Eksplore wòl yon roman entèleukin-17 omolog ki soti nan envètebre moul marin Mytilus Coruscus nan repons iminitè natirèl: Èske règleman negatif pa Mc-Novel_miR_145 kle a?

Résumé: Interleukin-17 (IL-17) reprezante yon klas cytokin proenflamatwa ki enplike nan maladi enflamatwa kwonik ak dejeneratif. Anvan etid sa a, yo te prevwa ke Mc-novel_miR_145 te kapab vize yon IL-17 homolog pou patisipe nan repons iminitè Mytilus coruscus. Etid sa a te itilize yon varyete metòd rechèch molekilè ak byoloji selilè pou eksplore asosyasyon ant Mc-novel_miR{_145 ak IL-17 homolog ak efè imunomodulateur yo. Prediksyon byoenfòmatik la konfime afilyasyon homolog IL-17 ak fanmi IL-17 moul, ki te swiv pa tès PCR an tan reyèl (qPCR) pou demontre ke McIL-17-3 te eksprime anpil nan tisi iminitè ki asosye ak reponn a defi bakteri. Rezilta yo nan tès repòtè luciferase konfime potansyèl McIL-17-3 pou aktive NF-κb en ak vize li yo pa Mc-novel_miR{_145 nan selil HEK293 yo. Etid la te pwodui tou McIL-17-3 antiserom epi li te jwenn ke Mc-novel_miR{_145 kontwole negatif McIL-17-3 atravè Western blotting ak qPCR tès. Anplis de sa, analiz sikometri koule te endike ke Mc-novel_miR_145 te kontwole negatif McIL-17-3 pou soulaje apoptoz LPS-pwovoke. Ansanm, rezilta aktyèl yo te montre ke McIL-17-3 te jwe yon wòl enpòtan nan defans iminitè moluskan kont atak bakteri. Anplis de sa, McIL- 17-3 te reglemante negatif pa Mc-novel_miR{_145 pou patisipe nan apoptoz LPS-induit. Konklizyon nou yo bay nouvo apèsi sou règleman RNA ki pa kodaj nan modèl envètebre.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

Mo kle: Mytilus couscous; entèleukin-17; mikroRNA; apoptoz; iminite natirèl

1. Entwodiksyon

Sistèm iminitè a jwe yon wòl enpòtan nan defans òganis lan kont envazyon patojèn ekzojèn yo. Konvansyonèl, sistèm defans la divize an iminite natirèl ak iminite akeri. Iminite natirèl reprezante premye liy defans kò a kont patojèn, ki ka detekte envazyon patojèn ak pasyèlman elimine yo [1]. Iminite natirèl se medyatè pa yon gwo varyete selil, ki gen ladan selil asasen natirèl, monosit, netrofil, eozinofil, basofil, ak sikile selil dendritik, ki kolektivman ke yo rekonèt kòm selil iminitè natirèl. Selil sa yo lage yon gwo kantite sitokin ki enplike nan kominikasyon selilè epi kidonk ede kowòdone repons iminitè [2]. Nan ka enfeksyon ak enflamasyon, sitokin fonksyone kòm modulateur: kèk sitokin fè maladi a vin pi mal (proinflammatory), pandan ke lòt ankouraje sante (anti-enflamatwa) [3]. Sitokin yo sijè a nivo segondè nan presyon evolisyonè e konsa montre divèsifikasyon sekans [4], tandiske IL-17 fanmi sitokin montre konsèvasyon segondè, ki se manifeste pa yon pliye sistein-ne nan achitekti fonksyonèl ki te fòme atravè entèraksyon pami kat. konsève rezidi sistein [5]. Etid resan yo te demontre ke IL-17 se yon klas cytokin pro-enflamatwa ki enplike nan maladi kwonik enflamatwa ak dejeneratif [6]. IL-17fonksyone lè li lye espesyalman nan reseptè yo pou ankouraje devlopman enflamasyon, rejè iminitè, ak ematopoyèz. Fanmi sitokin IL-17 nan imen an gen sis manm (IL-17A rive IL{-17F), ki pwodui pa lenfosit T aktive ak lòt popilasyon selil natirèl an repons a IL. -1 ak IL-23 [7,8]. Sepandan, yon kantite prèv k ap grandi sijere ke fanmi IL-17 te fè eksperyans yon gwo ekspansyon nan molisk maren ak espès echinodèm. Nan genòm nan oursin wouj violèt Strongylocentrotus purpuratus, yo te detekte anviwon 30 jèn IL-17 [9]. Menm jan an tou, 31 poulp IL-17-tankou jèn yo te jwenn nan sefalopod Coleoid, kote 27 jèn gen yon ekspresyon pwisan nan vantouz yo ak po [10]. Saco, et al. [11] te rekipere 379 sekans IL-17 inik ki soti nan 15 jenom moul resekans ak jenom referans M. galloprovincialis [12] epi divize yo an 23 izofòm atravè analiz filogenetik. Anplis de sa, yo te jwenn izofòm IL-17 ki soti nan espès Mytilidae yo te konsève pami endividi yo epi yo te pataje ant espès ki gen rapò sere. Anplis espès Mytilidae, gwo fanmi IL-17 yo te jwenn tou nan lòt espès molusk, tankou Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis, ak Pinctada fucata martensii [13]. Dlo lanmè gen anpil patojèn, epi molisk maren yo an kontak konstan avèk yo, kidonk li nesesè pou yon asenal pwisan molekil iminitè, kidonk agrandisman fanmi IL-17 bay bèt sa yo repons iminitè ki pi efikas.

Gen plizyè etid ki endike wòl enpòtan IL-17yo jwe nan iminite natirèl bèt moluskan yo. Pa egzanp, rechèch yo te jwenn ke lè enfeksyon Vibrio harveyi, nivo mRNA IL-17D te regilasyon anpil nan Tegillarca granulosa [14], pandan ke nan C. gigas, CgIL17-5 te montre yon reyaksyon diferan nan Vibrio splendidus [15]. Anplis de sa, molluscan IL-17 yo te montre yo reponn a anpil patojèn ki asosye modèl molekilè (PAMPs), tankou lipopolysaccharide (LPS), polyinosinic: polycytidylic asid (polyI: C), ak peptidoglycan (PGN). LPS se yon eleman enpòtan nan miray deyò mi selil bakteri Gram-negatif epi li reprezante youn nan estimilan iminitè ki pi souvan itilize yo. Nan lòt men an, polyI: C se yon analòg RNA doub-chèn ki souvan itilize kòm yon similatè viris nan rechèch syantifik. Apre eksitasyon LPS la, ekspresyon transkripsyon jèn fanmi IL-17 te deklanche byen vit nan zuit Pasifik C. gigas ak zuit pèl P. fucata [16,17]. Epitou nan witr pèl, yo te jwenn PfIL-17 ki enplike nan repons iminitè a nan eksitasyon polyI: C [17].

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Anplis de sa, yon tès doub luciferase te montre ke PfIL -17 te kapab aktive jèn sib vertebrate ki gen sit obligatwa NF-kB epi patisipe nan chemen siyal NF-kB nan selil HEK293 [17]. PGN prezan nan mi selil bakteri Gram-pozitif epi li souvan itilize kòm yon mime pou bakteri Gram-pozitif. Recombinant C. gigas IL17-5 te pwouve yo gen yon gwo afinite ak PGN, ki pa t janm rapòte nan entèleukin vertebrate [18]. Etid sa yo te bay yon prelid pou revele fonksyon imunomodulateur IL-17 nan molisk yo. Kòm yon klas nan sitokin pro-enflamatwa, ekspresyon twòp IL-17 ka pwovoke domaj grav nan selil yo. Òganis yo te devlope divès mekanis pou kontwole reyaksyon twòp IL-17, nan yo ki microRNAs (miRNAs) reprezante klas ki pi pisan ak byen etidye nan RNA ki pa kode. MiRNA yo se yon fanmi RNA kout apeprè 22 nt nan longè ki ka kontwole ekspresyon jèn sib pa represyon tradiksyon oswa degradasyon mRNA [19]. Rechèch aktyèl la sou règleman miRNA yo nan IL-17 sitou konsantre sou efè sinèjik yo nan maladi otoiminitè imen tankou paralezit miltip, atrit rimatoyid, psoriasis, ak lòt moun [20]. Devlopman teknik nan sekans segondè-debi ak kalkil byolojik fè li posib pou eskane miRNA moliskan nan nivo jenomik, epi yo te idantifye yon gwo kantite miRNAs konsève ak nouvo nan espès mollusk tankou plat zuit Ostrea edulis, pasifik zuit C. gigas. , Lymnaea stagnalis, moul M. galloprovincialis, elatriye [21-29]. Etid sa yo bay done debaz ak gwo sipò pou entèpretasyon fonksyonèl miRNAs nan mollusks. Konsènan wòl iminorègilasyon sèten miRNA nan molisk, Tian, ​​et al. [30] te jwenn ke Pm-miR-29a te kapab kontwole pozitivman IL-17 nan Pinctada martensii; apre ekspresyon Pm-miR-29a, ekspresyon IL-17 nan manto ak branch espès yo te kontwole. Nan C. gigas, cgi-miR-2d ogmante fagositoz zuit emosit pa reglemante negatif CgIκB2 [31] ak reglemante negatif ekspresyon yon jèn ki tankou transpòtè kolin nan premye etap enfeksyon an, ki te enplike nan iminomodulasyon sofistike. [32].

