Kontakte:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3, Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

Masamitsu Sato1,6,7

Cistanche ka amelyore fonksyon ren

Selil epitelyal yo òganize yon seri òdone mikrotubul ki pa ‑centrosomal, ki gen pwent mwens yo reglemante pa CAMSAP3. Wòl mikrotubul sa yo nan fonksyon epitelyal, sepandan, mal konprann. Isit la, nou montre ke larennan sourit kote Camsap3 mitasyon devlopespornan proximal tubul convoluted (PCTs). PCT yo te dilate anpil nan mutan anren, epi yo montre tou pwopagasyon selil amelyore. Nan PCT sa yo, selil epitelyal yo te vin angrese ansanm ak perturbation nan etalaj mikrotubul yo ak sèten estrikti subselilè tankou pwosesis fondamantal entèdijitasyon. Anplis de sa, YAP ak PIEZO1, ke yo rekonèt kòm regilatè mechanosensitive pou fòm selil ak pwopagasyon, yo te aktive nan selil PCT mutan sa yo. Obsèvasyon sa yo sijere ke CAMSAP3 - rezo mikwotubul yo enpòtan pou kenbe pwopriyete mekanik apwopriye selil PCT yo, epi pèt li yo deklanche deformation selilè ak pwopagasyon atravè aktivasyon mekanodetèktè, sa ki lakòz dilatasyon PCT yo.

Selil epitelyal yo se pi gwo eleman nan divès ògàn. Yo montre polarite apik-a-bazal ki lye ak fonksyon yo, tankou absòpsyon ak sekresyon. Nan selil epitelyal différenciés, majorite mikrotubul yo pa-centrosomal epi yo aliyen sou aks apik-a-bazal 1-3. CAMSAP3 se yon manm nan fanmi pwoteyin spectrin-asosye kalmodulin-reglemante (CAMSAP)/Nezha/Patronin e li enpòtan pou òganizasyon microtubule epitelyal4–8. CAMSAP3 mare ak estabilize pwent yo mwens nan mikrotubules4,6,9. Nan selil ti trip la nan sourit, CAMSAP3 konsantre nan rejyon cortical apical, ancrage pwent mwens nan mikrotubul ki pa centrosomal nan sit sa yo10,11, sa ki lakòz fòmasyon nan etalaj mikrotubul oryante nan direksyon apicobasal ak pwent plis pwente fondamantalman. . Sepandan, òganizasyon mikrotubul karakteristik sa a pèdi nan sourit ki gen yon jèn mutan ki kode yon Camsap3 tronke (sourit Camsap3dc/dc), kote domèn ki bay microtubule C-terminal efase. Selil epitelyal entesten nan sourit sa yo gen plizyè defo sitolojik, ki gen ladan wotè selil redwi ak òganèl ki mal pozisyone tankou nwayo a ak Golgi10. Malgre gwo twoub sa yo nan achitekti intraselilè, selil epitelyal yo kenbe fèy papye ki genyen de dimansyon ki parèt nòmal10,12, ak trip mitasyon yo pa te gen okenn domaj evidan fizyolojik.

tubules (PCTs), bouk Henle, tubul konvolutif distal, ak kanal kolekte. Tese substructures nephron konpoze de yon sèl kouch epitelyal, ki fonksyone pou filtraj, reabsòpsyon, ak sekresyon.

A ren sistse yon blesi patolojik komen nan laren. Lezyon sistik la varyab; swa fokal oswa plizyè spor fòme sou yon bò oswa bilateralman nan ren yo, ki montre yon degre diferan nan sentòm13-15. Plizyè sistik konjenitalrenmaladi, ki gen ladan polikistikrenmaladi (PKD), maladi ren glomerulocystic (GCKD) ak sistik medulèrenmaladi (MCKD), yo konnen yo lakòz plizyèrenspor nan ren bilateral yo. Nan PKD, spor yo distribye inifòm sou ògàn an antye ki gen ladan PCTs, tandiske GCKD ak MCKD devlope spor nan kapsil Bowman ak kanal kolekte (sitou nan rejyon medul la), respektivman16–19.

Kòm pou PKD, yo konnen de gwo kòz: 1) mitasyon nan jèn Pkd1 oswa Pkd2, ak 2) mitasyon nan jèn ki nesesè pou byogenesis silyom prensipal la. Pkd1 ak Pkd2 kode polycystin1 ak polycystin2, respektivman, ki se chanèl kasyon ki pa selektif20 ki lokalize nan plizyè konpatiman selilè ki gen ladan sily prensipal yo21,22. Nan sourit ki pote yon fòm mutan nan PKD1 oswa PKD2, pwoteyin polycystin pa lokalize nan cilia23. Jèn ki nesesè pou byogenesis sily prensipal yo enkli If88 ak Kif3a, ki patisipe nan transpò intrafagellar24-26. Mitasyon nan jèn sa yo lakòz tourenmaladi sistik24–27 . Malgre ke relasyon ki genyen ant de wout kozatif sa yo konplike23, yon sèl chemen ki te demontre pou pwovoke PKD enplike nan efè siyal Hippo Yap28. Nan sourit mutan Pkd1, transkripsyon ko-activateur YAP/TAZ la ak efèktè c-Myc li yo aktive epi ankouraje cystogenesis28. Men, mekanis ki kache devlopman nan polikistikrenrete lajman enkoni.

Nan etid sa a, nou te envestige wòl CAMSAP3 nanrenestrikti ak fonksyon. Obsèvasyon nou yo montre ke apically lokalize CAMSAP3 kontribye nan oryantasyon an apwopriye nan mikrotubul ki pa centrosomal ak etablisman an nan achitekti a intraselilè nan selil epitelyal nan PCTs, jan yo obsève nan ti trip la. Kontrèman ak epiteli entesten an, sepandan, CAMSAP3malfonksyònmanki te koze anomali nan nivo ògàn nan ren bilateral-ki se, fòmasyon sis nan PCTs. Pèt fonksyon CAMSAP3 te lakòz deklanchman regilatè mechanosensitive ki nòmalman ede prezève entegrite tisi yo. Etid nou an sijere ke CAMSAP3-medyatè òganizasyon mikrotubul ki pa centrosomal enpòtan pou kenbe pwopriyete mechanosensitive PCT yo, epi pèt sistèm sa a lakòz fòmasyon sis rejyonal nan ren an.

