Efè Ekstrè Cistanche Tubulosa sou fonksyon repwodiksyon gason nan rat dyabetik strèptozotosin-nikotinamid-induit-Ⅰ

1. Entwodiksyon

Dyabèt melitus (DM) se yon kondisyon nan ki gen ogmantenivo glikoznan san an akòz inefikasite nan pankreyas la nan pwodwi ase ensilin, oswa enkapasite nan kò a pou sèvi ak li efektivman. Dapre OMS la, kantite moun ki gen dyabèt te monte soti nan 108 milyon dola an 1980 pou rive nan 422 milyon dola nan 2014 [1]. Gen kat kategori prensipal: pre-dyabèt (yon etap anvan dyabèt), tip 1 (kote pankreyas la pa pwodui ensilin), tip 2 (kò a pa sèvi ak ensilin), ak dyabèt jestasyonèl (ki rive pandan gwosès). Estrès oksidatif rive akòz move balans ki genyen ant pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) ak antioksidan [2] finalman ki mennen nan kondisyon dyabetik la. Konplikasyon yo nan dyabèt gen ladan echèk nan ren an, domaj nè, avèg, konjesyon serebral, atak kè, lanmò fetis la, ak lakòz. [1]. Etid yo montre ke nwayo espèm, asid dezoksiribonukleik (ADN), ak mitokondri yo te siyifikativman domaje nan pasyan dyabetik gason [3]. Estrès oksidatif pandan transpò a nan espèm pral chanje pwosesis la nan sistèm repwodiktif gason an [4,5].

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Pwosesis spermatogenesis kontwole pa aks hypothalamus-pitwitè-gonad (HPG). Òmòn ki bay gonadotropin (GnRH) ki te pwodwi pa ipotalamus la stimul pwodiksyon òmòn luteinizan (LH) ak òmòn ki ankouraje pileu (FSH). Selil Leydig yo jwenn adjasan a tubul seminifèr akpwodui testostewònanba kontwòl LH. FSH deklannche pwodiksyon an nan pwoteyin obligatwa antijèn (ABP) ki ede pase òmòn gason an. Kidonk, lakòz ak lòt pwoblèm sitou rive akòz twoub ki rive nan aks HPG la. Administrasyon nan konbinezon an nan streptozotocin-nicotinamid pwovoke dyabèt nan rat eksperimantal. Streptozotocin se yon konpoze chimik toksik pou selil ki pwodui ensilin nan pankreyas la epi nikotinamid se yon vitamin idrosolubl ki pwoteje selil yo kont domaj konplè [6].

Cistanche tubulosa se yon espès plant dezè ke yo rele tou "Rou Cong-Rong" [7]. Li se yon plant parazit ki pa klowofil ki grandi sitou sou rasin pyebwa Calotropis procera epi li lajman distribiye nan peyi arid Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongoli, Iran, ak peyi Zend. Non komen Cistanche tubulosa se "Desert Hyacinth". Li se lajman aksepte nan medikaman tradisyonèl Chinwa e li te bay non "Ginseng nan dezè a". Li se lajman ki itilize nan domèn medsin nan trete leukorrhea morbid, metroraji abondan, maladi ren kwonik, konstipasyon, enpotans, ak lakòz. Konstitiyan chimik nanCistanche tubulosa konpoze de glikozid feniletanoid ki pa temèt(PHG), iridoid, lignan, lwil temèt, alditol, oligosakarid, ak polisakarid [8]. Etid yo montre saechinacosidesoti nan zèb sa a pwoteje fibroblast domaje a pa reglemante nivo ROS [9]. Konpoze sa a pwodui antioksidan, vazorelaxasyon, ak aktivite anti-enflamatwa ansanm ak neropwoteksyon ak prevansyon osteyopowoz la [10,11].

