Ekspresyon nan imunoglobulin G nan selil epitelial imen proximal tubulaires

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG et al

Résumé. Pwoksimaltubulèrselil epitelyal (PTEC yo) gen karakteristik iminitè natirèl epi pwodui faktè pro-enflamatwa, chemokin, ak konpozan konpleman ki kondwi tranzisyon epithelial-mesenchymal (EMT). Etid anvan nou yo te revele ke selil mesanjial imen ak podosit yo te kapab fè sentèz ak sekrete imunoglobulin (Ig) A ak IgG, respektivman. Objektif etid la se te evalye ekspresyon Ig nan PTEC yo. Premyèman, IgG te detekte nan sitoplasm la, manbràn selilè a, ak lumèn nanPTEC yonan cortical ren nòmal la paimunohistochimi. Dezyèmman, yo te detekte transkripsyon jèn Ig ak rekonbinasyon V (D) J nan PTEC sèl pa PCR enbrike ak sekans Sanger. Twazyèmman, Ig, Igκ, ak Igλ te detekte klèman nan yon liy PTEC imòtalize (HK-2) pa imunostaining ak Western blotting, nan ki RP215 (yon antikò ki majorite mare ak IgG ki pa sòti nan selil B) yo te itilize. Anplis de sa, transkripsyon jèn Ig, Igκ, ak Igλ, konsèvatif V(D)J rekonbinasyon nan rejyon varyab Ig, recombinasyon aktive jèn 1/2 ak aktivasyon-induit cytidine deaminase yo tout te detekte nan selil HK-2. Done sa yo sijere ke PTEC yo ka eksprime IgG nan yon fason ki sanble ak selil B yo. Anplis de sa, ekspresyon IgG te kontwole pa TGF-1 epi li ka patisipe nan EMT.

Mo kle:proximaltubulèrselil epitelyal, selil sèl, HK-2, IgG, tranzisyon epitelyal-mesenchymal

Cistanche tubulosa anpeche maladi ren, klike la a pou jwenn echantiyon an

Entwodiksyon

Pwoksimaltubulèrselil epitelyal (PTEC yo) se kalite selil ki pi abondan nanrenepi yo gen yon wòl enpòtan nan reparasyon ren ak/oswa pwogresyon maladi ren kwonik yo. PTEC yo egzèse fonksyon iminolojik lè yo eksprime plizyè reseptè Toll-like (TLR), tankou TLR 1, 2, 3, 4, ak 9 (1,2), ak molekil ki asosye ak fonksyon selil ki prezante antijèn, tankou MHCII, CD74, CD80. , ak CD86 (3). Karakteristik iminitè natirèl sa yo nan PTEC yo pèmèt yo aji kòm sekouris iminitè nan yon pakèt estimilis, ak pwodiksyon an konsekan ak lage nan medyatè byoaktif, ki gen ladan sitokin proenflamatwa, chemokin, ak konpozan konpleman, ki kondwi enflamasyon entèrstisyal ak fibwoz (4). PTEC yo eksprime tou reseptè Fc neonatal yo epi prezève kapasite espesifik obligatwa pH-depandan ak transsitoz imunoglobulin (Ig) G (5). Sepandan, nan pi bon konesans nou an, li rete enkoni si PTEC yo eksprime Igs.

Li te deja sipoze ke Ig yo pwodui sèlman pa selil B ki gen matirite ak selil plasma e ke Ig yo aji kòm antikò yo rekonèt ak netralize divès patojèn. Sepandan, teyori sa a te defye nan dènye deseni yo, kòm prèv ogmante rapòte ke Ig, ki gen ladan IgA, IgG, ak IgM, ka pwodwi ak sekrete pa selil ki pa B, tankou selil kansè epitelyal imen (6,7) ak selil nòmal ki pa B yo (8,9), osi byen ke nan sit iminitè privilejye yo, tankou je yo (10), newòn santral (11,12), plasenta (13), ak tèstikul la ak epididim (14)

Menm jan ak Ig ki sòti nan selil B (B-Igs), ki pa B-Ig yo tou se pwodwi transkripsyon jèn Ig ak reyajman epi montre modèl rekonbinasyon V(D)J klasik ak adisyon nukleotid nan junctions yo ak ipèmutasyon somatik (7, 11,14). Kontrèman ak B-Igs, ki pa B-Ig yo montre modèl recombination V(D)J limite ak mwens divèsite (7). Fonksyonèlman, ki pa B-Ig yo pa sèlman egzèse aktivite natirèl antikò nan po a ak mukoza (8), men yo ka aji tou kòm faktè kwasans pou ankouraje pwopagasyon selilè ak adezyon, epi yo ka amelyore inisyasyon ak metastaz kansè nan lè yo mare nan entegrin. 15-17). Pou egzanp, RP215 rekonèt kansè IgG egzekite fonksyon onkojenik li yo lè li kominike avèk konplèks integrin 6 4 epi aktive chemen FAK ak Src (15).