Rezilta yo

Sisfòmasyon nanrennan Camsap3 sourit mutan. Analiz fenotip nan Camsap3dc/dc sourit mutan te revele sarennan laj (~ 2 zan) sourit Camsap3dc/dc yo te ipètrofik ak dekolore (figi 1a). Pou analize plis anòmal nan Camsap3dc/dcren, nou egzamine sourit ki pi piti. Nan jou apre akouchman 21 (P21), ren Camsap3dc/dc te gen yon aparans nòmal. Sepandan, seksyon nan ren an revele estrikti sistik nan rejyon cortical yo (Fig. 1b ak Fig. Siplemantè S1a), jan yo konfime pa kalkile endèks la sistik, ki se rapò a nan zòn ki gen sis yo ak zòn nan ren total (Fig. 1c). Nou te egzamine anbriyon mutan pou detèmine lè spor yo kòmanse fòme pandan devlopman, ki te revele yon siy ogmantasyon fòmasyon sis nan apeprè anbriyon jou 17.5 (E17.5) (figi siplemantè S1a, flèch). Nan P 0, spor kortik yo te vin fasilman disène (figi siplemantè S1a, flèch), epi gwosè yo ak kantite yo te ogmante pa P21 (figi 1b, figi siplemantè S1a, flèch). Kòm sourit yo te vin pi gran, fenotip sistik te vin pi evidan, byenke degre fòmasyon sis la te varye pami moun yo (Fig. 1c ak Fig. Siplemantè S1b). Anplis de sa, rapò pwa ren-a-kò a te pi wo pou sourit Camsap3dc / dc pase sourit sovaj (WT) pandan tout lavi yo (Fig. 1d ak Figi Siplemantè S1c, d). Se konsa, ren Camsap3dc/dc te montre fòmasyon kyst, ki te ogmante sou tan, sa ki lakòz ipèrtrofi nan ren ki gen laj.

Sourit Camsap3dc/dc eksprime yon domèn C-terminal-tronke CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10, ki ta ka patisipe nan fenotip sistik obsève nan ren sourit yo. Pou mennen ankèt sou posibilite sa a, nou te pwodwi yon sourit Camsap3–/– (Camsap3-nil) (figi siplemantè S2a, b) (gade tou Metòd an detay). Sourit sa yo te genyen tourenak spor miltip, ak fenotip yo te endistenabl ak sa yo obsève nan sourit Camsap3dc/dc; miyò, sourit eterozigòt (Camsap3 plis /–) pa montre okenn siy ren polikistik (figi siplemantè S2c).

Fòmasyon sis nan PCT nan Camsap3dc/dcren. Pou detèmine ki estrikti ki te vin sistik nan mutan anren, nou te pote immunostaining nan twa segman nefron pou twa pwoteyin, sètadi Megalin (lokalize nan PCTs), yon Na plus / Cl- kotransporter (distal tubul convoluted), ak akwaporin -2 (kolekte kanal). Rezilta yo te montre ke dilatasyon te fèt sèlman nan tubul Megalin-pozitif nan P21 (Fig. 1e ak Fig. Siplemantè S1e), ki endike ke cystogenesis te restriksyon nan PCTs. PCT yo sibdivize an twa segman, sètadi S1, S2 ak S3, epi nou fè distenksyon ant yo pa imunostaining pou transpòtè glikoz SGLT1 ak SGLT2, ki lokalize nan segman S3 ak S1/S2, respektivman29,30. Te dilate tib yo te make sèlman pa SGLT2 (Fig. 1f), ki endike ke cystogenesis rive nan segman yo S1 / S2. Nan pi gran sourit mutan, sepandan, fòmasyon sis pwolonje tou nan kapsil Bowman a (figi 1g).

Achitekti selilè dezoganize nan PCT sistik. Pou eksplore defo nan nivo selilè nan PCT sistik, nou te premye egzamine yo pa eskanè mikwoskòp elektwonik, nou jwenn ke yon popilasyon derentubules ansibleman anfle nan ren Camsap3dc/dc (Fig. 2a), byenke limit anfle a varye de pozisyon an pozisyon nan tubul la. Kouch transvèsal yo te revele ke, nan pòsyon anfle nan yon tubul, lumèn li yo te elaji ansanm ak eklèsi nan kouch nan epitelyal ki konpoze tubul yo (Fig. 2a). Kantifikasyon lè l sèvi avèk echantiyon ematoksilin ak eozin-tache konfime ke wotè selil yo te redwi nan tubul yo dilate (figi 2b), tandiske perimèt apical chak selil yo te ogmante (figi 2c), ki endike ke selil mutan yo te pi gra pase sa yo ki nan WT.ren.

Apre sa, nou te egzamine si achitekti selilè ak/oswa estrikti subselilè PCT yo te afekte pa mitasyon Camsap3. Imunostaining pou DPP IV, yon makè manbràn apical, ak pou Na plis /K plis -ATPase, yon makè manbràn basolateral, endike ke polarite selil la an jeneral te nòmal nan chakrenselil tubul Camsap3dc/dc

Figi 1. Fòmasyon sist nan tibil konvolutè proximal Camsap3dc/dcren. (a) Mòfoloji nan ren WT (plis / plis) ak Camsap3 mutan (Camsap3dc/dc) sourit nan P666. (b) Tach H&E nan ren WT ak Camsap3dc/dc nan P21. Plizyè spor ki te fòme nan cortical ren Camsap3dc/dc. (c) Chanjman endèks sistik sourit WT ak Camsap3dc/dc sou tan. 9 sourit yo te egzamine pou WT oswa Camsap3dc/dc. Gade MATERYÈL AK METÒD pou defnisyon endèks sistik. (d) Rapò ren ak pwa kò. 11 sourit yo te egzamine pou WT oswa Camsap3dc/dc. (e) Imunostaining pou makè proximal convoluted tubules (PCT) (Megalin), distal convoluted tubules (DCT), ko-transpòtè NaCl, ak kanal kolekte (CD) (akwaporin-2; AQP2) nan WT ak Camsap3dc/ dcrennan P21. Imaj nan gade agrandi Megalin montre Megalin delokalize nan selil sistik nan ren Camsap3dc/dc, jan sa endike nan pwent flèch la. Liy kase ak liy kontinyèl yo endike maj apical ak fondamantal selil la, respektivman. (f) Immunostaining pou makè segman S1/S2 (SGLT2, vèt) ak segman S3 (SGLT1, wouj) nan ren WT ak Camsap3dc/dc nan P21. Imaj nan gade agrandi nan SGLT2 montre diminye entansite siyal SGLT2 nan selil sistik nan ren Camsap3dc/dc, jan sa endike nan pwent flèch. (g) Mòfoloji glomerulus nan P21 ak P487. Flèch yo endike glomerulus dilate a. Gade tou Figi S1 ak S2.