cistanche plant-ogmante sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pandan desikasyon, yo te jwenn cgi-miR-365 ki te pwovoke pa norepinephrine ak dirèkteman ankouraje ekspresyon CgHSP90AA1 [33]. Dènye etid yo te montre ke miRNA echafod659_26519 vize kalmodulin pou kontwole ekspresyon IL-17 nan faz bonè repons iminitè C. gigas [34]. Anplis de sa, fonksyon espesifik sèten miRNA yo te dekri nan lòt envètebre, tankou konkonm lanmè Apostichopus japonicus [35-39] ak krevèt Litopenaeus vannamei [40]. Etid sa yo te louvri vwal la nan mekanis ki kache nan miRNAs nan envètebre epi tou li bay referans teknik ak metodolojik pou rechèch aktyèl nou an. Nan etid anvan nou an, yo te kalkile biyolojik 26 miRNA ak 667 jèn M. coruscus pou ekspresyon diferans apre defi Vibrio alginolyticus, kote Mcnovel_miR{_145 ka vize yon homolog IL-17. epi patisipe nan repons iminitè a nan enfeksyon bakteri [41]. Objektif etid sa a se idantifye jèn IL-17 epi envestige wòl potansyèl li nan iminite natirèl ak règleman li pa miRNA Mcnovel_miR{_145 nan M. coruscus. Atravè etid sa a, nou vize jwenn yon pi bon konpreyansyon sou mekanis repons iminitè mollusk yo epi fè limyè sou baz molekilè defans iminitè yo kont patojèn. Rechèch sa a ka bay tou apèsi sou règleman RNA ki pa kodaj nan modèl envètebre.

2. Rezilta

2.1. Karakterizasyon McIL-17-3

Sekans ADNc McIL-17-3 ki gen ORF konplè, 30 -UTR, ak yon pati nan 50 - UTR te klonaj an silico apati transkriptòm plen longè M. coruscus (nimewo aksesyon: PRJNA798880, F{ {5}}transkripsyon_12404). McIL-17-3 gen yon rejyon ORF 585 bp ki kode 194 asid amine. Pwa molekilè prevwa a se 21.77 kDa, ak pwen izoelektrik la se 5.21. Analiz SMART te revele yon domèn IL-17 tipik nan pwoteyin sa a (Figi 1A). Yo te konstwi yon pye bwa filojenetik lè yo te rekrite IL-17 manm espès vètebre ak Mytilidae, epi yo te itilize IL2 kòm gwoup ekstèn. Jan yo montre nan Figi 1B, IL-17 sa yo rasanble nan yon branch espesifik pou distenge yo ak IL-2. Nan gwoup IL-17 yo, yo te montre de klad aparan, youn ki konpoze de IL-17 vètebre ak lòt la ki konpoze de IL-17 moul. Nan gwoup IL-17 moul, McIL-17-3 premye gwoupe ak molekil ki koresponn lan soti nan yon lòt espès Mytilus, M. galloprovincialis (Figi 1B).

2.2. Aliyman miltip ak Prediksyon estrikti Tersyè

Nwayo McIL-17-3 la konpoze de de pè fil antiparalèl; yon pè gen ladann seksyon 1 (résid 52–58) ak 2 (résid 66–72 ak 77–79), pandan ke lòt la gen ladan branch 3 (résid 89–103) ak 4 (résid 110–125) (Figi 2B, C) . De pon disulfide (Cys97/Cys134 ak Cys125/Cys169) konekte seksyon 1 ak 3, 2 ak 4, respektivman (Figi 2A, C). Toujou, lòt moluskan IL-17 yo genyen tou de pon disulfid sa yo ant fil 1 ak 3, 2 ak 4 (Figi 2A, C). Miyò, byenke vètebre IL-17 yo gen tou de pon disulfid, yo egziste ant 2 ak 4 (Figi 2A, C).

2.3. Ekspresyon transkripsyon McIL-17-3

Pwofil distribisyon tisi transkripsyon McIL{{0}} yo te evalye pa qPCR. Transkripsyon McIL-17-3 yo te eksprime nan tout tisi yo teste, ak nivo ekspresyon nan emosit ak branch yo te siyifikativman pi wo pase sa yo nan misk adductor (Figi 3A). Yo te evalye ekspresyon tanporèl nan transkripsyon emosit McIL-17-3 an repons a defi V. alginolyticus tou. Nivo mRNA McIL-17-3 te siyifikativman kontwole nan 3 ak 12 HPC (3.13- oswa 4.35-pliye ogmantasyon konpare ak 0 HPC, respektivman), men pa te gen okenn. evidan regilarite tanporèl an jeneral (Figi 3B).

Figi 1. karakterizasyon molekilè McIL-17-3. (A) Analiz achitekti domèn konsève nan McIL-17-3 lè l sèvi avèk SMART. Yo te montre yon domèn IL-17 ki konsève. (B) analiz filogenetik McIL-17-3. Pyebwa filogenetik la te konstwi lè l sèvi avèk lojisyèl MEGAX ak 2000 replikasyon nan bootstrapping lè l sèvi avèk metòd la vwazen-joining. McIL-17-3 te make ak yon triyang vèt. Espès ki enkli nan pye bwa a filojenetik yo tout te rekipere nan baz done Genebank la, ak nimewo asansyon yo te tou ki nan lis nan pye bwa a. Triyang vèt sou non McIL-17-3. (Pou entèpretasyon referans yo sou koulè nan lejand figi sa a, yo refere lektè a nan vèsyon entènèt atik sa a.)

2.4. Aktivasyon Downstream pa McIL-17-3

Jan yo montre nan Figi 4, McIL recombinant -17-3 ogmante aktivite luciferase pGLNF-κB-luc nan yon fason ki depann de dòz la. Nan 0.5 ak 1.0 µg/pi, aktivite luciferase pGLNF-κB-luc ogmante 2.07- ak 11.07-pliye, respektivman.

2.5. Konfimasyon McIL-17-3 kòm yon jèn sib Mc-novel_miR_145

Atravè prediksyon byoenfòmatik, jèn McIL{{0}} genyen yon sekans sib estanda pou Mc-novel_miR_145 nan 30 UTR li (Figi 5A). Mc-novel_miR{_145 imite ak inibitè yo te ko-transfekte ak plasmid repòtè McIL-17-3-30 UTR sovaj nan selil HEK293 pou konfime korelasyon yo. Jan yo montre nan Figi 5B, Mc-novel_miR{_145 imite ka anpeche aktivite lisiferaz McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58}. }}}pliye diminisyon konpare ak kontwòl), pandan ke Mc-novel_miR{_145 inibitè konsiderableman soulaje efè yo (1.64-pliye ogmantasyon konpare ak Mc-novel_ miR_145 imite kòm yon gwoup jis ajoute). Pou evalye si Mc-novel{{30}}miR_145 dirèkteman vize jèn McIL-17-3 atravè sit sib la nan 30 UTR, nou te konstwi vèsyon mutan plasmid repòtè luciferase. ki te chanje sekans vize Mc-novel_miR_145 nan McIL-17-3 30 UTR. Jan yo montre nan Figi 5C, Mc-novel_miR{_145 imite siyifikativman diminye aktivite luciferase nan selil yo transfekte ak McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-pliye). diminye), pandan ke yo pa te obsève okenn chanjman nan aktivite luciferase nan selil transfekte ak McIL-17-3-30 UTR-MUT la. Anplis de sa, efè Mc-novel_miR{_145 ki depann de dòz la imite anpèchman aktivite lisiferaz McIL-17-3-30 UTR-WT yo ta ka obsève tou nan 24 èdtan apre transfè (0). .71-, 0.43-, ak 0.20-pliye diminisyon konpare ak kontwòl, respektivman, Figi 5D).