Etid sa a te vize envestige efè aCistanche tubulosa ekstrèki gen ECH sou malfonksyònman repwodiktif rat dyabetik streptozotocin-nikotinamid.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Materyèl

ECH ak CTE te achte nan men Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Pwodwi fen glikasyon avanse (AGEs) yo te achte nan Biovision (San Francisco, CA, USA). Liy selil LC-540 ak TM3 yo te achte nan men Enstiti rechèch ak devlopman endistri manje (Hsinchu, Taiwan). Yo te achte rat gason Sprague-Dawley (SD) senk semèn nan Sant Laboratwa Nasyonal Animal (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® te achte nan men PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) te jwenn nan Sigma (St. Louis, MO, USA). Methanol ak 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) te achte tou nan men Sigma. Dulbecco's modifye Eagle medium/F12 ak trypsin-EDTA yo te jwenn nan GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromur (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), dimethyl sulfoxide (DMSO), ak nitroblue tetrazolyum (NBT) yo te achte nan men Sigma. Twous anzimatik glikoz yo te jwenn nan Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japon. Yo te achte twous ELISA ensilin nan Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Syèd). T-PER Tissus Pwoteyin Ekstraksyon Reactif te akeri nan Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Yo te achte antikò poliklonal anti-moun/sourit/rat nikleyè-kappa B NF-κB nan Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Antikò poliklonal anti-sourit/rat pou pwodwi fen glikasyon avanse (RAGE), antikò poliklonal anti-moun/sourit/rat StAR, ak antikò monoklonal anti-moun/sourit/rat Cytochrome P450 17A1 yo te achte nan men Gene. Tex (Irvine, CA, USA). Yo te jwenn antikò poliklonal anti-moun/sourit/rat CYP11A1 nan Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Reyaktif Easy-Blue te achte nan men Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agarose ak ADN makè 100 bp yo te jwenn nan Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Twous te achte nan men QIAGEN, Hilden, Almay.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metòd

2.2.1. Analiz in vitro

Kilti selil LC{{0}} ak TM3: Liy selil LC-540 yo te kiltive nan 37 ◦C nan mwayen Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) ki te ajoute ak bikabonat sodyòm (1.5 g/L), L-glutamin (2 mM), asid amine ki pa esansyèl (0.1 mM), piruvat sodyòm (1.0 mM), ak serom fetis bovin (FBS) (10%) nan yon 5% CO2 enkibatè (CO2 enkibatè, Napco 5410, Taiwan). Liy selil TM3 la te kiltive nan mwayen Eagle modifye Dulbecco a (DMEM) ki te konplete ak glikoz (4.5 g/L), piruvat sodyòm (0.5 mM), L-glutamin (2.5 mM), bikabonat sodyòm (1.2 g/L), {{ 28}}(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asid (HEPES, 15 mM), ak serom fetis ti towo bèf (FCS, 10%) oswa serom chwal (5%) nan 37 ◦C nan yon 5% CO2 enkibatè.

Detèminasyon nan rantabilite selil laEchinacoside (ECH): 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromur (MTT) te itilize reyaktif pou tès viabilite selil. Yo te ajiste konsantrasyon selil la a 2 × 105 selil / mL nan yon plak 96-byen. Lè sa a, 20 µL ECH (dilye nan 2% nan mwayen) te ajoute ak enkubasyon pou 24 èdtan nan 37 ◦C nan yon enkibatè 5% CO2. Apre sa, yo te ajoute 100 µL reyaktif MTT epi enkube pou 4 èdtan nan 37 ◦C nan kondisyon fè nwa. Absorbans la te mezire nan 570 nm (ELISA lektè, Dynatech MR5000, Kloten, Swis).

Relatif viabilite selil (%)=[(Asample nan 570 nm - Ablank nan 570 nm)]/[(Acontrol nan 570 - Ablank nan 570)] × 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT) Rediksyon Egzamen ak 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) essai: Yo te ajiste kantite selil yo a 1× 1{{10}}6 selil/ mL. Lè sa a, 5 0 mg / mL nan ECH, resveratrol (RES), ak avanse glycation fen-pwodwi (AGEs) (kontwòl) yo te ajoute ak ko-kilti pou 18 èdtan nan 37 ◦C. Lè sa a, 0.3 mL solisyon NBT (0.1 mg/mL NBT, 5% FBS, ak 3% dimethyl sulfoxide (DMSO) ki fonn nan 10 mL DMEM) te ajoute ak enkubasyon nan 37 ◦C nan 5% CO2 pou 1 èdtan. Apre santrifugasyon (nan 800 × g pou 3 min) yo te retire supernatant la epi yo te ajoute 200 µL DMSO ak souke pou 5 min nan yon osilator ultrasons (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Absorbans la te mezire nan 630 nm. Pou tès radikal DPPH, Trolox (nan 95% alkòl) te pran kòm estanda. Lè sa a, 75 µL nan 0.5 mM DPPH solisyon yo te melanje ak 25 µL nan echantiyon epi yo te pèmèt yo reyaji nan tanperati chanm nan yon kote ki fè nwa pou 30 min. Yo te souke melanj lan epi yo te mezire absorbans nan 517 nm.

