti transmembran pwoteyin nan; itilize lojisyèl DNAMAN pou konpare omoloji CtCHS ak sekans asid amine CHS lòt espès yo; itilize lojisyèl MEGA-X pou konstwi yon pye bwa filojenetik, lè l sèvi avèk vwazen-joining (NJ) ak koreksyon Poisson Distans evolisyonè a kalkile ak metòd Bootstrap la, epi kantite repetisyon Bootstrap se 1000 fwa.
2.4 CtCHS ekspresyon prokaryotik ak pirifikasyon
Desine primè ak sit restriksyon BamHⅠ ak XhoⅠ ki baze sou sekans CtCHS la, epi PCR anplifye fragman sib korespondan yo. Yo te dijere vektè pET-28a ak fragman sib la lè l sèvi avèk endonukleaz BamHI ak sekans souch klonaj la, epi yo ekstrè plasmid la apre yon sekans kòrèk. Plasmid pET-28a-CtCHS verifye pa sekans yo te transfere nan selil konpetan Escherichia coli BL21 (DE3). Gade metòd Ding Ning et al. [17] ak izopropil
-D-thiogalactopyranoside (IPTG) yo te itilize pou pwovoke ekspresyon pwoteyin nan tanperati ki ba epi yo te pirifye atravè kolòn kwomatografi afinite Ni 2+ (Cytiva, Cat 17531901). Pwoteyin lan te konsantre pa santrifujasyon nan yon tib ultrafiltrasyon (Millipore, 30 000) epi desale. Sere nan 20 mmol/L tanpon KPB (pH 8.0, ki gen 1 mmol/LEDTA) epi estoke nan yon frijidè -80 degre pou depo alontèm.
2.5 CtCHS analiz aktivite anzim
CtCHS sistèm reyaksyon anzim: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS recombinant pwoteyin 20 μL, nan Apre yo fin reyaji nan yon beny dlo nan 37 degre pou 12 èdtan, yo te melanj lan ekstrè twa fwa ak 800 μL nan acetate etil, seche pa koule nitwojèn, ak Lè sa a, fonn nan 100 μL nan metanol. Sèvi ak segondè pèfòmans likid chromatografi pou detekte pwodwi a. Kondisyon yo se kolòn Ultim LP-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), tanperati kolòn 30 degre, volim echantiyon 10 μL, ak dlo (A) ak asetonitrile (B) kòm koule a. Faz, gradyan elisyon: 0 ~ 10
min, 30% B; 10 ~ 20 min, 30% ~ 60% B; 20 ~ 25 min, 60% ~ 70% B; 25 ~ 30 min, 70% ~ 80% B; 30 ~ 35 min, 80% ~ 100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. To koule volumétrique a se 1 mL/min epi deteksyon se nan yon longèdonn 290 nm.
UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS te itilize pou plis deteksyon. Kondisyon faz likid yo te Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolòn (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm), tanperati kolòn 40 degre, naringenin- kontwòl chalcone ak naringenin. Volim loading pwodwi a se 4 μL, ak volim loading pwodwi reyaksyon anzim se 7 μL. Dlo (A)-acetonitrile (B) yo itilize kòm faz mobil lan. Gradyan elisyon an se: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 min, 30% -60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. To koule volumétrique a se 0.3 mL/min. Kondisyon yo espektometri mas yo se sous electrospray ion, nitwojèn kòm gaz konpayi asirans, presyon gaz djenn 3.5 MPa, presyon gaz oksilyè 1.0 MPa, presyon espre 3500 V, tanperati kapilè 350 degre, tanperati chofaj gaz oksilyè 200 degre, mòd ion pozitif ak negatif, optik. ranje iyon m/z se 100-1500, rezolisyon konplè MS se 35 000, rezolisyon dd-MS2 se 17 500, (N)
CE/steped nce mete a 35, 60.
2.3 Analiz byoenfòmatik
Sèvi ak lojisyèl sou entènèt ProtParam pou analize pwopriyete fizik ak chimik pwoteyin; itilize zouti sou entènèt Prot Scale pou analize idrofilisite/idrofobisite pwoteyin; sèvi ak zouti sou entènèt SOPMA pou predi estrikti segondè pwoteyin; itilize lojisyèl analiz sou entènèt SWISS-MODEL pou predi estrikti siperyè pwoteyin; itilize lojisyèl sou entènèt TMHMM Predi estrikti transmembran pwoteyin nan; itilize lojisyèl DNAMAN pou konpare omoloji CtCHS ak sekans asid amine CHS lòt espès yo; itilize lojisyèl MEGA-X pou konstwi yon pye bwa filojenetik, lè l sèvi avèk vwazen-joining (NJ) ak koreksyon Poisson Distans evolisyonè a kalkile ak metòd Bootstrap la, epi kantite repetisyon Bootstrap se 1000 fwa.