Figi 2. Aliyman miltip McIL-17-3 ak lòt manm fanmi IL-17. (A) Sekans asid amine McIL-17-3 te aliye ak lòt IL-17 yo te jwenn nan moul ak vertebre, tankou sourit ak pwason zèb. Cysteines sa yo, ki fòme yon ne kanon, yo te make ak vèt, ak ranplase résidus asid amine ki make ak wouj. Ne cysteine ​​endike pa liy koulè, ble ki vle di prezans yo nan molisk ak wouj ki vle di prezans yo nan vertebre. Remak: Se sèlman dezyèm mwatye nan aliyman an sekans konsève pou vizyalizasyon. (B) Yo te prevwa estrikti siperyè McIL-17-3 yo lè l sèvi avèk modèl Swis ak lojisyèl pyMol. Sisten sa yo, ki fòme yon ne kanon, yo te make. (C) Yon reprezantasyon desen kanonik pliye sistein-ne. Résidus Cysteine ​​yo te endike pa ti sèk plen; sa yo ki te prezan nan IL-17 pwoteyin yo te jòn, tandiske de rate yo te gri. (Pou entèpretasyon referans yo sou koulè nan lejand figi sa a, yo refere lektè a nan vèsyon entènèt atik sa a.)

Figi 3. Analiz pwofil ekspresyon transkripsyon McIL-17-3. (A) Distribisyon transkripsyon McIL-17-3 nan tisi moul komen yo. (B) Chanjman ekspresyon tanporèl nan transkripsyon McIL-17-3 an repons a defi V. alginolyticus. Rezilta yo te eksprime kòm mwayen ± SD (n=3, * p < 0.0 5, ** p < 0.01). (Pou entèpretasyon referans yo sou koulè nan lejand figi sa a, yo refere lektè a nan vèsyon entènèt atik sa a.)

Figi 4. Aktivasyon repòtè NF-κB pa McIL-17-3. Vektè recombinant pEGFP-McIL- 17-3 nan twa konsantrasyon (0.1, 0.5, ak 1.{{10}} µg/pi) te kotransfekte. nan selil HEK293 lè l sèvi avèk Lipo6000TM pou 24 èdtan. Aktivite luciferase relatif yo te kalkile pa nòmalize nan valè pRLTK la. Rezilta eksperimantal yo te eksprime kòm chanjman pliye lè yo konpare aktivite luciferase selil recombinant ki pwovoke vektè ak selil vid ki pwovoke vektè yo nan menm konsantrasyon an. Chak valè yo te montre kòm mwayen ± SD (n=3), ak ba ki gen yon senbòl asterisk te siyifikativman diferan (* p < 0.05, ** p < 0.01).

Figi 5. Mc-novel_miR_145 vize McIL-17-3. (A) Yo te mete sekans McIL-17-3 30 UTR nan vektè pmiR-RB-Report™, respektivman konstwi plasmid sovaj ak plasmid mutan. Mcnovel_miR{{10}} sekans ak McIL-17-3-30 sit sib UTR ak sekans sit mutan yo te make ak makè wouj. (B) McIL-17-3-30 UTR-WT plasmid te ko-transfekte ak Mc-novel_miR{_145 imite oswa Mc-novel_miR{{2{{37} }}} inibitè nan selil HEK293. (C) Selil HEK293 yo te transfekte ak McIL-17-3-30 UTR-WT oswa kalite mutan McIL-17-3-30 UTR-MUT, ansanm ak Mc-novel_miR_145 oswa NC , pou 24 h. Aktivite luciferase la te mezire lè l sèvi avèk sistèm tès repòtè doub-luciferase la. (D) Eksperyans gradyan konsantrasyon yo te fèt pou transfeksyon Mc-novel_miR_145. Tout done yo prezante kòm mwayen ± SD soti nan omwen twa eksperyans endepandan triplike. **, p <0.01, *, p <0.05 kont kontwòl yo. (Pou entèpretasyon referans yo sou koulè nan lejand figi sa a, yo refere lektè a nan vèsyon entènèt atik sa a.)

2.6. Mc-novel_miR_145 kontwole ekspresyon McIL nan yon fason negatif-17-3

Emosit M. coruscus yo te transfekte ak imite Mc-novel_miR{_145, inibitè Mcnovel_miR{_145, ak kontwòl respektif yo, ak chanjman nan McIL{{ 5}} ekspresyon yo te evalye sou nivo transkripsyon ak pwoteyin. Jan yo montre nan Figi 6A, ekspresyon Mc-novel_miR{_145 te siyifikativman kontwole (8.83-pliye ogmantasyon) pa mimik li yo ak desann-regleman ({{14}). }}.41-pliye diminye) pa represeur li nan emosit, sa ki sijere efè efikas nan sibstans sa yo konpoze sentetik. Nan Figi 6B, ekspresyon McIL-17-3 andojèn yo te siyifikativman anpeche (0.{51-pliye diminisyon) pa Mc-novel_miR{_145 imite nan nivo transcriptional ak siyifikativman pwovoke (2.42-pliye ogmantasyon) pa Mcnovel_miR_145 inibitè. Pou envestige efè Mc-novel_miR{_145 sou ekspresyon McIL-17-3 nan nivo pwoteyin, yo te pwodui yon antikò poliklonal kont McIL-17-3. Jan yo montre nan liy 2 ak 3 nan Figi 6C, pwoteyin recombinant McIL-17-3 te eksprime avèk siksè nan E. coli. Espesifik antikò yo te egzamine ak pwoteyin moul ki soti nan emosit pa Western blot. Yo te obsève yon sèl gwoup apeprè 22 kDa, ki koresponn ak mas molekilè McIL-17-3 (liy 4 nan Figi 6C). Rezilta Western blot nan Figi 6D te montre règleman negatif McIL-17-3 nan nivo pwoteyin Mc-novel_miR_145.

FFigi 6. Mc-novel_miR_145 anpeche ekspresyon McIL-17-3 nan emosit M. coruscus. (A) Ekspresyon Mc-novel_miR{_145 te evalye pa qPCR nan emosit transfekte ak 145 mimik, 145 inibitè, ak kontwòl respektif yo. (B) Apre transfèksyon pou 24 èdtan, nivo transkripsyon McIL -17-3 yo te detèmine pa qPCR. (C) Ekspresyon recombinant, pirifikasyon, ak preparasyon antiserom pou McIL-17-3. Lane M, makè estanda pwa molekilè pwoteyin. Lane 1, kontwòl negatif (san endiksyon). Liy 2, pwovoke pwoteyin recombinant McIL-17-3. Liy 3, McIL pirifye- 17-3. Liy 4, Western blot ak antikò anti-McIL{{20}} nan emosit M. coruscus. (D) Apre transfeksyon pou 24 èdtan, nivo pwoteyin McIL -17-3 yo te detèmine pa Western blot. ** p <0.01 kont kontwòl yo

2.7. Apoptoz nan emosit

Pousantaj apoptotik emosit kat gwoup, sa vle di, NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS, ak Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS te analize pa sikometri koule lè l sèvi avèk doub tach. Apre McIL -17-3 te overexpressed, pousantaj apoptoz nan emosit defye ak LPS te siyifikativman moute-reglemante konpare ak gwoup kontwòl la (Figi 7A (a, b), B). Lè McIL-17-3 te kotransfekte ak Mc-novel_miR{_145, pousantaj apoptoz emosit ki te pwovoke pa LPS te siyifikativman diminye konpare ak McIL-17-3 transfekte pou kont li (Figi 7A( b, c), B). Kontrèman, pousantaj apoptotik emosit la te montre yon ogmantasyon remakab nan gwoup Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS konpare ak gwoup McIL-17-3+LPS (Figi 7A). (b,d), B).

Figi 7. Pousantaj apoptotik emosit la te evalye pa sikometri koule lè l sèvi avèk yodid propidium (PI) ak tach FITC-Annexin-V.

