Dekouvèt ak idantifikasyon potansyèl konstitiyan aktif anti-melanogenic nan Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 ak Hongjiang Chen1,2*

Résumé

Background:Bletilla striata se medikaman prensipal la nan anpil po blanchi fòmil klasik nan tradisyonèl Chinesemedicine (TCM) epi li se lajman ki itilize nan endistri kosmetik dènyèman. Sepandan, engredyan aktif li yo toujou klè ak rasin fib li yo pa itilize efektivman. Objektif etid la se dekouvri ak idantifye konstitiyan potansyèl anti-melanogenic li yo pa modèl zebrafish ak debakadè molekilè.

Metòd:Laantioksidanaktivite yo te evalye pa 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikal scavengingactivity, 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS ) aktivite scavenging radikal ak ferrik diminyeantioksidanesè pouvwa (FRAP). Aktivite anti-melanogenic la te evalye patirozinazinhibiteuraktivitean vitro ak melanin inhibitor nan pwason zèb. Pwofil chimik yo te fèt pa chromatografi likid ultra-wo-pèfòmans konbine avèk espektrometri mas tandem quadrupole tan-of-vol (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Pandan se tan, potansyèl konstitiyan aktif anti-melanogenic yo te idantifye tanporèman pa debakadè molekilè.

Rezilta:Ekstrè etanòl 95 pousan nan rasin fibrou B. striata (EFB) te genyen pi fò DPPH, ABTS, FRAP andtyrosinase aktivite inhibition, ak IC50 5.94 mg/L, 11.69 mg/L, 6.92 mmol FeSO4/g, ak 58.92 mg / L, respektivman. Anplis de sa, EFB ak ekstrè etanòl 95 pousan nan B. striata tuber (ETB) siyifikativman redwi sentèz melanin nan anbriyon zebrafish nan yon fason ki depann de dòz la. 39 konpozisyon chimik, ki gen ladan 24 stilbenoid yo te idantifye pwovizwaman nan EFB ak ETB. Docking molekilè te endike ke te gen 83 (ki gen ladan 60 stilbenoid) ak 85 (ki gen ladan 70stilbenoid) konpoze ekspoze pi fò afinite obligatwa nan direksyon tirozinaz ak adenylat siklaz.

Konklizyon:Konklizyon prezan yo sipòte rezon pou itilize EFB ak ETB kòm ajan natirèl pou blanchi po nan endistri pharmaceutique ak kosmetik.

Mo kle: Bletilla striata, Antioksidan, Aktivite anti-melanogenic, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafish, Docking molekilè

Klike sou efè segondè cistanche ak benefis pou antioksidan

Background

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. se yon plant kontinuèl èrbeuz ki lajman distribiye nan pwovens Lazi, tankou Lachin, Kore di, ak Japon [1]. Tubèrkul cheche nan B. striata, tou konnen kòm Baiji, premyèman anrejistre nan klasik Shennong nan Materia Medica, te lajman itilize kòm yon medikaman tradisyonèl Chinwa (TCM) pou dè milye ane nan Lachin. Farmakope Chinwa yo di ke li posede kapasite nan astringence sou emostaz ak analgesis, Se poutèt sa, li te lajman itilize pou tretman an ematemesis, hemoptysis, senyen twomatik, maladi ilsè, anfle ak po kraponnen [2, 3]. Etid farmakolojik te demontre ke B. striata te genyen yon pakèt aktivite byolojik, tankou gerizon blesi [4, 5], antiilsè [6, 7], emostatik [8],anti-enflamasyon[9], antioksidan[10], anti-bakteri [11], anti-grip viral [12], ak antiaging [13]. An menm tan an, B. striata gen plizyè klas konpozisyon chimik, ki gen ladanpolisakarid[14], bibenzyls, phenantrenes, anthraquinones,flavonoid, ak 2-isobutilmalat [3, 15], elatriye.

B. striata se medikaman prensipal la nan anpil po whiteningclassic fòmil nan TCM [16] epi li se lajman ki itilize nan endistri kosmetik dènyèman [17]. Sepandan, engredyan aktif li yo toujou klè e menm kèk rezilta rechèch yo te kontrè. Pou egzanp, rezilta rechèch yo bay Chenet al. endike ke ekstrè etanòl 95 pousan nan B. striata posede pi wo aktivite inhibitor tirosinaz pase sa yo ekstrè dlo ofits ak pousantaj anpèchman nan 68.36 pousan nan vitro [18], pandan y ap rezilta a nan Huang et al. te montre ke aktivite inhibition nan B. striata dlo ekstrè sou tirosinaz te pi fò pase sa yo ki nan 95 pousan etanòl ekstrè nan pousantaj 62 pousan nan vitro [19]. Rezilta rechèch yo pa Luetal.[20] ak Linghuetal.[21] te demontre ke tou de dlo ak 95 pousan etanòl ekstrè nan B. striata, espesyalman fraksyon klowofò li yo, te kapab anpeche kwasans selil B16 ak pwovoke apoptoz li yo nan yon fason konsantrasyon depann.