2.4 CtCHS ekspresyon prokaryotik ak pirifikasyon
Desine primè ak sit restriksyon BamHⅠ ak XhoⅠ ki baze sou sekans CtCHS la, epi PCR anplifye fragman sib korespondan yo. Yo te dijere vektè pET-28a ak fragman sib la lè l sèvi avèk endonukleaz BamHI ak sekans souch klonaj la, epi yo ekstrè plasmid la apre yon sekans kòrèk. Plasmid pET-28a-CtCHS verifye pa sekans yo te transfere nan selil konpetan Escherichia coli BL21 (DE3). Gade metòd Ding Ning et al. [17] ak izopropil
-D-thiogalactopyranoside (IPTG) yo te itilize pou pwovoke ekspresyon pwoteyin nan tanperati ki ba epi yo te pirifye atravè kolòn kwomatografi afinite Ni 2+ (Cytiva, Cat 17531901). Pwoteyin lan te konsantre pa santrifujasyon nan yon tib ultrafiltrasyon (Millipore, 30 000) epi desale. Sere nan 20 mmol/L tanpon KPB (pH 8.0, ki gen 1 mmol/LEDTA) epi estoke nan yon frijidè -80 degre pou depo alontèm.
2.5 CtCHS analiz aktivite anzim
CtCHS sistèm reyaksyon anzim: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL, CtCHS recombinant pwoteyin 20 μL, nan Apre yo fin reyaji nan yon beny dlo nan 37 degre pou 12 èdtan, yo te melanj lan ekstrè twa fwa ak 800 μL nan acetate etil, seche pa koule nitwojèn, ak Lè sa a, fonn nan 100 μL nan metanol. Sèvi ak segondè pèfòmans likid chromatografi pou detekte pwodwi a. Kondisyon yo se kolòn Ultim LP-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), tanperati kolòn 30 degre, volim echantiyon 10 μL, ak dlo (A) ak asetonitrile (B) kòm koule a. Faz, gradyan elisyon: 0 ~ 10
min, 30% B; 10 ~ 20 min, 30% ~ 60% B; 20 ~ 25 min, 60% ~ 70% B; 25 ~ 30 min, 70% ~ 80% B; 30 ~ 35 min, 80% ~ 100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. To koule volumétrique a se 1 mL/min epi deteksyon se nan yon longèdonn 290 nm.
UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS te itilize pou plis deteksyon. Kondisyon faz likid yo te Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolòn (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm), tanperati kolòn 40 degre, naringenin- kontwòl chalcone ak naringenin. Volim loading pwodwi a se 4 μL, ak volim loading pwodwi reyaksyon anzim se 7 μL. Dlo (A)-acetonitrile (B) yo itilize kòm faz mobil lan. Gradyan elisyon an se: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 min, 30% -60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. To koule volumétrique a se 0.3 mL/min. Kondisyon yo espektometri mas yo se sous electrospray ion, nitwojèn kòm gaz konpayi asirans, presyon gaz djenn 3.5 MPa, presyon gaz oksilyè 1.0 MPa, presyon espre 3500 V, tanperati kapilè 350 degre, tanperati chofaj gaz oksilyè 200 degre, mòd ion pozitif ak negatif, optik. ranje iyon m/z se 100-1500, rezolisyon konplè MS se 35 000, rezolisyon dd-MS2 se 17 500, (N)
CE/steped nce mete a 35, 60.
2.6 lokalizasyon subselilè pwoteyin CtCHS
Ki baze sou sekans CtCHS la ak prensip klonaj san pwoblèm, premye ak sit koupe anzim Kpn Ⅰ ak BamH Ⅰ yo te fèt, ak fragman sib korespondan yo te anplifye pa PCR. Yo te dijere plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP ak endonukleaz restriksyon Kpn Ⅰ ak BamH Ⅰ, epi yo te konekte fragman sib la ak vektè a atravè twous klonaj san pwoblèm (Novizan, Cat C115-01), epi yo te transfere. nan E. coli DH5 selil konpetan. , chwazi yon sèl tansyon klonaj pou sekans, epi ekstrè plasmid soti nan tansyon ki kòrèk yo. Plasmid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ak pCAMBIA 1300-35S-GFP yo te transfòme an pwotoplas Arabidopsis thaliana lè l sèvi avèk PEG4000, epi yo te kiltive anba limyè ki ba pou 8 a 10 èdtan. Yo te obsève lokalizasyon subselilè pwoteyin CtCHS anba yon mikwoskòp konfokal lazè.
2.7 Analiz modèl ekspresyon CtCHS
Jadendanfan fliyoresan an tan reyèl yo te fèt lè l sèvi avèk DNAMAN ki baze sou sekans CtCHS la, ak F-box kòm jèn referans entèn la. Sekans Jadendanfan yo montre nan Tablo 1. Ekspresyon relatif CtCHS nan flè Cistanche tubulosa nan diferan koulè te detekte pa PCR quantitative fluoresan an tan reyèl. Sèvi ak TransStart Green qPCR SuperMix (plen lò, AQ101-02) pou mezire ak metòd lank fluorescent SYBRGreen. Sistèm reyaksyon: 2 × TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, premye en ak en (10 μmol/L) 0.2 μL chak, modèl cDNA 0.5 μL, yo te itilize 4.1 μL dlo san nukleotid. pou reyaksyon an lè l sèvi avèk yon metòd de etap. Pwosedi reyaksyon an te baze sou metòd Dong Xianjuan et al. [18]. Chak echantiyon te genyen 3 replike byolojik, epi yo te repete eksperyans la twa fwa. Done eksperimantal yo te analize lè l sèvi avèk Excel, yo te kalkile ekspresyon relatif CtCHS lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCt, epi GraphPadPrism 8 te itilize pou fè analiz siyifikasyon ak trase istogram.