3. Diskisyon

IL-17 rekonèt kòm youn nan fanmi enpòtan sitokin pro-enflamatwa, ki ka patisipe efektivman nan patojèn diferan maladi [42]. Nan etid anvan nou an, yon omolog M. coruscus IL-17 te montre diferan ekspresyon anvan ak apre enfeksyon V. alginolyticus atravè sekans transcriptome [41], ki sijere wòl potansyèl li nan repons iminitè natirèl la nan defi bakteri. Isit la, nou karakterize homolog IL-17 sa a epi nou rele l McIL-17-3. Prediksyon nan domèn fonksyonèl te revele yon domèn IL-17 tipik, ki bay afilyasyon jèn yo idantifye kounye a ak fanmi sitokin IL-17. Nan pye bwa filojenetik la, nouvo jèn IL-17 sa a te montre yon relasyon trè sere ak IL-17- 3 ki soti nan yon lòt espès Mytilus, M. galloprovincialis. Anplis de sa, yo te pataje yon idantite trè wo 95% asid amine, e se poutèt sa nou nominasyon nouvo jèn IL-17 aktyèl la kòm McIL-17-3 pou swiv konvansyon nonmen yo itilize nan espès Mytilus yo. Fanmi IL-17 konsiste de sis manm ak senk reseptè nan imen [43], men li te fè eksperyans yon gwo ekspansyon jenetik nan envètebre maren, espesyalman nan moul [11]. Dapre sa a, done nou yo sigjere ke McIL-17-3 pa t gen rapò dirèkteman ak sèten jèn nan fanmi IL-17 imen. Pliye cysteine-knot ki sitiye nan -sheets se karakteristik tipik fanmi IL-17 [5]. Espere, prediksyon nan estrikti siperyè a te revele yon pliye sistein-ne nan McIL-17-3 pwoteyin, plis apwofondi atribisyon nan McIL-17-3 nan fanmi IL-17 cytokine. Pou plis eksplore diferansyasyon IL-17 sekans asid amine pami diferan espès, kèk IL-17 tipik mizèl ak Mus musculus IL-17-A rive IL-17-F ak Danio rerio. Yo te chwazi IL-17-1 pou IL-17-3 pou fè analiz miltip aliyman an. Rezilta yo te montre yon konklizyon enteresan ki montre pozisyon disulfid linkage IL-17s nan moul ak vertebre yo te konsistan: de lyezon disulfide sa yo te egziste ant -strands 1 ak 3, 2 ak 4, respektivman, nan moul, men sèlman ant. -seksyon 2 ak 4 nan vertebre. Nan premye ak katriyèm sit sistein yo, vertebrate IL-17 ranplase sistein ak serin; Kontrèman, nan dezyèm sit sistein la, IL-17 moul ranplase sistein ak threoninentiation nan lyezon disulfid nan moul ak vertebre, ak mekanis kache li yo pa klè epi li bezwen plis etid. Etandone polimòfis IL-17 nan moul, lyen disulfid ki genyen ant -seksyon 1 ak 3 ka pa osi fò ke sa ki ant 2 ak 4, sa ki bay yo pi gwo plastisit nan moul. De tout fason, analiz domèn fonksyonèl ak estrikti siperyè sijere ke McIL-17-3 yo idantifye kounye a se tipik nan sitokin IL{-17 mizil la epi li ka jwe yon wòl fonksyonèl menm jan ak tokay li yo nan molisk yo. Ekspresyon jèn IL-17 nan tisi imen yo varye anpil, ak kèk ki eksprime sèlman nan kèk selil ak lòt nan yon gwo kantite tisi [44,45]. Pifò nan etid yo sou molisk yo te montre ke IL-17 yo te gen yon pwofil ekspresyon konstititif [13,15,17,46,47]. Men, Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu, ak Yu [47] te montre yon rezilta enkonsistan nan C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}}, ak -6 yo te eksprime anpil nan branch C. gigas, glann dijestif, ak manto, men yo diman eksprime nan lòt tisi. Isit la, yo te jwenn transkripsyon McIL-17-3 nan tout tisi yo egzamine, sa ki sijere plizyè wòl fonksyonèl li yo nan yon varyete aktivite fizyolojik. Sepandan, nivo ekspresyon ki wo McIL-17-3 nan kèk tisi ki gen rapò ak iminitè molusk yo, tankou emosit, branchy, ak glann dijestif, sijere patisipasyon pi pre li ak repons iminitè. Apre, repons rapid li nan atak V. alginolyticus apwofondi pwen sa a. Piki V. alginolyticus te kontwole ekspresyon McIL-17-3, epi rezilta menm jan yo te obsève nan lòt IL-17 moluskan yo. Piki V. anguillarum nan C. gigas pwovoke yon ogmantasyon rapid nan abondans transkripsyon CgIL-17 nan emosit, ki sijere ke se te yon jèn iminitè faz bonè [46]. Lè C. gigas te soufri yon atak pa yon lòt patojèn, V. splendidus, nivo mRNA CgIL-17-5 nan emosit yo te siyifikativman elve [15]. Eksitasyon LPS, pi gwo eleman patojèn nan bakteri, ogmante ekspresyon PfIL-17 nan glann dijestif pèl zuit P. fucata [17]. Anplis de sa, LPS te kapab pwovoke ekspresyon CgIL-17-3 nan C. gigas [47] ak PmIL-17-2 nan P. fucata martensii [13]. Rezilta sa yo ansanm endike ke IL-17 te jwe yon wòl enpòtan nan defans iminitè moluskan kont atak bakteri. Nan etid sa a, McIL-17-3 te montre kapasite deklanchman chemen an NF-κB en. Rezilta menm jan an te obsève tou nan kèk espès molusk. Nan zuit pèl P. fucata, PfIL-17 te montre tou deklanchman chemen NF-κB nan selil HEK293 pa tès repòtè luciferase [17]. Nan C. gigas, CgIL-17-5 ankouraje aktivasyon CgMAPKs ak translokasyon nikleyè CgRel ak CgAP-1 pou ankouraje ekspresyon mRNA cytokines ak peptides anti-bakteri [15]. Yo te demontre ke mòd aksyon IL-17 baze sou inyon li nan dimè (homodimè oswa eterodimè), ki gen aktivite ki depann anpil de atachman yo ak reseptè yo (IL{-17Rs) yo. sib. Reseptè sa yo genyen yon domèn sitoplasmik konsève (SEFIR) ki kominike avèk pwoteyin adaptè yo pou kòmanse chemen transdiksyon siyal en pou aktive faktè transkripsyon tankou NF-κB ak ankouraje ekspresyon jèn iminitè ak pro-enflamatwa sib, tankou sitokin ak peptides antimikwòb. 11,48,49].

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Rezilta sa yo sijere ke IL-17 moluskan yo ka gen menm mòd aksyon ak tokay yo nan vertebre yo. Sa a bezwen konfime nan etid nan lavni. Yo te jwenn korelasyon ant miRNA ak IL-17 nan plizyè modèl maladi imen. Niimoto, et al. [50] konfime korelasyon pozitif ant ekspresyon miR-146a ak IL-17a nan selil mononikleyè san periferik ak sinovyòm ki soti nan pasyan atrit rimatoyid epi li te rezime fonksyon vital miR-146a nan diferansyasyon selil ki pwodui IL-17-. Nan pasyan psoriasis, miR-146a aji kòm yon inibitè ki pisan nan enflamasyon po IL-17-kondwi, epi nivo ki ba li yo ka kontribye nan kòmansman maladi bonè nan moun ki gen sansiblite jenetik [51]. MiR-146a ka amelyore parodontit lè li kontwole ekspresyon IL-17 epi anpeche pwopagasyon selil souch ligaman parodontal moun [52]. MiR-155 kontwole negatif ekspresyon IL-17 pou patisipe nan repons iminitè lame a nan nemoni bakteri postviral nan poumon sourit; Sourit ki anpeche miR-155 yo montre pi fò ekspresyon IL-17 nan poumon an, akonpaye pa amelyore clearance bakteri [53]. Etid sa yo sijere ke IL-17 kontwole pa plizyè miRNA e li varye selon maladi ak kalite selil [20]. Nan yon etid anvan, nou te fè yon analiz entegre nan miRNAome a ak transcriptome yo eksplore règleman an entèaktif nan miRNA-mRNA pa M. coruscus an repons a enfeksyon V. alginolyticus. Rezilta yo te prevwa ke Mc-novel_miR{_145 ta ka vize McIL-17-3 pou patisipe nan repons iminitè natirèl la nan enfeksyon bakteri [41]. Vize eksplore mekanis ki kache nan règleman Mcnovel_miR{_145 McIL-17-3 an pwofondè, yo te fè yon seri eksperyans laboratwa nan etid sa yo. Kalkil la te prevwa ke Mc-novel_miR_145 ta ka vize 30 UTR nan McIL-17-3. Egzamen repòtè luciferase sa yo ki fèt nan selil HEK293 ko-transfekte pa Mc-novel_miR{_145 imite, imite NC, inibitè, inibitè NC ak McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT repòtè plasmid plis konfime pwen sa a. Anplis de sa, Mc-novel_miR{_145 imite, imite NC, inibitè, ak inibitè NC yo te transfekte nan emosit M. coruscus pou evalye efè yo sou ekspresyon McIL-17-3 nan nivo transkripsyon ak pwoteyin. . Ekspresyon McIL-17-3 te siyifikativman anba reglemante nan Mc-novel_miR{_145 imite gwoup transfeksyon, pandan y ap siyifikativman monte-reglemante nan Mc-novel_miR la. _145 gwoup transfeksyon inhibitor, ki sijere yon règleman negatif McIL-17-3 pa Mc-novel_miR_145. Rezilta aktyèl yo te kontrè ak yon etid anvan. Nan Pinctada martensii, Tian, ​​Zheng, Huang, Jiao, ak Du [30] te jwenn ke byenke Pm-miR-29a te kapab vize IL-17, règleman an te pozitif, kòm ekspresyon IL{{ 65}} nan manto ak branch Pinctada martensii te kontwole apre twòp ekspresyon Pm-miR-29a. Etandone ke P. martensii ak M. coruscus tou de fè pati bivalv yo epi yo relativman pre relasyon, rezilta enkonsistan sa yo sijere ke règleman an nan IL-17 nan molisk yo ka varye ak miRNAs. Anplis de sa, pa gen okenn literati ki rapòte korelasyon ki genyen ant miRNA ak IL-17 nan molisk yo, epi kidonk pa gen okenn etid paralèl pou konpare rezilta aktyèl yo. Sepandan, kèk etid te rapòte vize relasyon ant miRNA espesifik ak jèn espesifik ki gen rapò ak iminitè nan molisk yo.