Kòm tès yo in vitro nan anpèchman tirozinaz ak liy selil melanom yo, pa t 'enplike kondisyon yo fizyolojik konplèks nan vivo, ak absòpsyon, metabolis, distribisyon ak eskresyon echantiyon tès la, anpil nan echantiyon yo te montre siyifikatif aktivite inhibition kont tirosinaz ak liy selil melanom nan. vitro, sepandan, te montre fèb efikas oswa menm inefikas nan vivo [22,23]. Glabridin la te montre siyifikatif aktivite inhibitor tirosinaz ak IC 50 0.43μmol / L, ki te 176 fwa pi fò pase sa yo ki nan asid kojik. Men, li te efè noinhibitory sou pigmantasyon nan pwason zèb nan vivo [24].

Pandan se tan, rasin fibrou B. striata (FB) yo te byproducts yo te pwodwi pandan pwosesis la nan B. striatatuber (TB). Rechèch modèn yo endike ke FB a gen konpoze ki sanble ak TB ak pi wo kontni fenolik [25]. Anplis de sa, aktivite anti-bakteri [26], antioksidan ak anti-tirozinaz ekstrè FB yo te pi fò pase ekstrè TB [25]. Sepandan, resous FB yo pa te itilize efikasman epi yo te abandone nan tè agrikòl la, sa ki te mennen nan fatra nan resous FB ak polisyon anviwònman an [27].

Pwason zèb (Danio rerio), yon ti pwason dlo dous twopikal, se yon modèl bèt émergentes pou famasi.

ak rechèch toksikoloji nan vivo, ak anpil avantaj ki gen ladan pri ki ba, sik lavi kout, gwo transparans, fasil pou kenbe, fètilite segondè, epi yo mande mwens echantiyon tès [28, 29]. Anplis de sa, zebrafish gen pigman melanin sou sifas la, sa ki pèmèt obsèvasyon senp nan pwosesis pigmantasyon, e li te lajman itilize nan etid la anti-melanogenic [28, 30].

Nan etid la prezan, nou konpare aktivite antioksidan ak tirozinaz inhibitor nan polysaccha-ride bit ak 95 pousan ekstrè etanòl nan TB ak FB nan vitro, ak aktivite anti-melanogenic nan modèl zebrafish. Pandan ke, potansyèl anti-melanogenic aktif constituents yo te idantifye tanporè pa debakadè molekilè. Nou te dekouvri ke 95 pousan ekstrè etanòl nan TB (ETB) ak FB (EFB) posede siyifikativman antioksidan ak aktivite anti-tirozinaz, epi li ka diminye sentèz melanin nan anbriyon zebrafish nan yon fason ki depann de dòz la. Kidonk, ETB ak EFB ka itilize kòm ajan blanchi natirèl po nan endistri pharmaceutique ak kosmetik.

Metòd

Pwodwi chimik ak reyaktif

Tirozinaz, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine (L-DOPA) ak arbutin te achte nan men konpayi reyaktif Aladdin (Shanghai, Lachin).2, 2-diphenyl{{8 }}picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-ethylbenthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 6-idwoksi-2,5,7 ,8-tetramethylchroman-2-asid karboksilik (Trolox), ak 2,4,6-tris ({2-piridil)-s-triazine (TPTZ) yo te achte nan men Sigma-Aldrich (Sent Louis, MO, USA). Acetonitrile ak metanol (klas HPLC) yo te achte nan men Tedia (Fairfield, OH, USA). Dlo deyonize te prepare pa sistèm dlo Milli-Q (18.2 MΩ, Millipore, USA).

Koleksyon plant ak pwosedi ekstraksyon

B. striata te kolekte nan Quzhou YiNianTang Agrikilti ak forè Teknoloji co, Ltd (Quzhou,Zhejiang, Lachin). Yo te depoze espesimèn bon nan Herbarium nan Kolèj famasetik Zhejiang (Adezyon nimewo 190615). Tout plant la te divize an tubèrkul ak rasin fib. Imedyatman, yo te koupe an ti moso epi seche pa vakyòm friz-seche, respektivman.