Figi 2. Achitekti selilè dezoganize nan selil PCT sistik. (a) Scanning imaj mikwoskòp elektwonik ▸

Cistanche ka amelyore fonksyon ren

nan WT ak Camsap3dc/dcrennan P21. Tibil ren yo nan Camsap3dc/dcrense pasyèlman anfle. (b) Kantifikasyon wotè selil nan cortical [ plis / plis , n=121 selil yo; dc/dc (dilate), n=128 selil; dc/dc (ki pa dilate), n=66 selil]. Ba erè yo endike SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">ren. (i) Kantite sily prensipal nan PCT yo. Kantite sily prensipal yo te kalkile lè l sèvi avèk longè sikonferans apical nan seksyon transvèsal PCT, ansanm ak kantite sily prensipal ak nwayo. [ plis / plis , N=340 selil, 63 koup transvèsal PCT, nimewo sily prensipal=268; dc/dc, N=221 selil, 29 koup transvèsal PCT, nimewo sily prensipal=133].

sourit (figi 2d). Nan contrast, byenke Megalin akimile nan rejyon yo apical nan selil WT, li difize nan sitoplasm nan kèk nan selil Camsap3dc/dc sistik yo (Fig. 1e agrandi View, ak Fig. 2d). Tach fluoresans pou F-aktin, ki akimile nan gwo dansite nan mikwovilli apical, sijere ke mikwovilli yo te detanzantan deranje nan selil yo angrese nan mutan.ren(Fig. 2e arrowhead), jan konfrmed pa mikwoskòp elèktron transmisyon (Fig. 2f). Ezrin, yon pati nan ERM-konplèks la ki asosye ak manbràn plasma apical la31, te diminye oswa pèdi nan selil sistik nan Camsap3dc/dc.ren(Fig. 2e), sijere ke cytoarchitecture te nòmal nan selil mutan yo. Anplis de sa, tandiske Giantin-pozitif Golgi aparèy la jeneralman distribye kòm fil mens jukstapoze nan nwayo a nan selil WT, Golgi a detanzantan te vin kondanse nan selil Camsap3dc/dc (figi 2e). Mikwoskòp elèktron transmisyon revele lòt domaj subselilè nan PCT dilate nan Camsap3dc/dc.ren. Nan selil WT PCT, mitokondri yo te long, ki montre yon oryantasyon òdone sou aks apico-bazal selil la, tandiske nan selil PCT sistik, mitokondri yo te gen tandans fè wonn - pa montre okenn oryantasyon òdone ankò (figi 2f). Nan selil sa yo, striasyon fondamantal yo te dezòganize tou, yo te pèdi envaginasyon paralèl ak pwofon yo ki komen nan selil WT yo (figi 2f pwen flèch ak trase desen), jan yo montre tou nan iminitè pou Na plis /K plis -ATPaz (Fig. 2d pwen flèch). Anplis, nwayo yo te angrese nan selil sistik yo, konpare ak fòm wonn yo nan selil WT (figi 2f, g). Cilia prensipal yo te detekte nan bò luminal nan selil PCT nan tou de ren WT ak mutan (figi 2h, i), kontrèman ak ka a pou sourit mutan ki defektye pou silyogenesis, ki lakòz ren polikistik24–27, ki sijere ke andikap silyogenesis se. pa rezon ki fè chans pou la

obsève fenotip polikistik nan sourit Camsap3dc/dc. Ansanm, obsèvasyon sa yo te endike samalfonksyònmannan CAMSAP3 perturbe achitekti subselilè selil PCT sistik yo.

Sourit Camsap3dc/dc montre kèk defo fizyolojik. Apre sa, nou te egzamine si ren Camsap3dc/dc te gen okenn defo fizyolojik. Etid imunositolojik ki mansyone yo te montre ke Megalin, ki fonksyone kòm yon reseptè andozitik multiligand32,33, te gen tandans difize nan sitoplasm Camsap3dc/dc PCT selil yo (figi 1e flèch, ak figi 2d), kontrèman ak lokalizasyon klè apik li yo nan. WT selil PCT. Anplis de sa, byenke transpòtè glikoz SGLT2 a, ki responsab pou 90 pousan reabsòpsyon glikoz29, lokalize prensipalman nan rejyon apik selil Camsap3dc/dc (jan yo wè tou nan selil WT), entansite siyal li diminye nan sèten rejyon tib sistik. Fig. 1f arrowheads), sijere ke fizyoloji nan tib mutan yo te kapab afekte negatif. Se poutèt sa, nou te fè tès pipi ak san, lè l sèvi avèk P396- a P424-fin vye granmoun sourit. Tès pipi yo te revele yon tandans pou twòp K plus, Mg2 plus, ak nitwojèn ure nan sourit Camsap3dc/dc (Siplemantè Fig. S3a). Tès san yo te demontre plis konvenkan ke sourit Camsap3dc/dc yo te gen yon nivo siyifikativman pi ba nan K plus ak Mg2 plis konpare ak sourit WT oswa Camsap3 plis /dc, byenke pa te detekte okenn chanjman nan nivo nitwojèn ure ak glikoz (figi siplemantè S3b). . Nivo pipi ak kreyatinin san pa t 'diferan ant WT ak sourit mutan (Siplemantè Fig. S3c). Se konsa, nou te obsève sèlman yon pati nan defo fizyolojik nan sourit Cam-sap3dc/dc.

Òganizasyon Microtubule nanrenselil epitelyal tubul yo. Kòm mitasyon Camsap3 mennen nan dezoryante mikrotubul nan selil epitelyal ti trip la10,12, nou te egzamine si sa rive tou nanrenselil epitelyal yo. Nou premye immunostained -tubulin ansanm ak Megalin. Miyò, tou de nan WT ak Camsap3dc/dc ren, Megalin-negatif tubules, se sa ki, swa distal tubul convoluted oswa kanal kolekte, te montre pi fò -tubulin immunostaining entansite pase obsève pou -tubulin nan Megalin-pozitif PCTs (Fig. 3a, b) . Jan yo jwenn nan ti trip la10, CAMSAP3 lokalize apik nan tout selil epitelyal WT.ren, sipèpoze fen apikal nan mikrotubul ki aliyen sou aks apico-bazal la (figi 3c agoch). Camsap3dc/dc selil epitelyal ren yo te tou yon ti jan iminopozitif pou CAMSAP3 men nan pozisyon iregilye (figi 3c adwat, pwent flèch), sijere ke CAMSAP3 mitasyon kenbe nan selil yo, ancrage nan kèk estrikti ki pa idantifye. Nan selil sistik nan ren mutan yo, etalaj mikrotubul yo te anmele ak dezoganize (figi 3c adwat), jan yo obsève nan selil entesten Camsap3dc/dc mice10. Nan selil ki pa sistik, sepandan, òganizasyon microtubule pa te afekte

Figi 3. Microtubules nan selil epitelyal tubul ren yo. (a) Imunostaining pou -tubulin, Megalin, ak nwayo nan ren WT ak Camsap3dc/dc nan P21. (b) Quantification de entansite -tubulin nan PCT ak DCT/CD nan ren WT (PCT, n=28 tubules; DCT/CD, n=18 tubules) ak ren Camsap3dc/dc (PCT, n=28 tubules) {8}} tubules; DCT/CD, n=9 tubules). Ba erè yo endike SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

anpil menm nan absans la nan fonksyonèl CAMSAP3, ki ka eksplike poukisa selil sa yo pa montre okenn anomali sitolojik. Anplis de sa, Camsap3-selil epitelyal ren nil yo te montre tou defo mikrotubul menm jan an men sèlman nan selil sistik (figi siplemantè S2d). Ansanm, rezilta sa yo endike ke CAMSAP3 jwe yon wòl nan kenbe òganizasyon apico-bazal nan mikrotubul sèlman pou yon subpopulation nan selil epitelyal ren.