Pou egzanp, cgi-miR-2d ogmante fagositoz emosit zuit pa kontwole negatif CgIκB2 nan Crassostrea gigas [31]. Anplis de sa, cgi-miR-2d tou kontwole negatif ekspresyon yon sèl jèn ki tankou transpòtè kolin pou patisipe nan iminomodulasyon sofistike nan emosit zuit pandan premye etap enfeksyon an [32]. Etid sa yo omwen sijere ke miRNA yo jwe yon wòl potansyèl nan siyal iminitè natirèl lè yo vize jèn espesifik nan molisk, menm jan yo fè nan vertebre. Apre sa, nou te chèche eksplore fonksyon potansyèl entèraksyon ant Mcnovel_miR{_145 ak McIL{{10}} nan iminite natirèl M. coruscus, ak wòl yo nan LPS-pwovoke apoptoz se konsantre nan atansyon nou an. LPS se yon molekil trè pro-enflamatwa ki se yon eleman nan anvlòp ekstèn tout bakteri Gram-negatif. Yo montre LPS pwovoke apoptoz nan divès selil ak tisi, tankou makrofaj [54], selil andotelyal [55], ak poumon sourit [56]. Yon eksperyans preliminè te demontre ke ekspoze LPS nan yon konsantrasyon nominal nan 0.1 mg / mL pou 24 h siyifikativman pwovoke apoptoz nan emosit soti nan M. coruscus. Apre McIL-17-3 twòp ekspresyon, nivo apoptoz emosit M. coruscus te ogmante siyifikativman konpare ak gwoup kontwòl la, sa ki sijere ke McIL-17-3 ka ranfòse apoptoz emosit M. coruscus ki pwovoke LPS nan M. coruscus. Rezilta aktyèl yo te konsistan avèk kèk etid anvan yo. Nan netrofil imen, IL-17A te kapab diminye efè anti-apoptotik medyatè pa faktè eksitan granulocyte macrophage-koloni [57]. IL-17 pwovoke apoptoz nan selil endothelial vaskilè, ki se yon mekanis potansyèl sendwòm kardyovaskulèr egi [58]. Suppression jenetik IL-17A diminye apoptoz selil alveolatè tip II epi konsa soulaje maladi kwonik obstriktif poumon [59]. Sepandan, toujou gen kèk agiman kontrè. Lè sourit yo enfekte pa viris ansefalomyélit murin Theiler a, IL-6 ak IL{-17 sinèrji ankouraje pèsistans viral lè yo anpeche apoptoz selilè [60]. Konfli sa yo sijere ke mekanis ki kache nan apoptoz IL-17-medyatè konplèks, epi IL-17yo ka jwe fonksyon opoze selon kalite enfeksyon an.

Lè McIL-17-3 yo te ko-transfekte ak Mc-novel_miR{_145, nivo apoptoz pwovoke pa LPS te siyifikativman desann reglemante konpare ak sèlman McIL-17-3 transfekte. gwoup la, an menm tan an, nivo apoptoz la te siyifikativman kontwole apre McIL-17-3 te ko-transfekte ak Mc-novel_miR_145 inibitè. Mc-novel_miR_145 yo te montre negatif kontwole McIL-17-3, e se poutèt sa nou konkli ke McIL-17-3 agrave apoptoz emosit la pwovoke pa LPS, pandan y ap Mc-novel _miR_145 soulaje efè yo. Plizyè miRNA ki te montre yo patisipe nan apoptoz selil imen ak sourit yo te idantifye nan molisk nan dènye ane yo. Pa egzanp, miR-125b ak miR- 335 yo te jwenn nan zuit plat Ostrea edulis [21], miR-184 yo te jwenn nan emosit nan zuit Crassostrea gigas [23], ak miR{{ 26}}, -29, -96, -182, ak -193 yo te jwenn nan sistèm nève santral rejenerasyon L. stagnalis [25]. MiRNA ki gen rapò ak apoptoz sa yo idantifye atravè sekans segondè-debi ak kalkil byoloji konfime egzistans apoptoz miRNA-medyatè nan molisk yo. Chen et al. rapòte yon regilasyon miR-2d apre defi Vibrio splendidus nan emosit Crassostrea gigas. Twò ekspresyon miR-2d te gen rapò ak yon ekspresyon frape desann nan IκB2, ak yon ogmantasyon siyifikatif nan pousantaj fagositoz emosit, ki lye ak yon repwesyon nan apoptoz [31]. Rezilta yo te konsistan ak etid aktyèl nou an, kolektivman, sanble yo vle di ke miRNAs fè egzèsis yon fonksyon inhibition sou apoptoz selil nan molisk yo. An reyalite, pi fò nan miRNA ki gen rapò ak apoptoz nan imen yo te montre efè inhibition sou apoptoz. MiR -146 pwoteje selil A549 ak H1975 soti nan apoptoz ak blesi enflamasyon ki pwovoke LPS atravè Sirt1 ki kontwole monte, kidonk bloke chemen NF-κB ak Notch [61]. Anplis de sa, miR -146 atenye apoptoz epatosit ki pwovoke iradyasyon ak LPS atravè anpèchman chemen TLR4 la [62]. MiR -93 inibit apoptoz chondrocyte nan osteoartrit pa vize chemen siyal TLR4/NF-κB [63]. MiR-129-5p soulaje blesi nan epinyè nan sourit atravè siprime apoptoz atravè chemen HMGB1/TLR4/NF-κB [64]. Sepandan, toujou gen kèk miRNA espesifik ki montre aksyon ranfòse sou apoptoz. Pou egzanp, miR -203 yo te jwenn akselere apoptoz LPS-induit pa vize PIK3CA nan selil epitelyal alveol [65]. Rezilta sa yo sijere konpleksite mekanis ki kache nan apoptoz miRNA-medyatè.

4. Materyèl ak Metòd

4.1. Konsepsyon eksperimantal

Premyèman, McIL-17-3 te idantifye ak karakterize apati M. coruscus atravè analiz bioenfòmatik. Apre sa, distribisyon tisi nan transkripsyon McIL-17-3 ansanm ak repons li yo nan defi bakteri yo te evalye pa tès PCR an tan reyèl (qPCR). Apre sa, asosyasyon ki genyen ant McIL-17-3 ak Mc-novel_miR{_145 te detèmine pa analiz repòtè luciferase ki fèt nan selil HEK293 ak emosit M. coruscus. Anplis de sa, yo te evalye wòl fonksyonèl yo nan apoptoz LPS-induit pa sikometri koule.

4.2. Dlo lanmè atifisyèl

Apre twa jou aere dlo tiyo minisipal yo, yo te ajoute kristal lanmè enstantane (Haiding LTD, Ji'an, Lachin), byen brase, epi fonn pou rive nan yon salinité 30‰. Dlo lanmè atifisyèl konfigirasyon an bezwen aere pou 2 èdtan anvan yo itilize.

4.3. Bèt

M. coruscus ki gen kokiy epè (longè kokiy, 9.82 ± 0.53 cm; lajè kokiy, 4.68 ± 0.45 cm; pwa mouye, 71.2 ± 2.7 g) te achte nan men Donghe mache. nan Zhoushan, pwovens Zhejiang, Lachin. Tout moul yo te kenbe nan tank ki te ranpli avèk yon ASW apeprè 25 ◦C ak salinite 30 ‰ pou plis pase yon semèn anvan eksperyans ki vin apre yo.