Echantiyon yo sèk ak an poud (TB ak FB) yo te ekstrè ak 95 pousan etanòl pou twa fwa (1.5h pou chak fwa). Ekstrè a te filtre lè l sèvi avèk yon papye filtre What man (No.1). Filtrate a te konsantre sou sechrès nan yon evaporateur rotary (Hei-VAP, Heidolph, Almay) nan 50 degre epi yo te imedyatman seche pa yon seche vacuumfreeze. Ekstraksyon etanòl nan pwodiksyon TB (ETB) ak FB (EFB) yo te 5.21 ak 6.53 pousan, respektivman. Yo te itilize dreg pou ekstrè polisakarid brit la lè yo te gaye nan dlo 80 degre pou 4 èdtan ak presipitasyon ak etanòl [31]. Pwodiksyon polisakarid TB (PTB) ak FB (PFB) te 14.75 ak 6.45 pousan, respektivman.

extrait cistanche

Analiz chimik

Analiz chimik la te fèt sou yon chromatografi likid ultra-wo-pèfòmans konbine avèk espektrometri mas tandem tan-de-vol (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Separasyon kwomatografik la te fèt sou yon Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, US) ak yon kolòn WatersBEH Shield RP C18 (100×2.1mm, 1.7μm) at3{ {43}} degre. Faz mobil lan te fèt nan 0.1 pousan formicacid nan dlo (A) ak asetonitrile (B), ak yon gradyan lineyè: 0-3min, 5-16 pousan B; 3–8min, 16–30 pousan B; 8–10min,30–35 pousan B; 10–15min, 35–55 pousan B; 15–18min, 55–80 pousan B;18–19 min, 80–5 pousan B; 19-20 min, 5 pousan B. Pousantaj koule a te 0.3 mL / min, ak volim nan piki te 2 μL.

Eksperyans TOF-MS/MS yo te fèt lè l sèvi avèk yon spèktrometri mas AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) ekipe ak ionizasyon anelektrospray (ESI). Deteksyon MS la te fèt nan metòd ionizasyon negatif. Paramèt yo te fikse jan sa a: sous ak tanperati desolvasyon se 100 degre ak 450 degre respektivman; desolvasyon gaz koule te 900L / h; vòltaj kapilè te 2kV; vòltaj kòn te 40 V; enèji kolizyon te 22 eV; ak scanspectra konplè a te soti nan 100 a 2000 Da.

Antioksidan tès DPPH radikal aktivite scavenging

Aktivite radikal DPPH la te detèmine dapre Ali et al. ak yon ti kras modifikasyon [32]. Yon ti tan, yo te melanje 50 μL solisyon echantiyon tès ak 150 μLDPPH solisyon etanòl (0.2mM) nan 96-byen plak epi yo te kenbe nan fè nwa a pou 30min. . Absorbans melanj lan nan 517nm (A1) te evalye pa espektrofotomèt mikroplak (Thermo Fisher Scientific, Amerik). Solisyon an vid san echantiyon tès melanje ak solisyon DPPHetanol te mete kòm gwoup la pozitif (A0). Solisyon an vid san DPPH melanje ak solisyon echantiyon tès yo te mete kòm gwoup la vid (A2). Tout eksperyans yo te egzekite an triple. Yo te kalkile pousantaj DPPH radikal ak fòmil sa a:

Pousantaj DPPH pou netwaye radikal (pousan) {{0}} [A0-(A{1-A2)]/A0 × 100 pousan.

ABTS radikal aktivite scavenging

Kapasite radikal ABTS la te mezire ak metòd Ali et al. [32]. Yon ti tan, 7mMABST solisyon akeuz te melanje ak 2.45mM persulfate potasyòm nan yon rapò 1: 1 (v / v), ak enkubasyon tanperati atroom nan fè nwa a pou 16 èdtan jwenn solisyon an ABST plis stock. Solisyon stock la te dilye ak saline tampon fosfat (PBS) pou ajiste absorbans (0.72±0.2) nan 734nm. 20μL echantiyon tès nan diferan konsantrasyon yo te melanje byen ak 180μL ABTS plis solisyon. Melanj reyaktif yo te kenbe nan fè nwa a pou 5min epi imedyatman mezire absorbans (B1) nan 734nm. Absorbans melanj yo san echantiyon tès ak ABST plis yo te mete kòm B ak B, respektivman. Tout eksperyans yo te egzekite an triple. Yo te kalkile pousantaj radicalscavenging ABTS dapre fòmil sa a:

Pousantaj scavenging radikal ABTS (pousan) {{0}} [B0-(B{1-B2)]/B0 × 100 pousan.