Amelyore pwopagasyon selilè nan Camsap3dc/dc PCTs. Fòmasyon sis nan ren gen rapò ak pwopagasyon selil ren amelyore34. Pou teste si pwopagasyon selil yo te chanje nan ren Camsap3dc/dc, nou te konpare pwopagasyon selil PCT ant WT ak ren mutan pa ko-imunostaining pou Megalin ak Ki-67, yon makè pou pwopagasyon selil. Ki-67-selil pozitif yo te raman obsève nan PCT nan ren WT, tandiske yo te fasilman parèt nan selil PCT nan ren Camsap3dc/dc. Sepandan, Ki -67 yo te detekte nan tou de tib ki pa dilate ak dilate (figi 4a, b), ki pa montre okenn korelasyon ant pwopagasyon selil ak fòmasyon sis. Pou, CAMSAP3malfonksyònmante ankouraje pwopagasyon selil, men pwosesis sa a pa t toujou asosye ak fòmasyon sis.

Chanjman nan lokalizasyon YAP ak myosin ki pa nan misk ki lye ak deformation selil. YAP se yon activator transcriptional ki kontwole pwopagasyon selilè35 osi byen ke fòmasyon selil ki depann de tansyon mekanik36. YAP aktive ansanm ak lokalizasyon nikleyè li nan ren sourit Pkd1-defficient, yon modèl PKD37, ak aktivasyon Yap ankouraje pwopagasyon selil ak dilatasyon tubulaires nan ren28. Se poutèt sa, nou teste si YAP te aktive tou nan PCT nan ren Camsap3dc/dc. Immunostaining pou YAP revele lokalizasyon sitoplasmik li nan PCT nan ren WT. Remakabman, YAP te vin konsantre nan nwayo Camsap3dc/dc PCT yo, men se sèlman nan pòsyon dilate yo (Fig. 5a), jan yo konfime pa kwantifikasyon (Fig. 5b), sijere ke redistribisyon YAP obsève te fèt an repons a yon chanjman nan selil. mòfoloji olye ke CAMSAP3malfonksyònmanper se.

YAP se yon efèktè en nan chemen Hippo a, ki reglemante pa siyal mekanik38. An reyalite, selil sistik nan ren Camsap3dc/dc parèt lonje, sa ki sijere ke yo ka yo te ekspoze a ogmante tansyon.

Figi 4. Pwopagasyon selilè nan Camsap3dc/dc PCTs. (a) Imunostaining pou Ki-67, Megalin, ak DAPI nan ren WT ak Camsap3dc/dc nan P22. Flèch yo endike Ki-67-selil pozitif nan tubul sistik. (b) Pousantaj Ki-67-selil pozitif nan selil epitelyal PCT [ plis / plis , n=700 selil; dc/dc (dilate), n=224 selil; dc/dc (ki pa dilate), n=396 selil]. Ba erè yo endike SD *p<0.05,>

Se poutèt sa, nou te envestige si nenpòt chanjman mekanik te fèt an konsè ak fòmasyon sis. Paske deklanchman myosin II ki pa nan misk se yon pwosesis tansyon sansib39, nou te evalye distribisyon myosin limyè chèn 2 (MLC2), ki enplike nan aktivasyon myosin II, nan ren. Malgre ke MLC2 difize nan sito-plasm nan selil tubul WT, li te vin konsantre tou pre pòsyon yo apical nan selil sistik nan ren Camsap3dc/dc (Fig. 5c flèch), sijere ke selil sa yo te sibi fòs rupture. Selil nan PCT ki pa dilate yo pa t montre konsantrasyon MCL2 sa yo. Rezilta sa yo te an akò ak lide ke YAP antre nan nwayo a lè selil yo mekanikman lonje40,41.

Chanjman nan distribisyon PIEZO1 nan Camsap3dc/dc PCTs. Pou plis teste si selil sistik yo ekspoze a fòs etann, nou egzamine distribisyon subselilè PIEZO1, yon kanal iyon mekanosansib 42-45, paske sa a se yon makè tipik pou detire mekanik; PIEZO1 lokalizasyon deplase soti nan manbràn plasma/sitoplasm nan anvlòp nikleyè a lè li santi siyal detire46 . Immunostaining pou PIEZO1 te montre ke PIEZO1 sitou lokalize nan sitoplasm nan selil WT PCT, tandiske lokalizasyon li yo sipèpoze ak nwayo a nan selil sistik nan Camsap3dc / dc PCTs (Fig. 6a). Immunostaining pou YAP ak PIEZO1 nan seksyon sekans tou sijere ke lokalizasyon nikleyè yo kowenside nan PCTs dilate (Siplemantè Fig. S4, flèch). Nan lòt men an, nan PCT Camsap3dc / dc ki pa dilate, distribisyon PIEZO1 te gade sitoplasmik (figi 6a). Sepandan, obsèvasyon fèmen nan imaj yo imunofuorescence kòm byen ke quantifcation endike ke lokalizasyon nikleyè li yo gen tandans ogmante nan yon sèten mezi, konpare ak selil WT (Fig. 6a, b). Se konsa, kontrèman ak YAP, li sanble ke PIEZO1 kòmanse aktive anvan deformation detekte selil yo nan Camsap3dc/dc PCTs.