4.4. McIL-17-3 cDNA Idantifikasyon

Yo te klonaj yon homològ IL-17 (McIL-17-3) an silico apati transkriptòm tout longè M. coruscus (nimewo aksesyon: PRJNA798880, F01_transkripsyon_12404). Pwosedi Blast la te fèt pou predi sekans asid amine McIL-17-3, ki te swiv pa analiz domèn fonksyonèl ak SMART ak evalyasyon relasyon filogenetik ak MEGA-X. Aliyman miltip la te fèt lè l sèvi avèk pwosedi ClustalW la. Yo te itilize modèl Swis la ak pisin lan pou predi estrikti siperyè pwoteyin McIL-17-3 la. Pwosedi detaye a te dapre etid anvan nou an [66].

4.5. Kantitatif an tan reyèl PCR Assays

Esas PCR an tan reyèl (qPCR) se yon zouti pwisan pou detekte ak mezire nivo ekspresyon jèn yo. Isit la, yo te evalye distribisyon tisi McIL-17-3 lè l sèvi avèk metòd qPCR la. Anplis de sa, qPCR te detekte tou chanjman nan ekspresyon McIL-17-3 mRNA an repons a enfeksyon bakteri. Yo te detèmine pwofil distribisyon tisi McIL-17-3 nan branch, manto, glann dijestif, gonad, misk adductor, ak emosit lè l sèvi avèk qPCR pwograme a 95 ◦C pou 10 minit, ki te swiv pa 40 sik 95. ◦C pou 10 s, 60 ◦C pou 45 s. Tisi sa yo te diseke soti nan nèf moun moul ak pisin ansanm pou soulaje diferansyasyon endividyèl. Nan eksperyans nan defi bakteri, vivan V. alginolyticus te itilize kòm stimuli iminitè yo. Yo te enjekte yon volim 100 µL bakteri ki fonn nan dlo lanmè (1 × 108 CFU mL-1) nan adductor moles. Pa gen okenn moul sou fòm piki yo te itilize kòm kontwòl la. Nèf moul yo te pran echantiyon owaza nan chak gwoup nan 0, 3, 6, 12, 24, ak 36 èdtan apre defi (hpc). Emosit ki soti nan twa moul yo te mete ansanm pou yo konsidere kòm yon echantiyon, e te gen twa echantiyon pou chak pwen tan. MicroRNAs yo te ekstrè lè l sèvi avèk twous ekstraksyon miRNA (HaiGENE, Cat No.: B1802), epi cDNA a te sentèz lè l sèvi avèk miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Twous (Tiangen, Cat No.: 4992786) epi qPCR te fèt lè l sèvi avèk la. miRcute Plus miRNA qPCR Twous (Tiangen, No Cat.: 4992887). Jèn U6 ak -actin yo te itilize kòm referans entèn pou qPCR ak miRNAs qPCR, respektivman. Yo bay pè prim espesifik yo itilize nan eksperyans sa a nan Tablo 1. Yo te mezire nivo ekspresyon relatif yo ak metòd 2−∆∆Ct [67].

Tablo 1. Yo te itilize pè primè PCR nan etid prezan an.

4.6. Kilti Selil

Selil mamifè HEK293 yo (RiboBio Ltd., Guangzhou, Lachin) yo te anplwaye pou fè tès repòtè luciferase yo pou detèmine deklanchman en a pa McIL- 17-3 ak asosyasyon ki genyen ant Mc-novel_miR{{ 4}} ak McIL-17-3. Selil HEK293 yo te kiltive nan mwayen OPTI-MEM (GIBCO) nan 37 ◦C, 5% CO2. Pou plis eksplore règleman McIL-17-3 pa Mc-novel_miR{_145 ak wòl fonksyonèl yo nan apoptoz LPS pwovoke, emosit M. coruscus yo te rekipere nan misk adductor chak. moul ak yon 0.5 mm dyamèt (25 G) zegwi jetab ki gen 0.5 mL nan anticoagulant la. Emosit yo te kolekte pa santrifujasyon pou 5 min nan 3000 rpm, 4 ◦C, ak 0.25% tripsin (Solarbio) te ajoute. Emosit yo te sispann nan yon mwayen L-15 ki gen 15% serom fetis bovin (Solarbio) ak kiltive nan 26 ◦C ak 5% CO2.

4.7. Sentèz miRNA mimik ak inibitè

GenePharma (Shanghai) te konpoze Mc-novel_miR_145, inibitè, ak nukleotid kontwòl. Sekans yo se jan sa a: Mc-novel_miR_145 imite, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Mc-novel_miR_145 inhibitor, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (chimikman modifye pa 20 Ome); kontwòl negatif imite, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; ak inibitè kontwòl negatif, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (chimikman modifye pa 20 Ome).

4.8. Analiz repòtè lisiferaz

Lisiferase repòtè tès yo lajman itilize pou etidye ekspresyon jèn ak aktivite regilasyon. Kantite limyè ki pwodui se pwopòsyonèl ak kantite anzim luciferase ki pwodui, ki an vire reflete aktivite eleman regilasyon an. Aktivite luciferase a Lè sa a, mezire lè l sèvi avèk yon luminometer, ak rezilta yo analize ak entèprete pou detèmine aktivite regilasyon nan eleman etidye a. Yo te itilize tès repòtè lisiferaz pou analize deklanchman McIL{{0}}. Nan eksperyans sa a, plasmid pEGFP-McIL-17-3 (0.1, 0.5, ak 1.0 µg/pi) ansanm ak pGLNF-κb- plasmid repòtè luc (0.25 µg / byen) yo te kotransfekte nan selil HEK293 lè l sèvi avèk Lipo6000TM pou 24 èdtan. Yo te itilize yon plasmid pEGFP-N1 vid kòm kontwòl la. Aktivite Luciferase yo te mezire lè l sèvi avèk Sistèm Essay Reporter Dual-Luciferase® (Promega, Madison, WI, USA) dapre spesifikasyon la, ak Renilla luciferase itilize kòm entèkontwòl la. Mc-novel_miR{_145 vize McIL-17-3 te konfime tou pa tès repòtè luciferase. Kalkil byoenfòmatik la te prevwa ke Mc-novel_miR_145 ka vize 30 -UTR McIL-17-3, epi answit te klonaj 30 -UTR McIL{{ 29}} nan vektè repòtè luciferaz pmiR-RB-ReportTM pou konstwi plasmid repòtè McIL-17-3-30 UTR-WT sovaj la. Yo te konstwi vektè repòtè McIL-17-3-30 UTR-MUT ki gen mutan an pa mitasyon nukleotid la nan 1023–1040 sit: TCCGAAGCGCTTTTTCTGG rive AGGCTTCGCGAAGACC. RNA oligo (Mc-novel_miR{_196 NC, mimic, NCi, inhibitor) te transfekte ansanm ak McIL-17-3- 3 0 UTR-WT oswa McIL-17-3-30 UTR-MUT nan HEK293 selil ki itilize Lipo6000TM.

4.9. Ekspresyon recombinant, pirifikasyon ak preparasyon antiserom

Pou evalye efè Mc-novel_miR{_145 sou ekspresyon McIL-17-3 pwoteyin, yo te prepare yon antiserom McIL-17-3. Fragman cDNA ki kouvri ankadreman lekti ouvè (ORF) McIL-17-3 te anplifye ak yon sèl pè primè espesifik (Tablo 1) epi mete nan pET-32yon vektè. Plasmid recombinant pET-32a-McIL{{{10}} te transfòme nan Escherichia coli (DE3) (Takara) epi enkube nan mwayen LB (ki gen 50 mg L-1). kanamisin) nan 37 ◦C ak souke nan 130 rpm pou 4 èdtan. Apre dansite optik la te rive nan absòbe 0.6 nan 600 nm, yo te ajoute izopropil-beta-D-thiogalactopy andedan (IPTG) ak yon konsantrasyon final 1 mM nan solisyon bakteri an pou pwovoke ekspresyon McIL recombinant{ {24}} pwoteyin (rMcIL-17-3). Apre enkubasyon nan 37 ◦C pou 6 èdtan, yo te santrifuje mwayen an nan 8000 rpm pou 30 min pou kolekte bakteri yo, ki te swiv pa sispansyon nan tanpon TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0). rMcIL -17-3 te pirifye pa asid Ni-nitrilotriacetic (NI-NTA) chromatografi afinite, ak pwoteyin ki pirifye a te dyalize soti nan imidazol pou 24 èdtan. Pwoteyin ki te lakòz yo te izole pa diminye 12% SDS-polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE). Pwoteyin pirifye a te rpliye nan yon tanpon gliserin gradyan urea-TBS (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM redwi glutatyon, 10% gliserin, 0.2 mM oksid glutatyon, yon konsantrasyon gradyan ure nan 6, 4, 3, 2). , 1, ak 0 M ure nan chak gradyan, pH 7.4, chak gradyan nan 4 ◦C pou 12 h). Apre sa, yo te itilize pwoteyin ki te lakòz yo pou iminize 6-sourit ki gen yon semèn pou jwenn antikò poliklonal.