Ferrik diminye tès pouvwa antioksidan (FRAP)

Kosakowska et al te detèmine aktivite ferrik fè a dapre pwosedi yo. [33]. 300mM tanpon acetate, 10mM TPTZ (2,4,6-tris ({2-pyridyl)-s-triazine) ak 20mM FeCl3 yo te melanje nan yon (v/v/v) rapò nan 10:1:1 toprepared reyaktif la k ap travay. Yo te melanje 100μL nan chak echantiyon tès solisyon ak 100μL TPTZ k ap travay reyaktif, enkube nan 37 degre pou 20 min ak absorpsyon an te detèmine nan 593 nm. Pandan se tan, yo te itilize yon seri solisyon estanda FeSO4 nan seri konsantrasyon 0-1000ug/mL pou prepare koub kalibrasyon an. Kapasite rediksyon ferrik la te kalkile nan fòmasyon an nan yon konplèks Fe2 entans plis -TPTZ ble. Rezilta yo te eksprime kòm Fe2 plis kapasite antioksidan (mmol FeSO4 / g nan ekstrè).

Tirozinaz aktivite inhibition

Aktivite inhibitor tirozinaz yo te detèmine pa metòd espektrofotometrik lè l sèvi avèk L-DOPA kòm substra [34]. Yon ti tan, 50μL solisyon echantiyon nan diferan konsantrasyon yo te melanje ak 50 μL tirozinaz (200 inite / mL, disolisyon nan pH 6.8 tanpon fosfat) nan 96-byen. plak yo epi yo enkube pou 15 minit nan 25 degre. Lè sa a, reyaksyon an te kòmanse ak adisyon L-DOPA (50 μL). Apre enkubasyon 30 minit nan 25 degre, yo te detèmine absorbans nan 490 nm (Aa) lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt mikwoplak syèl multiskan (ThermoFisher Scientific, Amerik). Menm jan an tou, yo te detekte absorbans nan pwi echantiyon san tirozinaz (Ab) ak byen kontwòl ak anzim men san echantiyon (Ab) an menm tan. Aktivite inhibitor tirozinaz la te kalkile pa ekwasyon an jan pi ba a:

Pousantaj inhibitor tirozinaz (pousan)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 pousan.

IC50 te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon GraphPad Prism la jan pi ba a:

Y=min plis (max − min)/1 plis 10(x−logIC50)×Hill slope

X reprezante konsantrasyon inibitè a; Y reprezante done anpèchman (pousan) ansanm ak valè minimòm (min) ak maksimòm (max) yo; Hill slope se slopefactor la.

Cistanche inibit aktivite tirozinaz.

Melanin inhibitor nan pwason zèb

Sovaj-tip AB liy zebrafish (ki founi pa Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, pwovens Zhejiang) yo te loje nan dlo pwason (0.2 pousan enstantane sèl oseyan nan dlo deyonize, pH 6.9-7.2, konduktiviti 48{). {18}}–510 mS/cm, ak dite 53.7-71.6mg/L CaCO3) nan yon fotoperyòd limyè/nwa 14/10h nan yon tanperati konstan 28±0.5 degre, epi nouri kribich Eau de fwa pa jou. Anbriyon zèb zèb yo te jwenn nan frai natirèl epi yo te kolekte nan 30min. Asosyasyon pou Evalyasyon ak Akreditasyon nan Swen Animal Laboratwa (AAALAC) te akredite tès zèb zèb la. Etid aktyèl la te apwouve pa IACUC (Enstitisyonal Animal Careand Use Committee) nan Hunter Biotechnology, Inc. ak nimewo apwobasyon IACUC la te 001458.

Anbriyon nan etap 6h apre fètilizasyon (hpf) yo te trete chak ekstrè nan sis konsantrasyon (10, 30, 62.5,125, 250 ak 500 mg/L) pou 72 èdtan pou evalye maksimòm konsantrasyon ki pa letal (MNLC). ). Kòm yon rezilta, MNLC yo nan tout ekstrè yo te plis pase 62.50mg/L.10 anbriyon yo te mete nan 6-byen epi yo te ekspoze echantiyon total nan konsantrasyon nan 10 ak 30 mg/L soti nan 6 hpf a 54 hpf (48h ekspoze). ). DMSO (0.05 pousan, v/v) andarbutin (10 ak 30mg/L) yo te itilize kòm kontwòl nòmal ak pozitif, respektivman.