Diskisyon

Nan etid sa a, nou te jwenn ke mitasyon CAMSAP3 oswa pèt li yo te lakòz dilatasyon nan selil PCT, ki te lakòz koup transvèsal yo nan tib yo pran yon aparans sistik. Yon siy cystogenesis te deja obsève osi bonè ke E17.5, ak yon ogmantasyon gradyèl nan dilatasyon pandan aje ak ekstansyon evantyèlman li nan kapsil Bowman la. Selil epitelyal nan rejyon dilate yo te vin pi mens, yo montre plizyè domaj sitolojik, jan yo obsève nan selil ti trip Camsap3dc/dc sourit10,12. Gen kèk defo espesifik nan ren yo te obsève tou, ki gen ladan perturbation nan aliyman mitokondri ak modèl manbràn plasma fondamantal. Chanjman sa yo te kowenside ak perturbation nan aranjman mikrotubul yo, ki sijere ke CAMSAP3-rezo mikrotubul yo responsab pou òganizasyon nòmal estrikti subselilè sa yo nan selil PCT, jan yo jwenn nan lòt kalite selil yo. Nan lòt men an, byenke CAMSAP3 parèt yo dwe eksprime nan tout selil epitelyal tubul ren yo, fenotip estriktirèl aberan yo te obsève sèlman nan PCTs, sijere egzistans lan nan yon mekanis redondants (yo) kenbe rezo mikrotubule nan absans la nan CAMSAP3. Li posib ke molekil lòt pase CAMSAP3, tankou lòt CAMSAPs, ka patisipe nan kenbe entegrite nan rezo microtubule nan selil sa yo. Selil PCT yo te gen yon dansite microtubule relativman pi ba pase lòt selil tubul yo. Li pwobableman fasilite deformation selilè yo, paske rezo mikrotubul yo ki ta rete apre pèt CAMSAP3 ta ka pa ase pou kenbe.

achitekti selil apwopriye a. Menm nan selil PCT, sepandan, mekanis yo sanble egziste ki konpanse pou pèt la nan CAMSAP3, kòm dilatasyon nan PCT yo pa t 'rive inifòm.

Figi 5. Lokalizasyon YAP ak myosin ki pa nan misk ki asosye ak deformation selilè. (a) Imunostaining pou YAP, Megalin, ak DAPI nan ren WT ak Camsap3dc/dc nan P22. Siyal fliyoresan DAPI ak YAP yo te tcheke sou liy ki trase nan imaj yo elaji, epi chanjman espasyal yo nan entansite fuorescence yo montre an ble pou DAPI ak vèt pou YAP. Liy tirè yo endike zòn apwoksimatif nwayo a. Flèch yo endike pozisyon nwayo a nan selil reprezantan yo. (b) Pwopòsyon entansite YAP nikleyè ak entansite YAP sitoplasmik [ plis / plis , n=81 selil; dc/dc (dilate), n =43 selil; dc/dc (ki pa dilate), n=53 selil]. Bwat yo endike premye katil, medyàn ak twazyèm katil. ***p<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Figi 6. Chanjman nan distribisyon PIEZO1 nan Camsap3dc/dc PCTs. (a) Immunostaining pou PIEZO1, Megalin, ak DAPI nan ren WT ak Camsap3dc/dc nan P22. Siyal fliyoresan DAPI ak PIEZO1 yo te tcheke sou liy ki trase nan imaj yo elaji, ak chanjman espasyal nan entansite fuorescence yo montre an ble pou DAPI ak vèt pou PIEZO1. Liy tirè yo endike zòn apwoksimatif nwayo a. Flèch yo endike pozisyon nwayo a nan selil reprezantan yo. (b) Pwopòsyon entansite nikleyè piezo1 ak entansite sitoplasmik piezo1 [ plis / plis , n=66 selil; dc/dc (dilate), n =44 selil; dc/dc (ki pa dilate), n=81 selil]. Bwat yo endike premye katil, medyàn ak twazyèm katil. ***p<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Ki jan, lè sa a, PCT yo te dilate nan yon fason rejyonal, akonpaye pa angrese selil epitelyal? Miyò, fòmasyon sis te vin detekte nan E17.5, ak tan sa a korelasyon ak kòmansman pwodiksyon pipi primitif nan sourit47. Se poutèt sa, nou ka ipotèz ke 'pipi' se yon potansyèl faktè mekanik ki pwovoke dilatasyon nan tubul ren. Li pwobab ke selil PCT ki te pèdi CAMSAP3-medyatè sitoskelèt mikrotubul yo te mekanikman pi fasil pou fòs ekstèn, se sa ki, plis deformable, konpare ak selil WT PCT yo. Se konsa, fòs ki te pwodwi pa pipi fow nan tubul ren yo ta ka lakòz dilatasyon tubul, pote sou angrese yo. Fòs sa yo ka pa inifòm, sa ki lakòz degre dilatasyon varyab ansanm PCT yo. Lide sa a, pa bezwen di, pa eskli lòt mekanis posib pou dilatasyon PCT.

Obsèvasyon nou yo te demontre ke PIEZO1 relokalize soti nan sitoplasm nan rejyon nikleyè a nan selil PCT dilate nan ren Camsap3dc/dc, sa ki sijere ke mechanosensor sa a te aktive an repons a deformation selil, gen plis chans 'etann' selil yo jan yo te rapòte deja46. Eta detire selil PCT dilate yo te konfime pa obsèvasyon ke MLC2 te ogmante nan rejyon cortical yo. Analiz nou an plis endike ke PIEZO1 te deja aktive nan yon sèten mezi nan selil PCT ki pa dilate, ki sijere ke menm selil sa yo te sibi chanjman mekanik malgre aparans nòmal yo. Yon lòt mechanosensor, YAP, te tou aktive nan selil PCT, men aktivasyon li yo te sanble rive sèlman nan selil lonje.

Ki jan, lè sa a, regilatè mechanosensitive sa yo kontribye nan deformation selil, osi byen ke pwopagasyon selil ki te ankouraje nan absans la nan CAMSAP3? Li te montre ke detire-induit deklanchman nan PIEZO1 ankouraje pwopagasyon selil nan selil epitelyal46, sijere ke mekanis sa a travay tou nan selil PCT nan ren Camsap3dc/dc. Lide sa a ki konsistan avèk obsèvasyon nou yo ke pwopagasyon selil amelyore ak deklanchman PIEZO1 pasyèl te fèt ansanm, menm nan selil ki pa dilate nan Camsap3dc/dc PCTs. Konsènan YAP, aktivasyon li yo te retade, li pa montre yon korelasyon klè ak kòmansman amelyorasyon pwopagasyon selil yo. Yo konnen YAP non sèlman kòm yon faktè kwasans selil, men tou kòm yon regilatè nan omeyostazi mekanik, jan yo demontre deja36,48. Se poutèt sa, li posib ke YAP, ki te deplase nan nwayo a ansanm ak deformation nan selil PCT, ta ka fonksyone kontwole fòm yo, se sa ki, retabli fòm nan domaje nan selil sa yo. Sinon, YAP ta ka kolabore ak PIEZO1 nan amelyore pwopagasyon selil dilate, paske yo konnen YAP patisipe nan fòmasyon nan ren polikistik atravè amelyorasyon nan pwopagasyon selil28.