4.10. Western Blotting

Echantiyon pwoteyin yo te ekstrè soti nan emosit ak RIPA lysis tanpon (Beyotime), ak Lè sa a, konsantrasyon an te detekte ak yon twous BCA. Apre izolasyon pa SDS-PAGE, yo te transfere pwoteyin nan nan manbràn PVDF ak sele pa 5% poud lèt ekreme nan TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH. 8.0), ki te swiv pa antikò kont McIL-17-3 enkubasyon lannwit lan. Imedyatman, manbràn yo te enkube ak yon solisyon dilye nan antikò kabrit anti-sourit IgG ak konjige fosfataz alkalin (Thermo Fisher Scientific, Cat No.: 31324) nan tanpon an segondè dilution antikò (Beyotime, P0258) pou 3 èdtan. Finalman, sistèm deteksyon ECL la te detekte pwoteyin iminoreaktiv yo.

4.11. Apoptoz

Apoptoz emosit yo te evalye lè l sèvi avèk sitometri koule dapre manyèl la nan FITC-Annexin-V Apoptosis Deteksyon Twous la (Beyotime). Yon ti tan, yo te trete emosit yo kolekte pou 24 èdtan ak LPS (0.1 mg/mL), 20 nM pEGFP-McIL-17-3 plasmid, Mc roman_miR{{9} } imite, ak Mc-novel_miR_145 inibitè. Apre yo fin lave ak PBS, selil yo te re-sispann nan mwayen L15 nan yon konsantrasyon final nan 1 × 106 selil mL-1 epi yo te tache ak FITC-Annexin-V ak PI lè yo te enkube nan tanperati chanm pou 25 min nan fè nwa a. . Finalman, yo te itilize enstriman sikometri koule (Beckman CytoFLEX FCM) pou detekte apoptoz selilè, epi done yo te analize lè l sèvi avèk lojisyèl FlowJoTM 10. 4.12. Analiz estatistik Rezilta eksperimantal yo te prezante kòm mwayèn ± devyasyon estanda (SD). Rezilta yo te trete lè l sèvi avèk yon analiz ANOVA de-fason nan divèjans ak tès konparezon miltip Tukey a, epi yo te itilize lojisyèl Origin2021 pou analize done yo ak konstwi figi yo.

cistanche plant-ogmante sistèm iminitè

5. Konklizyon

Nan etid sa a, yo te idantifye yon nouvo IL-17 homolog, McIL-17-3, ki soti nan M. coruscus epi yo te jwenn yon wòl enpòtan nan defans iminitè moluskan kont atak bakteri. Anplis, li te dekouvri ke McIL-17-3 negatif reglemante pa Mc-novel_miR{_145, ki kontribye nan patisipasyon li nan apoptoz LPS-induit. Rezilta etid sa a bay bonjan enfòmasyon sou wòl regilasyon IL-17 nan repons iminitè moul yo epi mete aksan sou potansyèl RNA ki pa kode nan reglemante mekanis defans iminitè envètebre yo. Sepandan, li enpòtan sonje ke kèk limit egziste nan etid sa a. Espesyalman, mekanis ki kache mòd aksyon McIL-17-3 pa te etidye epi li mande plis envestigasyon. Anplis de sa, etid sa a te konsantre sèlman sou entèraksyon ki genyen ant Mc-novel_miR{_145 ak McIL{-17-3 epi li pa t eksplore patisipasyon posib lòt miRNA nan repons iminitè a. An jeneral, etid sa a mete aksan sou wòl enpòtan RNA ki pa kodaj nan mekanis defans iminitè ak sijere ke modulasyon yo ta ka sèvi kòm yon estrateji potansyèl pou terapi vize pou divès maladi.

Referans

1. Medzhitov, R.; Janeway, C., Jr. Iminite natirèl. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]

2. Lacy, P.; Stow, JL Liberasyon Cytokine nan selil iminitè natirèl yo: Asosyasyon ak divès chemen trafik manbràn. San J. Am. Soc. Hematol. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]

3. Dinarello, CA Proinflammatory cytokines. Pwatrin 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]

4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Sistèm iminitè ak repons iminitè nan pwason ak wòl yo nan etid iminite konparatif: Yon modèl pou òganis ki pi wo. Imunol. Lett. 2012, 148, 23–33. [CrossRef]

5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, P.; Maruoka, M.; Mao, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17 adopte yon pliye ne sistin: Estrikti ak aktivite yon nouvo sitokin, IL-17F, ak enplikasyon pou lyezon reseptè yo. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [CrossRef]

6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Rast, JP IL17 faktè yo se regilatè byen bonè nan epithelium nan zantray pandan repons enflamatwa a nan Vibrio nan lav oursin lan. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]

7. Cua, DJ; Tato, CM Innate IL-17-pwodwi selil: Sentinèl sistèm iminitè a. Nat. Rev Immunol. 2010, 10, 479–489. [CrossRef]

8. Mills, KH IL-17 ak IL-17-pwodwi selil nan pwoteksyon kont patoloji. Nat. Rev Immunol. 2022, 10, 479–489. [CrossRef]

9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Repètwa iminitè iminitè a kode nan genomic oursin wouj violèt. Dev. Biol. 2006, 300, 349–365. [CrossRef]

10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS Genòm poulp la ak evolisyon nouvote neral ak mòfolojik sefalopod yo. Nature 2015, 524, 220–224. [CrossRef]

11. Saco, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. Evolisyon ak divèsite interleukin-17 mete aksan sou yon ekspansyon nan envètebre maren ak wòl konsève li nan iminite mukozal. Devan. Imunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. Varyasyon masiv prezans-absans jèn fòme yon pan-genom ouvè nan moul Mediterane a. Genomic Biol. 2020, 21, 1–21. [CrossRef]

13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Evolisyon ak analiz fonksyon entèleukin-17 jèn ki soti nan Pinctada fucata martensii. Pwason Shellfish Immunol. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Q.; Xiao, G.; Hu, G.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. Interleukin-17D medyatè Vibrio harveyi chanjman ki gen rapò ak enfeksyon nan Tegillarca granulosa atravè aktivasyon nan pwoteyin activator 1 nan vivo. Aquaculture 2023, 566, 739178. [CrossRef]

15. Lv, X.; Solèy, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 kontwole ekspresyon mRNA efè iminitè yo nan pwovoke fosforilasyon CgMAPK yo ak translokasyon nikleyè CgRel ak CgAP-1 nan zuit Pasifik Crassostrea gigas. Dev. Konp. Imunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. Wang, L.; Solèy, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 kontwole ekspresyon IL17-4 ak IL17-5 nan zuit pasifik Crassostrea gigas. Pwason Shellfish Immunol. 2020, 97, 554–563. [CrossRef]

17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; Li, M.-X. Interleukin-17 nan zuit pèl (Pinctada fucata): klonaj molekilè ak karakterizasyon fonksyonèl. Pwason Shellfish Immunol. 2013, 34, 1050–1056. [CrossRef]

18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, yon ansyen sitokin enflamatwa nan Crassostrea gigas ki montre fonksyon eterojenite konpare ak molekil interleukin17 vertebrate. Dev. Konp. Imunol. 2015, 53, 339–348. [CrossRef]

19. Denli, AM; Tèt, BB; Plasterk, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Pwosesis mikroRNA prensipal pa konplèks mikropwosesè a. Nati 2004, 432, 231-235. [CrossRef]

20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Règleman IL-17 nan maladi otoiminitè pa faktè transcriptional ak microRNAs. Devan. Genet. 2015, 6, 236. [CrossRef]

21. Martín-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. Wòl microRNAs nan pwosesis iminite nan plat zuit Ostrea edulis kont bona mioz. Enfekte. Genet. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]

22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, X.; Que, H.; Zhang, G. Idantifikasyon microRNAs konsève ak roman nan zuit Pasifik Crassostrea gigas pa sekans gwo twou san fon. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]