Anbriyon senkronize yo te kolekte epi obsève nan yon stereomikwoskòp (SZX7, Olympus, Japon) ekipe ak yon kamera dijital (VertA1, Lachin). Melanin akimilasyon, ki gen rapò dirèkteman ak zòn zebrafishpigmentation yo, te kalkile lè l sèvi avèk GNUImage Manipilasyon Pwogram (GIMP vèsyon 2.10.2) ak eksprime kòm pousantaj ki gen rapò ak kontwòl negatif la (akimilasyon melanin 100 pousan) [28, 30].

Etid debakadè molekilè

158 konpoze izole nan B. striata nan literati a [2], ki gen ladan 19 glikozid, 28 bibenzyls, 19 phenan-threnes, 18 biphenanthrenes, 23 dihydrophenanthrenes, 5 anthocyanins, 11 estewoyid, 8 triterpenoids, 5-nolic asid, 12 estewoyid. ak 10 lòt konpoze, yo te itilize kòm ligand yo. Estrikti 3D yo te trase pa ChemBio3D epi yo te optimize lè l sèvi avèk MM2 ak Autodock Tools. Estrikti kristal 3D tirosinaz (PDBID:5M8N) ak adenylate cyclase (PDB ID:5IV3) te jwenn nan RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Tout molekil dlo ak etero atòm yo te retire nan estrikti kristal yo lè l sèvi avèk Chimera ak MGL Tools. Finalman, Autodock

Vina yo te itilize pou waf pwoteyin reseptè a ak ti ligand molekil. Paramèt reseptè pro-tein debakadè sit la te fikse kòm -36.700, 7.034, -19.104, ak -17.467, - 22.807, 2.786, respektivman, dapre orijinal ligand mimosin ak LRE1 [35]. Pou reyalize pi gwo presizyon enfòmatik, yo te pwodwi 20 paramèt exhaustiveness pou chak reseptè, epi yo te chwazi konfòmasyon ki gen pi gwo afinite kòm konfòmasyon final la ak vizyalize nan Pymol2.3. Pandan se tan, ligan orijinal mimosin ak LRE1 yo te pran kòm kontwòl pozitif [36].

In silico ADMET prediksyon

Top 3 frape yo soti nan B. striata posede pi bon afinite obligatwa ak tyrosinase ak adenylate cyclase, yo te sibi analiz ADMET. QikProp nan Schrodingersuite te itilize pou kalkile pwopriyete fizik yo ak karakteristik ki gen rapò ak dwòg, ki gen ladan pwa molekilè (MW), prevwa oktanol / koyefisyan patisyon dlo (QPlogPo/w), prevwa solubilite akeuz (QPlogS), prevwa selil Caco-2 aparan. pèmeyabilite pou baryè zantray-san (QPPCaco), prevwa sèvo/san koyefisyan (QPlogBB), prevwa pèmeyabilite po (QPlogKp), prevwa IC50 pou bloke HERGK plis chanèl (QPlog HERG) ak prevwa absòpsyon oral imen. Pwopriyete yo te evalye baze sou règ senk Lipin-ski a ak literati [37, 38].

Simulation dinamik molekilè

Yo nan lòd yo egzaminen estabilite ak fluctuations dinamik nan konplèks la ligand-pwoteyin anba yon anviwònman simulatedbiological, ak plis valide rezilta yo debakadè, konpoze yo blestrin D (75) yo te chwazi kòm ligand pou etid la simulation dinamik molekilè (MD), ki baze sou la. rezilta docking molekilè. Konplèks la nan blestrin D ak tirosinaz ak adenylate cyclase te fè simulation MD epi kouri pou 100ns, lè l sèvi avèk mòd dlo TIP3P. Valè devyasyon kare mwayen rasin (RMSD) nan atòm zo rèl do pwoteyin yo te konpare ak estrikti inisyal la yo te kalkile pou egzamine estabilite nan pwoteyin pandan peryòd simulation [39].

Rezilta yo

Konpozisyon chimik

Yo te montre chromatogram baz tipik nan ETB ak EFB nan Fig. 1. Yo te itilize lojisyèl PeakView pou idantifye elektè yo. Fòmil molekilè a te byen plase nan erè mas 10ppm. Pwa molekilè egzak la ak fragmentasyon yo te itilize pou idantifye eleman yo dapre literati yo ak baz done estrikti chimik gratis, tankou ChemSpider ak Massbank. Kòm yon rezilta, 39 konpozisyon chimik, ki gen ladan 24 stilbenoids (bibenzyls, phenantrenes ak dérivés yo), 6 glikozid, 4phenolic asid, 3 kinon, 1 esteroyid, ak 1 lòt konpoze yo te tantativman idantifye nan EFB ak ETB. An menm tan, yo te fè semi-quantifikasyon relatif yo nan mezire zòn pik nan chak konpoze nan mòd nan MS lè l sèvi avèk chromatogram yo extrait ion [40]. konsantrasyon) yo te rezime nan Tablo 1.