Nou te jwenn ke sourit Camsap3dc/dc te gen nivo siyifikativman pi ba nan san K plus ak Mg2 plus, ki sijere ke ren yo ta ka soufri nan kèk fonksyone nòmal. Gwo defo sitolojik ke nou te obsève nan manbràn plasma apical ak fondamantal nan selil PCT, kote machin transpò aktif la sitiye, ta ka gen rapò ak anomali sa a. Sepandan, nou pa ka eskli posibilite ke lòt pòsyon nan tubul ren oswa lòt ògàn ta ka tou fonksyonèl defo, pwovoke fenotip sa a. Anplis de sa, nou pa t jwenn okenn prèv ki montre fonksyon fltering glomerulus la te domaje, kòm nivo san yo nan kreyatinin ak nitwojèn ure, ki elimine nan glomerulus la, te nòmal.

Dezòd nan byogenesis prensipal silyom mennen nan PKD24-27. Nan ka mitasyon Camsap3, fòmasyon sily prensipal yo te sanble yo pa afekte. Yon etid resan te montre ke pèt CAMSAP3 nan selil epitelyal milti-ciliated nan nen afekte fòmasyon pè santral mikrotubul nan axoneme a, sa ki lakòz aberan mobilite nan sily motile49. Malgre ke sily prensipal yo sou selil epitelyal yo pa mobil epi yo manke pè santral mikrotubules50, li rete ensèten si sily prensipal la nan sourit mitasyon Camsap3 yo toujou fonksyonèl. Malgre ensètitid sa a, anomali yo nan PKD ak Camsap3 mutan yo byen diferan, kòm fòmasyon sis rive inifòm sou ren an antye nan ansyen an, tandiske li se yon evènman lokal nan dènye a. Diferans sa a gen plis chans akòz orijin molekilè diferan nan fòmasyon sis la ant yo.

Pou rezime, etid nou an revele ke CAMSAP3 enpòtan pou kenbe estrikti a ak fonksyon nan tubul ren nan rejyon proximal, gen anpil chans nan règleman nan asanble ki pa-centrosomal microtubule. Plis etid yo pral mande, sepandan, pou yon bon jan konpreyansyon sou fason pèt nan sistèm òganizasyon mikrotubule sa a entèfere ak fonksyon yo fizyolojik nan ren an.

Materyèl ak metòd

Tout eksperyans yo te fèt an akò ak direktiv ki enpòtan, règleman yo, epi yo te apwouve pa RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research ak/oswa Komite Biosekirite Enstitisyonèl Waseda University.

Sourit. Sourit Camsap3 mutan (Camsap3dc/dc) yo te itilize nan etid sa a te pwodwi nan etid anvan nou an10 (aksesyon nimewo CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant percent 20mice percent 20list.html). Nan sourit sa yo, yo te retire rejyon C-tèminal Camsap3, sètadi ekson 14–17, e nou te deja konfime ke selil sourit yo eksprime yon CAMSAP3 ki pa fonksyonèl ki pa fonksyonèl ki tronke C-terminal (CAMSAP3-dc)10. Nan etid la prezan, yo te itilize sourit N4 ak 5 jenerasyon nan eksperyans.

Camsap3 knockout (Camsap3–/–) sourit (asansyon nimewo CDB0033E), ki manke tout 22-kb Camsap3 kodaj rejyon an, yo te pwodwi ak CRISPR/Cas9- koreksyon genòm medyatè atravè zygote electroporation51. Bref, de RNA gid ak yon oligodeoxynucleotide yon sèl-seksyon (ssODN) yo te fèt pou efase rejyon 22-kb, epi yo te ajoute yon sit EcoRI nan bi pou yo rekonèt pou ensèsyon siksè nan sourit mutan yo. Pou elektwoporasyon, cRNAs, tracrRNA, ssODN ak Cas9 pwoteyin yo te prezante nan zigòt C57BL/6 yo. Apre elektwoporasyon, zigòt yo te transfere nan sourit fi ICR pseudopregnant, ak sourit fondatè yo te tcheke pa PCR ak sekans ADN. Sourit knockout pyebwa (#4, #10, #23) yo te jwenn, epi youn nan yo (#23) te gen EcoRI knock-in alèl ki fèt. Gid sekans RNA yo te fèt pa CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp). Sekans crRNAs, tracrRNA, ak ssODN yo te itilize pou koreksyon genòm yo te sentèz jan sa a: 5′-cRNA, 5′-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3′, 3′-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA, 5′-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . Lèt majiskil ak lèt ​​miniskil yo endike sekans kodaj ak oksilyè, respektivman. Yo te travèse liy sourit #23 ak C57BL/6 twa fwa, epi yo te itilize sourit jenerasyon N3 yo nan eksperyans.

Eksperyans sourit yo te apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan Sant RIKEN pou Rechèch Dinamik Biosystems oswa Waseda University, epi yo te fèt an akò ak pwotokòl komite sa yo bay. Etid la te fèt an konfòmite ak direktiv ARRIVE yo: https: //arriveguidelines.org.

Jenotip. Genotype pou sourit te fè pa PCR. Pou sourit Camsap3dc/dc, nou te itilize premye ki dekri nan Toya et al. (2016). Pou sourit Camsap3–/–, nou itilize primè sa yo pou detekte kalite sovaj (WT) (P1/P2, 411 bp) oswa Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) alèl (figi siplemantè S2a, b) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . Rejyon P1/P3 nan WT pa te anplifye anba kondisyon PCR yo itilize yo.

Istoloji: Preparasyon nan seksyon tisi nan frizè. Tisi ren diseke te fxed nan 2 pousan paraform-aldehyde (Termo Fisher) / 0.1 M sorbitol (Nacalai Tesque) / PEM tanpon pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Resèt pou PEM se: 100 mM TIP (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque), ak 5 mM MgCl2 (Wako), ajiste a pH 6.9 ak 2 M KOH. Apre fxation, tisi ren an te rense twa fwa ak PEM pou 10 min. Dis, cryoprotection te pote soti ak sikwoz / PEM: 15 pousan sikwoz nan solisyon PEM pou 2 èdtan nan 4 degre, ki te swiv pa 20 pousan sikwoz nan solisyon PEM lannwit lan nan 4 degre, ak ranplasman ak 30 pousan sikwoz nan solisyon PEM pou ~ 2 èdtan. nan 4 degre. Tisi ren yo te jele nan yon konpoze OCT nan yon mwazi entegre (Polysciences, Inc.) nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 degre. Yo te koupe echantiyon nan frizè nan 5 µm epesè ak yon kriostat CM1850 (Leica). Seksyon sou glisad vè yo te kenbe nan -80 degre jiskaske tach.