23. Zhou, Z.; Wang, L.; Song, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. Idantifikasyon ak karakteristik microRNA ki gen rapò ak iminitè nan emosit nan zuit Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]

24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Potansyèl règleman microRNA nan jèn ki gen rapò ak iminitè nan emosit envètebre. Sci. Total Environ. 2018, 621, 302–307. [CrossRef]

25. Walker, SE; Spencer, GE; Necakov, A.; Carlone, RL Idantifikasyon ak karakterizasyon microRNAs pandan rejenerasyon asid retinoik nan yon sistèm nève santral moluskan. Ent. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. MicroRNA-medyatè repons estrès nan espès bivalv. Ekotoksikòl. Anviwònman. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Dekouvèt ak konpreyansyon fonksyonèl nan miRNAs nan mollusks: Yon apwòch profilage-lajè genòm. RNA Biol. 2021, 18, 1702–1715. [CrossRef]

28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Fouye nan miRNAomes bivalv: Ant konsèvasyon ak inovasyon. Philos. Trans. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]

29. Solèy, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, ​​J.; Liu, Z. MicroRNA ekspresyon siyati nan misk yo adductor striated ak lis nan Yesso petwòl Patinopecten yessoensis. Genomics 2022, 114, 110409. [CrossRef]

30. Tian, ​​R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a te patisipe nan fòmasyon nacre ak repons iminitè nan vize Y2R nan Pinctada martensii. Ent. J. Mol. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [CrossRef]

31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. Yon microRNA espesifik envètebre ak iminitè-reponn ogmante fagositoz emosit zuit pa vize CgIκB2. Sci. Rep. 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. Yon miRNA envètebre-espesifik vize ansyen sistèm kolinerjik neroendokrin nan witr. Louvri Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]

33. Chen, H.; Xin, L.; Chante, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. Yon norepinephrine-responsive miRNA dirèkteman ankouraje ekspresyon CgHSP90AA1 nan emosit zuit pandan desiccation. Pwason Shellfish Immunol. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]

34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Yon calmodulin ki vize pa miRNA echafod659_26519 kontwole ekspresyon IL-17 nan repons iminitè bonè nan zuit Crassostrea gigas. Dev. Konp. Imunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 modile aktivite anti-bakteri coelomocytes ak priming LPS atravè vize Tollip nan Apostichopus japonicus. Pwason Shellfish Immunol. 2015, 45, 431–436. [CrossRef]

36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 modile pete respiratwa nan Apostichopus japonicus coelomocytes atravè vize reseptè Toll-like. Dev. Konp. Imunol. 2016, 65, 377–381. [CrossRef]

37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a kontwole apoptoz coelomocytes nan konkonb lanmè Apostichopus japonicus atravè vize Aj14-3-3ζ nan vivo. Pwason Shellfish Immunol. 2017, 69, 211–217. [CrossRef]

38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 lyen metabolis lipid ak apoptoz selil nan Apostichopus japonicus ki defye bakteri atravè vize CTRP9. Devan. Imunol. 2017, 8, 263. [CrossRef]

39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 soti nan Apostichopus japonicus siprime apoptoz coelomocyte aji kòm miR-92yon eponj kontwole ekspresyon Bax an repons a enfeksyon Vibrio splendidus. Aquaculture 2023, 562, 738812. [CrossRef]

40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; Li, J.; Xu, X. Yon MicroRNA-1–Medyate anpèchman nan chemen NF-κB pa chemen JAK-STAT nan Envertebrate Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [CrossRef]

41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. Analiz entegre nan miRNAome ak transcriptome revele règleman rezo miRNA-mRNA nan Vibrio alginolyticus ki enfekte epè koki moul Mytilus coruscus. Mol. Imunol. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]

42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martín, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Wòl kritik interleukin (IL)-17 nan maladi enflamatwa ak iminitè: Yon revizyon mete ajou nan prèv la konsantre nan konfli. Otoiminitè. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. IL-17 fanmi sitokin. J. Alèji Clin. Imunol. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]

44. Starnes, T.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. dènye kri: IL-17D, yon nouvo manm nan fanmi IL-17, stimul pwodiksyon sitokin ak inibit emopoyez. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]

45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. IL-17 fanmi cytokine. Vitam. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]

46. ​​Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Akimilasyon rapid nan yon transkripsyon omològ interleukin 17 nan emosit Crassostrea gigas apre ekspoze bakteri. Dev. Konp. Imunol. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]

47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Karakterizasyon jenomik ak analiz ekspresyon senk nouvo jèn IL-17 nan zuit Pasifik la, Crassostrea gigas. Pwason Shellfish Immunol. 2014, 40, 455–465. [CrossRef]

48. Gaffen, SL Estrikti ak siyal nan fanmi reseptè IL-17. Nat. Rev Immunol. 2009, 9, 556–567. [CrossRef]

49. Hata, K.; Andoh, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 stimul repons enflamatwa atravè NF-κB ak chemen kinaz MAP nan myofibroblasts kolon imen. Am. J. Fizyol. -Gastrointest. Fwa Physiol. 2002, 282, G1035–G1044. [CrossRef]

50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MicroRNA-146a eksprime nan entèleukin-17 ki pwodui selil T nan pasyan atrit rimatoyid. BMC Musculoskelet. Dezòd. 2010, 11, 1–11. [CrossRef]

51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a siprime IL-17-medyatè enflamasyon po epi li se jenetikman ki asosye ak psoriasis. J. Alèji Clin. Imunol. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]

52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG microRNA-146a diminye IL-17 ak IL{-35 epi anpeche pwopagasyon selil souch ligaman parodontal imen yo. J. Selil. Byochim. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]

53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 kontwole repons iminitè lame a nemoni bakteri postviral atravè chemen IL-23/IL{-17. Am. J. Fizyol. -Sèlil poumon. Mol. Fizyol. 2016, 310, L465–L475. [CrossRef]

54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS pwovoke apoptoz nan makrofaj sitou atravè pwodiksyon otokrin TNF-. San J. Am. Soc. Hematol. 2000, 95, 3823–3831.

55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Mekanis bakteri lipopolysaccharide-induit endothelial apoptoz. Am. J. Physiol.-Sèlil poumon. Mol. Fizyol. 2003, 284, L899–L914. [CrossRef]

56. Kwiv, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA Chronic LPS rale lakòz chanjman anfizèm nan poumon sourit ki asosye ak apoptoz. Am. J. Respir. Selil Mol. Biol. 2008, 39, 584–590. [CrossRef]

57. Dragon, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 atténue efè anti-apoptotik GM-CSF nan netrofil imen. Mol. Imunol. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]

58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Ma, C.; Zhang, L. IL-17 pwovoke apoptoz nan selil endothelial vaskilè-Yon mekanis potansyèl pou sendwòm kardyovaskulèr imen egi. Clin. Imunol. 2011, 141, 152–160. [CrossRef]

59. Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. Suppression jenetik IL-17A diminye enflamasyon lafimen sigarèt pwovoke ak apoptoz selil alveolatè tip II. Am. J. Fizyol. -Sèlil poumon. Mol. Fizyol. 2014, 306, L132–L143. [CrossRef]

60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS Interleukin-6 (IL-6) ak IL{-17 sinèrji ankouraje pèsistans viral nan anpeche apoptoz selilè ak cytotoksik fonksyon selil T. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [CrossRef]

61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA-146 pwoteje selil A549 ak H1975 kont apoptoz LPS-induit ak blesi enflamasyon. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]

62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p diminye deklanchman selil epatik stellate ki pwovoke ak LPS ak apoptoz epatosit atravè anpèchman chemen TLR4. Lanmò selil Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]

63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 inibit apoptoz chondrocyte ak enflamasyon nan osteoartriti pa vize chemen siyal TLR4/NF-κB la. Ent. J. Mol. Med. 2019, 43, 779–790. [CrossRef]

64. Wan, G.; Yon, Y.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p soulaje blesi nan mwal epinyè nan sourit atravè siprime apoptoz la ak repons enflamatwa atravè chemen HMGB1/TLR4/NF-κB. Biosci. Rep. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]

65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. MicroRNA-203 akselere apoptoz nan selil epithelial alveol ki ankouraje LPS yo lè li vize PIK3CA. Byochim. Biophys. Res. Komin. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]

66. Qi, P.; Tang, Z. Molekil Nrf2 la deklannche defans antioksidan kont ekspoze egi benzo(a)pyrene nan mytil epè koki Mytilus coruscus la. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]

67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Analize done PCR an tan reyèl pa metòd konparatif CT la. Nat. Pwotok. 2008, 3, 1101–1108. [CrossRef]