Kapasite antioksidan

Li se byen li te ye ke iltravyolèt A (UVA)-iradyasyon ka pwovoke espès oksijèn reyaktif (ROS) pwodiksyon ak medyatè twòp melanogenesis nan selil po. , 42]. Kidonk, nan etid prezan an, yo te evalye kapasite antioksidan atravè DPPH, aktivite radikal ABTS ak FRAPassay. Rezilta yo (Tablo 2 ak Fig. 2) te montre ke EFB a (IC50=5.94mg/L) posede aktivite DPPHradical scavenging ki pi fò nan vitro konpare ak PTB (IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L), ak ETB(IC{50=65.25mg/L). Yo te obsève yon tandans menm jan an nan tès ABTS ak FRAP. Ekstrè etanòl 95 pousan nan TB ak PB te gen pi fò aktivite antioksidasyon an vitro pase polisakarid brit yo. Anplis de sa, EFB te montre aktivite antioksidasyon pi fò pase ETB, ki te konsistan avèk rezilta rechèch anvan yo [25].

Tirozinaz aktivite inhibition

Tirozinaz se anzim kle ki limite pousantaj nan chemen melaninbiosentèz e li te lajman itilize pou idantifye potansyèl pwodwi natirèl ak efè anti-melanogenesis [43]. Rezilta yo (Fig. 3) te montre ke ETB ak EPB te gen pi fò aktivite inhibition tirozinaz pase PTB ak PPB nan vitro, ki te konsistan avèk rezilta rechèch anvan [25]. EFB te montre pi fò aktivite tirosinaseinhibition nan yon fason ki depann de dòz (ant 20 ak 200mg/L) ak IC50=58.92mg/L pase ETB(IC{{50=75.44mg/L) ak konpoze pozitif arbutin (IC{). {11}}.02 mg/L).

Melanin inhibitor nan pwason zèb

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), ki endike ke machin 0.05 pousan DMSO pa t afekte pwodiksyon melanin nan anbriyon pwason zèb. Sepandan, apre yo fin ekspoze a echantiyon yo teste ak arbutin pou 48h, anbriyon pwason zèb te montre divès degre depo melanin (figi 3B, 4), eksepte gwoup PFB 10 mg/L. Li evidan ke sa ki genyen melanin nan ETB 10mg/L (78.38 pousan) ak 30 mg/L (64.72 pousan) gwoup yo te siyifikatif pi ba pase sa ki nan PTB 10mg/L (93.06 pousan) ak 30mg/L (82.02 pousan) gwoup (p).<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Docking molekilè

Tirozinaz se anzim ki limite pousantaj nan biosentèz melanin: idwoksilasyon tirozin a 3, 4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA), ak oksidasyon DOPA todopaquinone. Se poutèt sa, tirosinaz te konsidere kòm yon sib kritik pou devlopman inibitè melanogenesis [44]. Anplis de sa, adenylatecyclase se anzim kle nan melanogenesis cAMP-induit. Liaison melanotropin alpha polypeptide (-MSH) ak reseptè MC1R pwovoke deklanchman adenilat cyclase, ogmantasyon nan nivo cAMP, ekspresyon tyrosinase jèn yo kontwole, epi apre sa ogmante sentèz melanin [45]. Se poutèt sa, nou te fè yon etid molekilè debakadè nan 158 konpoze yo izole nan B. striata deja [2], withtyrosinase ak adenylate cyclase. Enèji obligatwa ligand yo etidye ak tirozinaz ak adenylatecyclase yo te rezime nan Tablo S1. Te gen 83 (ki gen ladan 60 stilbenoid) ak 85 (ki gen ladan 70 stilbenoid) konpoze ki te montre pi fò afinite lyezon anvè tirozinaz ak adenilat siklaz, konpare ak sa ki nan ligand orijinal mimozin yo (-6.4 kcal/mol) ak LRE1 (- 8.5 kcal/mol) /mol). 1,8-bis(p-idroksibenzil)-4-metoksifenantrèn-2,7-diol (56), blenstrin D (75), ak 2,7-dihydroxy -1,6-bis(p-hydroxybenzyl)-4-met-oxy-9,10-dihydrophenantrene (93) se te twa ligand ki pi wo yo nan direksyon tirozinaz, ak enèji lyezon. -10.2,10.0, ak 9.7kcal/mol, respektivman. Pandan ke blestrin D(75), blestrin B (73), ak 3,3′-dihydroxy-5-methoxy{-2,5′,6-tris(p-hydroxybenzyl) bibenzyl (42) yo te topthree ligands yo nan direksyon adenylate cyclase, ak bindingenergy - 12.1, - 11.9, ak - 11.6 kcal / mol, respektivman.Afinite teyorik obligatwa yo ak entèraksyon ligand-aminoasid yo te rezime nan Tablo 3.