Istoloji: Preparasyon nan seksyon tisi parafn entegre. Tisi ren Dissected te fxed nan solisyon Super Fix (Kurabo) pou 2 èdtan nan tanperati chanm, Lè sa a, transfere nan 4 degre lannwit lan. Chak echantiyon te ekspoze a twa solisyon akeuz etanòl ki ogmante konsantrasyon nan tanperati chanm: 30 pousan etanòl pou 3{{20}} min de fwa, 5{0 pousan etanòl pou 3{ {35}} min, epi finalman 70 pousan etanòl pou 30 min. Yo te trete chak echantiyon ak yon processeur tisi ASP300 (Leica). Dis, echantiyon tisi ren yo te entegre nan sir parafn (Sakura Fine-tek) ak yon EG1160 (Leica) epi estoke nan 4 degre. Echantiyon parafn entegre yo te koupe nan 6 µm epesè ak yon RV240 Rotary Microtome (Yamato Kohki). Seksyon sou glisad vè yo te kenbe nan 4 degre jiskaske tach. Tach imunofuoresan. Seksyon ren jele yo te benyen nan 0.1 pousan Triton X-100 (Nacalai Tesque) / PEM pou 10 minit nan tanperati chanm. Dis, echantiyon yo te pèmeabilize lè w aplike 0.2 pousan Triton X -100 / PEM pou 10 min nan tanperati chanm. Yon fwa ankò, echantiyon yo te benyen nan 0.1 pousan Triton X-100 / PEM pou 10 minit nan tanperati chanm. Apre sa, echantiyon yo te bloke ak 3 pousan albumin serom bovin (BSA; Roche) / 0.1 pousan Triton X-100 / PEM pou 30 minit nan tanperati chanm, ki te swiv pa reyaksyon antikò prensipal pou lannwit lan nan 4 degre. Antikò prensipal yo te dilye nan 3 pousan BSA / 0.1 pousan Triton X-100 / PEM. Pou antikò prensipal ki te ogmante nan sourit yo, yo te fè yon lòt bloke ak MOM Blocking Reagent (laboratwa vektè) anvan yo te bloke nan 3 pousan BSA / 0.1 pousan Triton X-100 / PEM. MOM Blocking Reagent te dilye nan 0.1 pousan Triton X -100 / PEM epi aplike nan echantiyon yo pou 30 minit nan tanperati chanm. Apre tretman MOM, echantiyon yo te lave ak 0.1 pousan Triton X-100 / PEM twa fwa pou 5, 10 ak 15 min nan tanperati chanm. Apre reyaksyon antikò prensipal la, echantiyon yo te lave pou 15 minit nan tanperati chanm ak 0.1 pousan Triton X -100 / PEM twa fwa. Te reyaksyon antikò segondè te pote pou 2 èdtan nan tanperati chanm nan fè nwa a. Antikò segondè yo te dilye nan 3 pousan BSA / 0.1 pousan Triton X-100 / PEM. Apre reyaksyon an, echantiyon yo te lave ak 0.1 pousan Triton X-100 / PEM twa fwa pou 5, 10 ak 15 min nan tanperati chanm ak sele ak VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories). Antikò ak reyaktif. ADN te tache ak solisyon DAPI (Dojindo, D523, 1:1000). F-aktin te tache ak Alexa Fluor 594 phalloidin (Termo Fisher, A12381, 1:400). Mikrotubul yo te tache ak sourit anti- -tubulin-FITC (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Yo te itilize antikò prensipal sa yo: kabrit anti-Megalin (P-20; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), lapen anti-NaCl ko-transpòtè (MERCK, AB3533, 1:500). ), lapen anti-akwaporin-2 (abcam, AB3274, 1:400), kabrit anti-SGLT1 (M-19; Santa Cruz Biotechnology, sc-20582, 1:200) , lapen anti-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), sourit anti-ezrin (3C12; abcam, ab4069, 1:500), lapen anti-giantin (Covance, PRB-114 C, 1:700), lapen anti-aPKC (Santa Cruz Biotechnology, sc-216, 1:400), kabrit anti-DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), sourit anti-Na plis /K plis -ATPase (abcam, ab7671, 1:100), sourit anti-acetylated tubulin (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), lapen anti-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), sourit anti-tirosine tubulin (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), lapen anti-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), lapen anti-YAP (Siyal selilè, #4912, 1:100). ), lapen anti-myosin limyè chèn 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), lapen anti-piezo1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), rat anti-E-cadherin (52, 1:400), ak lapen anti-merlin (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Yo te itilize antikò segondè sa yo: bourik Dylight 594-konjige anti-kabrit IgG (Jackson, 1:500), kabrit Alexa Fluor 488/594-konjige anti-lapen IgG (Termo Fisher, A-11034, A. -11037, 1:500), kabrit Alexa Fluor 488/594–konjige anti-sourit IgG (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500), ak kabrit Alexa Fluor 488-konjige anti-rat IgG (Termo Fisher, A-11006,

1:400). Yo te verifye espesifikasyon obligatwa nan anti-YAP (Siyal selilè, #4912) ak anti-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) yo te itilize nan etid la pa travay anvan46,53. Tach ematoksilin ak eozin (H&E). Glisad vè ak seksyon ren yo te mete sou yon plak 55 degre pou 30 min detire parafn an. Apre sa, echantiyon yo te benyen nan xylene pou 15 minit de fwa, ki te swiv pa imèsyon nan yon seri etanòl 70-100 pousan: 100 pousan etanòl pou 5 min de fwa, 90 pousan etanòl pou 5 min, 80 pousan etanòl pou 5 min, ak 70 pousan. etanòl pou 5 min. Apre rense nan dlo pou 20 min ak nan H2O distile/deyonize (ddH2O) pou 1 min, echantiyon yo te tache nan solisyon ematoksilin Mayer a (Wako) pou 5 min. Echantiyon yo te tranpe nan ddH2O de fwa, apresa rense ak ddH2O pou 10 min. Echantiyon yo te tranpe l ankò nan ddH2O epi yo tache nan solisyon eozin (Merck) pou 2 min. Pou lave, echantiyon yo te benyen nan ddH2O pou 30 s, ki te swiv pa imèsyon nan seri 70-100 pousan etanòl ak xylene: 70 pousan etanòl pou 5 s, 80 pousan etanòl pou 5 s, 90 pousan etanòl pou 5 s, 100 pousan etanòl. pou 5 s de fwa, ak xylene pou 10 min. Finalman, echantiyon yo te sele nan gliserin. Mikwoskopi. Imaj yo te akeri ak BZ-X710 All-in-one Fluorescence Microscope (Keyence) oswa LSM880 lazè optik mikwoskòp konfokal (Zeiss). Pou BZ-X710, lantiy objektif yo te itilize yo se Nikon CFI Plan Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × ak Nikon CFI Plan Fluor 4 × . Imaj yo jwenn yo te trete ak lojisyèl BZ-X Analyzer. Te LSM880 te ekipe ak yon Axio Observer Z1 mikwoskòp envèse ak yon Plan-Apochromat 63 × /1.40 NA lwil oliv imèsyon objektif lantiy (Zeiss). Imaj yo te trete ak analize lè l sèvi avèk ImageJ ak Adobe Photoshop CC2019. Analiz endèks sistik. ImageJ te analize endèks sistik lè l sèvi avèk imaj H&E-tache nan seksyon orizontal ren an. Kòm yon mezi nan zòn ki gen sist la, yo te trase perimèt lumèn nan tubulaires dilate lè l sèvi avèk fonksyon "Freehand seleksyon" yo, ak zòn li yo te mezire pa fonksyon "Mezi". Travay sa a te fèt pou tout spor ki nan seksyon ren an, epi zòn tout spor yo te ajoute ansanm pou detèmine zòn ki genyen kis la. Yo te mezire zòn ren total nan menm fason an. Yo te trase sikonferans ekstèn ren an ak fonksyon "Freehand selections", epi yo te evalye zòn li yo. Finalman, nou kalkile endèks sistik la lè nou divize zòn ki gen sis la pa zòn ren total la.