Analiz kontni espès oksijèn reyaktif (ROS): Yo te ajiste nimewo selil la a 2 × 105 selil/mL nan yon plak 12-byen ki gen 2% FBS. Lè sa a, yo te ajoute 50 µL/mL ECH, RES, ak AGE nan plak la epi yo te enkube a 37 ◦C pou 24 èdtan. Apre 24 èdtan, 20, 70 -dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) te ajoute ak enkubasyon nan 37 ◦C pou 30 min. Apre santrifujasyon (400 × g, 5 min), yo te retire supernatant la epi yo te lave selil yo de fwa ak saline tampon fosfat (PBS). Apre, selil yo te sispann nan 1 mL PBS ak nivo ROS yo te detèmine lè l sèvi avèk yon sitomèt koule (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Idantifikasyon ak analiz Kantitatif Pwoteyin: Pwoteyin yo te ekstrè lè l sèvi avèk yon reyaktif ekstraksyon pwoteyin (T-PER). Dansite selil la te ajiste a 2 × 105 selil/mL nan yon plak 12-byen ak 50 µL/mL nan ECH, RES, ak yon reseptè pou antagonis pwodwi fen glikasyon avanse (RAGE), ak AGE yo te ajoute ak enkube. nan 37 ◦C nan yon enkibatè 5% CO2 pou 24 èdtan. Apre, yo te ajoute 400 µL T-PER, grate selil yo, epi santrifuje nan 125, 000 × g pou 20 min (4 ◦C). Sipènatant la te kolekte epi estoke nan -80 ◦C (-80 ◦C frizè, Nuaire, Plymouth, MN, USA) pou plis analiz. Yo te itilize yon twous asid bicinchoninic (BCA) pou quantification pwoteyin. Lè sa a, 10 µL solisyon selil estanda ak 200 µL reyaktif BCA yo te ajoute nan 8-plak byen epi yo te enkube a 37 ◦C nan yon enkibatè 5% CO2 pou 30 min. Absorbans la te mezire nan 562 nm. Te analiz idantifikasyon pwoteyin fèt pa sodyòm dodecyl sulfat (SDS)-polyacrylamid gel (SDS-PAGE) elektwoforèz. Echantiyon yo te prepare lè yo ajoute lisat pwoteyin nan yon tanpon chaje pwoteyin epi yo te fè analiz Western blot pou detekte pwoteyin espesifik yo.

2.2.2. Analiz In Vivo

Konsepsyon Animal Modèl: Yo te achte swasant {{0}}rat gason Sprague–Dawley (SD) nan Sant Laboratwa Nasyonal Animal (Taipei, Taiwan). Chak rat te loje endividyèlman nan kaj dezenfektan asye pur anba tanperati kontwole (23 ± 1 ◦C) ak imidite (40-60%) ak yon sik 12 h limyè / 12 h fè nwa. Yo te bay manje ak dlo ad libitum. Chak rat te domestik nan premye semèn nan epi yo te bay laboratwa wonjè rejim 5001 kòm rejim alimantè prensipal la. Tout pwosedi yo te swiv estanda Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal (IACUC Apwobasyon No 101026) nan Inivèsite Nasyonal Taiwan Oseyan, Taiwan. Apre domestikasyon, rat yo te divize an de gwoup: gwoup kontwòl (Con) ki te manje laboratwa rejim alimantè 5001, ak gwoup dyabetik ki te manje yon rejim ki gen anpil grès (HFD, 40%) pou tout eksperyans la. Apre yo te fin manje ak HFD a pou 4 semèn, rat gwoup dyabetik yo te sou fòm piki ak streptozotocin (65 mg / kg) (STZ) pou pwovoke dyabèt melitus (DM). Nan 15 minit apre enjekte STZ, yo te enjekte nikotinamid (230 mg / kg pwa kò). Yon semèn apre piki, yo te fè yon tès oral tolerans glikoz (OGTT) pou detèmine siksè endiksyon dyabèt melitus (DM). Apre sa, bèt yo te divize an sis gwoup: kontwòl la (manje ak rejim alimantè laboratwa 5001); Gwoup DM (DM + 45% HFD); Gwoup DMR (DM + rosiglitazone: 0.571 mg/kg BW) + 45% HFD; Gwoup DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg BW) + 45% HFD; Gwoup DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; ak gwoup DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitazone (RSG) te pran kòm kontwòl pozitif la. Twa dòz CTE (80, 160, ak 320 mg/kg) yo te itilize dapre rekòmandasyon direktiv evalyasyon fonksyonèl manje sante Taiwan Food and Drug Administration (TFDA). Tretman yo te bay jouk nan fen eksperyans la. Tout rat eksperimantal yo te sakrifye apre 6 semèn. San yo te kolekte nan rat yo te santrifuje a 3000 rpm pou 15 min nan 4 ◦C. Yo te egzamine supernatant la pou analiz sa a:

Detèminasyon glikoz total, trigliserid ak kolestewòl: Detèminasyon glikoz la te fèt pa twous anzimatik glikoz. Lè sa a, 20 µL echantiyon plasma san yo te ajoute nan reyaktif yo epi yo te kenbe nan 37 ◦C pou 5 min. Trigliserid total ak konsantrasyon kolestewòl total yo te detèmine lè l sèvi avèk twous anzimatik trigliserid ak kolestewòl. Lè sa a, yo te ajoute 10 µL plasma san nan reyaktif yo epi yo te fè eksperyans la dapre enstriksyon manifakti a. Absorbans la te mezire nan 510 nm.

Plasma total glikoz/trigliserid/kolestewòl (mg/dL)=(Egzanp - ABlank)/(Astandard - ABlank) × 200.

Asample: Absòbsyon echantiyon san, ABlank: Valè absorpsyon twous san echantiyon, Astandard: Valè absorpsyon nan reyaktif estanda a, 200: reyaktif estanda nan yon konsantrasyon 200 mg/dL.

Ensilin, Leptin, ak Evalyasyon Modèl Omeostatik – Detèminasyon Rezistans Ensilin (HOMA-IR):Nivo ensilin lan te detèmine pa ensilin ELISA kits. Isit la, 25µL nan plasma san te ajoute nan lareyaktif yo, epi yo te mezire absorbans nan 450 nm. Kontni leptin total te detèmine lè l sèvi avèk yonleptin anzim iminometrik tès twous.Lè sa a, 100µL nan plasma te analize ak absòbe ayo te mezire nan 450 nm lè l sèvi avèk yon lektè ELISA. Eksperyans an antye te fèt selonenstriksyon manifakti a. Yo te detèmine valè HOMA-IR apati modèl omeyostaz laekwasyon evalyasyon=Konsantrasyon ensilin nan plasma nan jèn (mg/mL)× glikoz plasma nan jènkonsantrasyon (mmol/L)/22.5.

Peroksidasyon lipid Plasma: Isit la, {{0}}.5 mL plasma san yo te melanje ak 1 mL reyaktif (15%, w/v asid trichloroacetic nan {{{0}.25 N asid idroklorik (HCl). ) ak 0.375%, w/v asid thiobarbituric nan 0.25 N HCl) epi yo mete l nan yon beny dlo (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Swis) nan 100 ◦C pou 15 min. Apre refwadisman, yo te ajoute 1 mL n-butanol, souke kouray, epi santrifuje nan 1500 × g pou 10 min. Yo te kolekte supernatant la epi yo te mezire absorbans nan 532 nm [12].

Konsantrasyon Malondialdehyde (MDA) (nM/mL)=[(Yon echantiyon nan 532 nm - Ablank nan 532 nm)/ (Yon estanda nan 532 nm - Ablank nan 532 nm)] × 5.

estanda nan 532 nm − Ablank nan 532 nm)] × 5. Detèminasyon Nivo Testostewòn Plasma ak Òmòn Luteinizing (LH): Yo te itilize twous testostewòn ELISA pou mezire nivo testostewòn nan plasma san an. Yo te itilize twous RIA pou detèmine konsantrasyon LH. Lè sa a, yo te ajoute 50 µL plasma epi kalkil yo te baze sou konsantrasyon òmòn LH-RP-3 (estanda). Plis etap yo te fèt dapre enstriksyon manifakti a.