Li te vo anyen ke blestrin D (75), yon konpoze biphenantrene, te antre nan pòch la obligatwa oftyrosinase ak adenylate cyclase (figi 5), ak exhibitedsignificant obligatwa afinite nan direksyon tou de tyrosinase andadenylate cyclase. Entèaksyon Van der Walls yo kontribye nan valè entèraksyon enèji jeneral, pandan se tan gwoup hydroxyl pwodui lyezon idwojèn ak résidus aminoasid Glu 451, Arg114 nan tirozinaz, ak Val 167of adenylate cyclase, respektivman (Tablo 3 ak Fig. S1). nan direksyon tirozinaz atravè fòmasyon 6 lye idwojèn ak rezidi asid amine Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223, ak Gln236.

In silico ADMET prediksyon

Valè yo prevwa plizyè paramèt enpòtan ansanm ak seri akseptab yo te rezime nan Tablo 4. Apa de QPlogS de 3,3′,5-trimethoxybibenzyl, blestrin B ak blestrin D, ak QPlogBBof 3,3′,{{6} }trimethoxybibenzyl, tout lòt pwopriyete kalkile ADMET twa pi gwo frape yo te nan limit espere yo, pandan se tan, QPlog HERG nan tout twa premye frape yo te mwens pase -5, sa ki endike yo te potansyèl dwòg pou itilizasyon imen. QPlog Kp nan tout twa pi gwo hits pou tou de tirozinaz ak adenylatecyclase, eksepte 3,3′,5-trimethoxybibenzyl, te nan ranje favorab, ki endike konpoze sa yo ka fasil antre nan po.

Simulation dinamik molekilè

Konplo RMSD la te montre ke valè RMSD nan konplèks pwoteyin-ligand yo pa t varye siyifikativman pandan tout peryòd simulation la. Valè RMSD yo (figi 6A) nan blestrin D ak tyrosinase ak konplèks ade-nylate cyclase yo te detèmine sòti nan 1.5 a 2.8Å, ak soti nan 2.0 a 3.6Å, respektivman. Valè TheRMSF ki reflete fleksibilite chak simulation rezidueduring. Résidus yo ak pi wo RMSFvalues ​​revele yo te pi fleksib (figi 6B). Yo te jwenn valè RMSF nan résidus asid amine yo nan rejyon bouk yo trè varye. Pandan ke, rezidi aktif yo te kenbe yon ti valè RMSF (mwens pase 1. 0Å), tankou Arg114, Val167, Tyr226, Leu229, ak Arg230in tirozinaz, ak Val167, Leu102, Phe45, Lys95 ak Leu166ase nan adeni. ki endike bindingpockets yo te kenbe estab. Entèaksyon molekilè blestrin D ak tirozinaz ak adenylat cyclase yo te montre nan Fig. 7.

Enèji lib obligatwa yo te kalkile pa metòd mekanik-jeneralize born surface area (MM-GBSA) [39]. Enèji lib obligatwa blestrin D la prevwa ak tirozinaz ak adenylatecyclase te -96.94kcal / mol ak -139.69kcal / mol, respektivman, sa ki vle di entèraksyon obligatwa yo te reponn (Tablo 5). Anplis de sa, kontribisyon yo favorize ligand ligand yo te entèraksyon solvation nonpolar, van der Waals ak entèraksyon electrostatic.

Li te vo anyen ke kalite yo ak sa ki nan eleman chimik yo nan EFB te pi plis pase sa ki nan ETB. Zòn pik yo nan tout konpoze yo idantifye nan EFB yo te apeprè de fwa nan sa ki nan ETB. Mili-tarine te konpoze ki pi abondan nan tou de EFB ak ETB, ki te genyen siyifikatif aktivite antioksidan, anti-enflamatwa ak neropwoteksyon, e li te chwazi kòm makè chimik pou kontwòl kalite B. striata nan edisyon Chinese Pharmacopeia2020 [46]. Zòn nan pik relatif nan militè inEFB (38.39 × 106) te yon ti kras pi wo pase sa yo ki nan ETB (30.48 × 106). Gastrodin se yon konpoze byen li te ye nan anpil medikaman Chinwa èrbal, tankou Gastrodia elata, ki montre siyifikatif tyrosinase inhibitor and radi-cal scavenging effects [30]. Zòn pik relatif gastrodin nan EFB (1.43 × 106) te yon ti kras pi ba pase sa ki nan ETB (2.17 × 106).