Definisyon tubul dilate ak tubul ki pa dilate. Nan rechèch sa a, tibil ki gen yon zòn lumèn ki pi gran pase oswa egal a 500 µm2 yo te defini kòm "dilate", tandiske sa yo ki gen yon zòn lumèn nan<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Mikwoskopi elektwonik. Pou mikwoskòp elèktron, yo te egzamine sourit gason P21. Echantiyon pou analize mikwoskopi elektwonik yo te prepare dapre Takahashi-Iwanaga54 ak sèten modifikasyon, jan sa a. Sourit yo te anestezi ak izofurane ak perfused ak 2 pousan (w/vol) fòmaldeyid ak 2.5 pousan (vol/vol) glutaraldehyde nan 0.1 M kakodilat tanpon, pH 7.4. Chak ren yo te retire epi koupe an kib ki te benyen nan menm fksatif lannwit lan, epi apre sa rense ak 0.1 M kakodilat tanpon. Echantiyon fiks yo te transfere atravè yon solisyon akeuz 30 pousan dimethyl sulfoxide nan 60 pousan dimethyl sulfoxide, epi answit kraze nan likid N2. Yo te rense echantiyon ki kase yo ak 0.1 M tanpon kakodilat epi yo te mete yo nan 6 N NaOH pou 1{{3{0}}-20 min nan 60 degre. Apre maserasyon nan solisyon NaOH a, yo te rense chak echantiyon ak 0.1 M kakodilat tanpon ki gen 0.05 pousan Tween 20 ak postfxed ak 1 pousan OsO4 nan 0.1 M kakodilat tanpon sou glas pou 2 èdtan. Echantiyon postfxed yo te: (1) rense ak ddH2O epi mete yo nan 1 pousan akeuz thiocarbohydrazide pou 20 min nan tanperati chanm, epi (2) rense ak ddH2O epi postfxed ankò nan 1 pousan OsO4 nan tanpon kakodilat 0.1 M pou 1 èdtan nan tanperati chanm. . Apre yo fin repete etap (1) ak (2), echantiyon yo te rense ak ddH2O, epi tache ak 0.5 pousan solisyon acetate uranil lannwit lan nan tanperati chanm. Blòk tisi yo te rense ak ddH2O epi dezidrate atravè yon seri etanòl gradye, yo te transfere nan acetate isopentyl, epi yo te seche pwen kritik lè l sèvi avèk CO2 likid. Yo te kouvwi evaporasyon yo ak osmyòm e yo te egzamine espesimèn sèk yo ak yon mikwoskòp elektwonik JSM-5600LV nan yon vòltaj akselere 10 kV. Imaj yo te trete ak Adobe Photoshop.

Pou mikwoskopi elektwonik transmisyon, yo te fxed kib nan ren diseke pou omwen 2 èdtan nan 2 pousan (w/vol) fòmaldeyid ak 2.5 pousan (vol/vol) glutaraldehyde nan 0.1 M kakodilat tanpon nan tanperati chanm. Yo te lave echantiyon yo avèk 0.1 M tanpon kakodilat ak postfxed ak 1 pousan OsO4 nan {{1{0}}.1 M tanpon kakodilat sou glas pou 2 èdtan. Lè sa a, echantiyon yo te lave ak ddH2O ak tache lannwit lan ak 0.5 pousan acetate uranyl akeuz nan tanperati chanm. Te echantiyon tache yo dezidrate ak yon seri gradye nan etanòl, transfere nan oksid pwopilèn, epi entegre nan Polybed 812 (Polysciences). Seksyon ultramens yo te koupe ak yon kouto dyaman, doub-tache ak acetate uranyl ak sitrat plon, epi yo obsève nan 100 kV akselere vòltaj lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elèktron transmisyon (JEM-1010; JEOL) ekipe ak yon kamera aparèy chaj makonnen ( BioScan modèl 792; Gatan). Imaj yo te trete ak Adobe Photoshop.

Tès pipi ak tès san. Pou konparezon ak sourit Camsap3dc/dc, yo te itilize sourit WT (plis / plis) ak eterozigot (plis /dc) kòm kontwòl nan tès sa yo. Sourit eterozigot pa montre okenn siy Camsap3malfonksyònman 10epi yo te òganize etalaj apico-bazal nan mikrotubul. Sourit yo te gen 56-60 semèn.

Sourit yo te loje nan yon kaj metabolik (TECNIPLAST). Yo te kolekte echantiyon pipi chak jou pandan senk jou youn apre lòt, epi echantiyon yo te kolekte yo te estoke nan -80 degre. Finalman, tout senk echantiyon pou chak sourit yo te melanje pou melanj final la te reflete kondisyon mwayèn chak sourit pandan peryòd sa a.

Pou koleksyon san, sourit yo te administre {{0}}.02 mL anestezi pou chak gram pwa kò. Konpozisyon anestezi a te Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolam (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL, ak 0.9 pousan akeuz NaCl a 1 mL. Yo te kolekte san pa pike kadyak. Pou evite emoliz, yo te mete sereng la dousman epi rale soti. Chak echantiyon san yo te kenbe nan tanperati chanm pou 1 èdtan pou koagulasyon. Lè sa a, yo te santrifize chak echantiyon (10,000×g, 25 degre, 15 min), epi yo te kolekte serom epi estoke nan -80 degre. Tout echantiyon pipi ak san yo te analize pa Oriental Yeast Co.