Detèminasyon Faktè Necrosis Timè (TNF)- ak Konsantrasyon Interleukin-6 (IL{-6): Yo te dilye antikò ki te kaptire a 250 fwa nan tanpon kouch, li te ajoute nan yon 96- plak byen (100 µL/pi), epi kenbe nan 4 ◦C pou lannwit lan. Supernatant la te aspire epi lave senk fwa ak tanpon lave (1 fwa PBS, 0.05% Tween 20). Apre enkubasyon (1 h) ak 200 µg diluan tès, selil yo te lave 5 fwa ak tanpon lave epi yo te ajoute 100 µL solisyon estanda TNF oswa echantiyon tès nan chak pi epi enkubate pou 2 èdtan. Apre lave, yo te ajoute 100 µL antikò IL-6-detekte epi yo te enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Supernatant la te aspire epi lave 5 fwa. Lè sa a, yo te ajoute 480 µL nan anzim avidin-refor peroksidaz (HRP) epi enkube pou 30 minit nan tanperati chanm. Supernatant la te aspire epi lave senk fwa ak yon tanpon lave. Lè sa a, 100 µL nan solisyon substrate te ajoute ak enkubasyon pou 15 min nan tanperati chanm. Apre sa, 50 µL solisyon sispann (1M asid fosfò) yo te ajoute nan chak pi epi yo te mezire absòbe a nan 450 nm.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU REPARE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiz de espèm ak paramèt Testis

Koleksyon echantiyon espèm: Yo te fè koleksyon echantiyon espèm nan dapre metòd ki te deja rapòte nan [13]. Yo te ranmase espèm yo nan supernatant la epi yo te itilize pou plis analiz.

Kantite espèm, mobilite espèm, ak espèm ki pa nòmal: Yo te kalkile kantite espèm ak solisyon emocytometer ak tripan ble. Lè sa a, yo te melanje 100 µL likid espèm ak yon solisyon tripan ble epi yo te kalkile kantite espèm, mobilite, ak espèm nòmal lè l sèvi avèk yon emositomèt ak mikwoskòp [14].

Nitro ble Tetrazolium NBT Rediksyon ak peroksidasyon lipid nan espèm ak tèstikul: Yo te analize peroksidasyon lipid la ak rediksyon NBT dapre menm pwosedi analiz plasma.

Detèminasyon Superoxide Dismutase (SOD) ak Aktivite Catalase: Yo te analize aktivite Superoxide Dismutase (SOD) lè l sèvi avèk twous RANSEL la. Isit la, {{0}}.{05 mL omojene testikil yo te ajoute nan 1.7 mL solisyon reyaksyon (0.05 mM xanthine, 0.025 mM 2-({ {9}}yodofenil)- 3-(4-nitrofenol)-5-klori feniltetrazolyom (INT)). Apre melanje, 0.25 mL xanthine oksidaz (80 U / L) te ajoute ak reyaji nan tanperati chanm pou 30 s. Absorbans la te mezire nan 505 nm. Konsantrasyon pwoteyin nan omojene testikil la te detèmine pa Bio-Rad DC tès pwoteyin twous ak aktivite espesifik li yo (U/mg pwoteyin) yo te kalkile. Aktivite katalaz (CAT) te detèmine dapre yon metòd ki te deja rapòte [15].

H & E (ematoksilin ak eozin) tach

Tèstik la te tranpe nan 10% fòmalin pou 24 èdtan epi estoke nan 4 ◦C. Tisi yo te nan gwosè mikwo ak tache ak glise a. Apre fiksasyon (95% metanol + 5% asid acetic), glisad yo te benyen nan ematoksilin pou 3 minit, lave ak dlo k ap koule pou 5 minit, ak Lè sa a, tranpe yo ak 50%, 70%, ak 90% alkòl pou yon minit. Apre sa, glisad yo te tache ak eosin pou 10 s ak tranpe nan 100% alkòl pou yon minit jiskaske li ta fennen. Finalman, glise a te tranpe nan xylene pou yon minit. Apre sa, glise a te cheche ak sele. Yo te mete tib tache a nan yon mikwoskòp kontras faz envèse (Inverse Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Japon) pou obsève mòfoloji a.