Ekstrè etanòl 95 pousan nan TB ak PB te gen aktivite antioksidasyon pi fò nan vitro pase polisak-karid brit yo. Anplis de sa, EFB montre aktivite antioksidasyon pi fò pase ETB, ki te konsistan avèk rezilta rechèch anvan yo [25]. Fenomèn sa a ka atribiye a ke EFB a gen pi wo nivo nan konpoze antioksidan, tankou militè ak stilbenoids (polifenol plant natirèl). Pa egzanp, zòn pik relatif 4,8,4′,8′-tetramethoxy-[1,1′-biphenantrene]-2,7,2′,7′-tetrol, yon biphenantrene ak kat idwoksil fenolik, te 9.15×106 nan FB, alòske li te 0.01×106 inTB.

Nan etid la prezan, PPB ak PTB te montre aktivite anpèchman tirozinaz nan yon fason ki depann de dòz la. Sepandan, li te demontre ke pa gen okenn aktivite detekte nan ekstrè akeuz PB (gen PPB) [25]. Fenomèn sa a ka akòz preparasyon echantiyon diferan. Ekstrè akeuz PB a te itilize pou evalye aktivite inhibitor tirosinaz nan eksperyans Jiang [25], pandan ke yo nan etid prezan an, ekstrè akeuz te presipitasyon ak etanòl pou jwenn polisakarid brit la.

Dènyèman, modèl la zebrafish lajman itilize nan evalyasyon efè anti-melanogenesis nan vivo [47, 48]. Arbu-tin, yon konpoze glikozid idrokinòn ki deja egziste plant divès kalite, ki te komèsyalman itilize nan endistri thecosmetic, te mete kòm kontwòl pozitif. Aktivite anti-melanogenesis nan ETB ak EFB te pi fò pase sa yo ki nan arbutin, ki endike ke ETB ak EFB ka aplike kòm ajan eklèsisman po nan endistri kosmetik.

Zòn pik relatif blestrin D nan EFB(1.91 × 106), se apeprè kat fwa sa ki nan ETB(0.46 × 1{0 ). Zòn pik relatif konpoze 56 (8.73 × 106) ak 93 (0.64 × 106) nan EFB tou enpòtan pi wo pase sa ki nan ETB (mwens pase 0.01 × 106 ak 0.10 × 106). Sa a ka youn nan rezon ki fè EFBexhibits pi fò efè anti-melanogenic pase ETB.Li enteresan sonje ke twa ligand tèt towardtyrosinase ak adenylate cyclase tout fè pati stilbenoids (bibenzyls, phenantrenes ak derive li yo). Stilbenoids yo se polifenol plant natirèl yo ki te atire gwo enterè nan dènye ane yo akòz byoaktivite remakab yo tankou aktivite anti-enflamatwa, antimikwòb ak antioksidan [49]. Resveratrol se stilbenoid ki pi komen. Rechèch anvan an te endike ke resveratrol ak dérivés li yo ka siyifikativman anpeche aktivite katalitik, ekspresyon jèn, ak modifikasyon post-tradiksyon nan tirosinaz. Kidonk, yo te montre potansyèlman itil kòm ajan po ak ajan anti-aje nan pwodui kosmetik [41, 50].

Cistanche te montre potansyèlman itil kòm eklere po ak ajan antiaging nan pwodui kosmetik.

Pou plis enfòmasyon, tanpri klike sou foto a.

Konklizyon

Nan etid sa a, yo te envestige sistematikman antioksidan ak anti-melanogenicaktivite polisakarid brit ki soti nan B. striatatuber (PTB) ak rasin fib (FPB), ak 95 pousan etanòl ekstrè B. striata tuber (ETB) ak rasin fib (EFB). . Rezilta yo te montre ke EFB te posede pi fò DPPH, ABTS radikal aktivite scavenging ak aktivite rediksyon fè fer. Anplis de sa, ETB ak EFB ka siyifikativman diminye aktivite tirosinaz nan vitro ak sentèz melanin nan anbriyon zebrafish nan yon fason ki depann de dòz la. Docking molekilè te endike ke te gen yon gwo kantite konpoze, sitou ki te fè pati stilbenoids, montre pi fò affinite obligatwa nan direksyon tirosinaz andadenylate cyclase, konpare ak afinite obligatwa nan ligand orijinal la. Konklizyon prezan yo sipòte rezon pou itilize ETB ak EFB kòm ajan natirèl blanchi po nan endistri pharmaceutique ak kosmetik.