Analiz de ipotalamus la

Sourit KISS1, G-pwoteyin makonnen reseptè (GPR) 54, suppressor nan siyal cytokine 3 (SOCS-3), ak sirtuin 1 (SIRT1) sekans jèn yo te idantifye nan baz done jèn NCBI (National Center for Biotechnology Information) epi yo te fèt yon jadendanfan espesifik lè l sèvi avèk Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Jadendanfan yo itilize nan eksperyans la yo ki nan lis nan Tablo 1.

Ekstraksyon asid ribonukleik (RNA) soti nan ipotalamus la. Te fè ekstraksyon RNA nan ipotalamus sèvo a lè l sèvi avèk RNeasy Lipid Tissue Mini Twous la. MRNA yo jwenn yo te mezire quantitativement pa ranvèse transcription (RT) ak reyaksyon chèn polymerase (PCR). ADN konpliman yo te jwenn nan analiz RT yo te estoke nan -20 ◦C pou itilize pita. ADN extrait yo te sibi analiz polymerase chain reaction (PCR) lè l sèvi avèk Taq polymerase. Lè sa a, yo te pran 5 ~ 10 µL nan pwodwi PCR la ak analize pa elektwoforèz sou yon koloyid agar 1.5%. Imaj la te pran nan yon sistèm D' UVP BioDoc-It. Yo te pran asid dezoksiribonukleik konplemantè (cDNA) transkri ranvèse epi yo te fè PCR lè l sèvi avèk IQ SYBR Green Supermix Twous la. Apre sa, li te analize ak iQTM 5 Optical System Software. Pwoteyin yo te ekstrè lè l sèvi avèk yon reyaktif ekstraksyon pwoteyin (T-PER). Lè sa a, yo te ajoute 20 mg omojene testikil nan 400 µL T-PER epi yo te santrifuje (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Almay) nan 4 ◦C (125,000× g. ) pou 20 min. Metòd sa a te sanble ak "idantifikasyon ak quantifikasyon analiz de pwoteyin" nan analiz in vitro.

2.3. Analiz estatistik

Rezilta eksperimantal yo te eksprime kòm mwayèn ± devyasyon estanda (Mwayèn ± SD) epi done yo te analize lè l sèvi avèk Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 lojisyèl, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Diferans ki genyen ant gwoup yo te analize pa yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA). Konparezon miltip nan diferan gwoup yo te analize pa tès Duncan a nan valè a nan p < 0.05 kòm nivo enpòtan an.

3. Rezilta

3.1. Analiz in vitro

3.1.1. Konparezon Aktivite Antioksidan ECH, CTE, ak RES

Alontèm hgwo estrès oksidatif ak enflamasyon kwonik se kòz prensipal yo nan dyabetikkonplikasyon [16]. CTE yo genyen divès kalitephenylethanoid glikozid tankou echinacoside(ECH) ak acteoside, ak potansyèl pou aktivite antioksidan [17]. DPPH radikal scavengingte fè tès pou evalye aktivite antioksidan ECH. Trolox ak resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbene, RES) yo te pran kòm estanda ak kontwòl pozitif respektivman. Jan yo montrenan Figi1, ECH te montre pi bon aktivite scavenging radikal ak aktivite a te siyifikativman pi wopase kontwòl pozitif (RES).

3.1.2. Viabilite selil ECH sou selil LC-540 ak TM3 Leydig

Yo te fè tès MTT pou evalye viabilite selil diferan konsantrasyon ECH. Selil Leydig LC-540 ak selil Leydig TM3 yo te montre plis pase 80% viabilite apre yo fin trete yo ak ECH (Figi 2). Kòm konpare ak lòt konsantrasyon yo, yon konsantrasyon 100-µM (dilusyon 100 µM nan 2% FBS) nan ECH te montre pi bon viabilite selil nan selil TM3 Leydig yo. Rezilta a endike ke konsantrasyon an ogmante nan ECH pa kontribye okenn toksisite enpòtan nan selil yo.

3.1.3. Efè ECH sou pwodiksyon sipèoksid AGE-pwovoke pa NBT Assay nan selil LC-540 ak TM3 Leydig

AGE yo lakòz domaj oksidatif nan kò a akòz oksidasyon glikoz ak fòmasyon radikal gratis tankou O2-, radikal idroksil, ak gwoup karbonil [18]. Apre yo te ankouraje ak 50 ug / mL nan AGEs, selil LC -540 (Figi 3a) ak TM3 (Figi 3b) yo te trete ak ECH ak RES (5 μM ak 10 μM chak). Rezilta yo te montre ke pwodiksyon anion supèroksid te ogmante nan gwoup kontwòl la (AGEs stimulé), men pwodiksyon anion superoxide te diminye apre gwoup kontwòl la (AGEs stimulé), men pwodiksyon anion superoxide diminye apre pwodiksyon superoxide ak pwoteje. selil yo soti nan domaj oksidatif. Nan ka selil LC-540, 10 µM ECH te montre aktivite prèske menm jan ak gwoup nòmal la. Pwodiksyon superoksid nan tou de selil yo te diminye ak yon ogmantasyon nan konsantrasyon tou de ECH ak RES.

NATIRÈL CISTANCHE TUBULOSA POU AMÉLIORE FONKSYON SEKSYÈL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Efè ECH sou pwodiksyon H2O2 nan selil Leydig LC-540 ki ankouraje AGE

Yo te egzekite tès DCFH-DA pou detekte prezans espès oksidatif yo. Apre yo fin antre nan selil yo, lank fluorescent DCFH-DA a soksid pa H2O2 entraselilè epi li fòme dichlorofluorescein (DCF). Jan yo montre nan Figi 4, te gen yon ogmantasyon siyifikatif nan pwodiksyon intraselilè H2O2 nan gwoup AGE-stimile (kontwòl) tandiske adisyon a nan 10 µM ECH ak RES siyifikativman redwi pwodiksyon an H2O2 nan selil yo. Administrasyon 10 µM ECH te lakòz sèlman apeprè 47.1% nan pwodiksyon H2O2, siyifikativman pi ba pase nan gwoup kontwòl la.

3.1.5. Efè ECH sou nivo ekspresyon pwoteyin RAGE ak NF-κB nan selil LC-540 Leydig ki ankouraje AGE.

Yo te fè analiz Western blot pou konfime prezans RAGE nan selil LC-540 Leydig yo. Efè ECH sou nivo ekspresyon pwoteyin RAGE (Figi 5a) ak NF-κB (Figi 5b) nan selil Leydig ki ankouraje AGE yo te montre nan Figi 5. Rezilta yo te montre ke 50 µg/mL konsantrasyon AGE yo te pwovoke pi wo RAGE ak NF-. Ekspresyon κB nan selil LC-540 Leydig ak konsantrasyon 10 µM nan ECH ak RES te redwi siyifikativman ekspresyon RAGE ak NF-κB. Ekspresyon NF-κB te siyifikativman pi ba nan RES ak ECH pase nan antagonis RAGE. Se konsa, rezilta yo konfime ke ECH a redwi nivo enflamasyon an pa diminye nivo RAGE ak NF-κB.

3.1.6. Efè ECH sou chemen Sentèz Testostewòn nan selil Leydig LC-540 ki ankouraje AGE.

Pwosesis spermatogenèz ak lakòz gason depann sou prezans testostewòn. Jan yo montre nan Figi 6, ekspresyon StAR (Figi 6a), CYP11A1 (Figi 6b), CYP17A1 (Figi 6c), ak HSD 17 3 (Figi 6d) pwoteyin yo te siyifikativman diminye nan AGE-stimulé LC{{11 }} Selil Leydig (gwoup kontwòl). Ekspresyon StAR, CYP11A1, CYP17A1, ak HSD17 3 pwoteyin yo te ogmante anpil lè yo te ajoute antagonis RAGE, RES, ak ECH. Ekspresyon ogmante nan StAR ak CYP11A1 pwoteyin yo te wè nan tou de gwoup yo trete ECH ak RES. Nivo ekspresyon CYP17A1 te prèske menm jan an nan gwoup RES ak ECH yo. Ekspresyon pwoteyin HSD17 3 nan selil Leydig ki te trete ak ECH yo te pi wo pase selil ki te trete ak antagonis RES ak RAGE yo. Ogmantasyon ekspresyon StAR, CYP11A1, CYP17A1, ak HSD17 3 pwoteyin endike pwodiksyon nòmal testostewòn.