Etid anvan nou an te demontre ke selil mesangial (18) ak podocytes (19) ka fè sentèz ak sekrete IgA ak IgG, epi patisipe nan kwasans selil ak adezyon selil nan vitro. Etid prezan an te vize pou evalye nivo ekspresyon Ig nan PTEC yo epi mennen ankèt sou wòl potansyèl li nan tranzisyon epithelial-mesenchymal (EMT).

Efè cistanche: benefis nan ren

Materyèl ak metòd

Kilti selil ak tretman.Yo te achte yon liy PTEC imòtalize HK-2 nan American Type Culture Collection. Selil HK-2 yo te kiltive nan DMEM/F12 ki te konplete ak 100 U/ml penisilin, 0.1 mg/ml streptomycin (tout Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), ak 10 pousan serom fetal bovine (FBS); Orijin Ostralyen; Biological Industries USA, Inc.) nan 37˚C nan yon atmosfè ki genyen 95 pousan lè ak 5 pousan CO2. Pou evite entèferans Ig nan FBS, yo te ranplase mwayen an ak yon mwayen san serom 24-48 èdtan anvan rekòlte selil yo. Selil HK-2 yo te trete ak diferan konsantrasyon (2, 5, ak 10 ng/ml) TGF-1 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA).

Single PTEC izòlman ak sentèz cDNA.Yo te jwenn yon echantiyon ren imen nan tisi kortik nòmal makroskopikman nan yon pasyan (gason, 31 ane fin vye granmoun) sibi nefrektomi kòm yon rezilta nan karsinom ren san malfonksyònman ren evidan. Yo te prepare yon sispansyon yon sèl selil lè yo dijere cortical ren an ak 1 mg/ml kolagenaz I (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) nan 37˚C pou 20 min. PTEC yo te klase lè l sèvi avèk phycoerythrin (PE)-konjige anti-CD10 (chat No. 312203) ak allophycocyanin (APC)-konjige anti-CD13 (cat. No. 301705; tou de BioLegend, Inc.) pa klasman selil fluoresans-aktive ( Sistèm Lòd Espesyal BD FACSAria II) jan sa te dekri deja (20). Yo te itilize antikò kontwòl izotip ki koresponn yo (chat. No. 400111 ak 400119; tou de BioLegend, Inc.) pou eskli tach ki pa espesifik. Doub selil vivan ki gen etikèt pozitif yo te izole kòm PTECs. Yo te chwazi yon sèl PTEC manyèlman anba yon mikwoskòp limyè Envèse lè l sèvi avèk yon pipèt kapilè epi yo te transfere nan yon tib PCR 0.2-ml mens ki gen tanpon lysis (21). Single PTEC RNA ekstraksyon ak sentèz cDNA yo te pote soti dapre metòd deja dekri (21). Yon total de senk sèl PTEC yo te itilize pou detekte transkripsyon jèn Ig ak reyajman.

PCR anplifikasyon.RNA total yo te ekstrè nan selil HK-2, selil mononikleyè san periferik [PBMCs, izole nan yon donatè fi ki gen 31 an ki an sante lè l sèvi avèk Ficoll (chat No. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] ak cortical ren (ki soti nan menm pasyan an itilize nan izolasyon PTEC sèl) lè l sèvi avèk TRIzol® reyaktif (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), epi yo te evalye konsantrasyon RNA a lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt NanoDrop (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Answit, yo te transkri 2 µg total de RNA nan cDNA lè l sèvi avèk RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (cat. No. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Yo te fè PCR lè l sèvi avèk primè ki vize rejyon konstan Ig, Igκ, Igλ, ak deaminaz sitidin ki pwovoke deklanchman (AID). Yo te fè nich PCR pou anplifye rejyon varyab Ig, pwoteyin ki gen rapò ak reseptè lipoprotein ba-dansite 2 (LRP2), ak jèn aktive recombination (RAG)1 ak RAG2. Pwodwi PCR yo te separe pa elektwoforèz sou yon jèl agarose 1.0 pousan epi yo te vizyalize lè l sèvi avèk GelRed (chat. No. 41003; Biotium, Inc.). Jadendanfan yo nan AID, RAG1/2, ak rejyon yo konstan nan Ig, Igκ, Igλ yo itilize nan etid sa a refere a Jadendanfan Jing et al (19). Jadendanfan yo nan rejyon varyab Ig yo refere a premye yo itilize pa van Dongen et al (22). Lòt primè yo itilize pou PCR yo te endike nan Tablo SI. Kondisyon thermocycling yo ki nan lis nan Tablo SII.

Sanger sekans ak analiz done sekans.Pwodwi PCR nan rejyon varyab Ig yo te jwenn nan yon sèl PTEC, selil HK-2, ak PBMC yo te klonaj respektivman nan yon pGEM-T Easy Vector System I (cat. No. A1360; Promega Corporation), ki te transfòme. nan TOP10 selil konpetan (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Yon ti tan, yo te ajoute 5 µl pwodwi ligasyon nan 30 µl selil konpetan TOP10, enkubasyon sou glas pou 30 min, chalè choke nan 42˚C pou 90 segonn, ak enkubasyon sou glas pou 5 min. Apre sa, yo te ajoute 500 µl LB epi kite yo kanpe nan 37˚C pou 40 minit anvan yo te bay vaksinasyon yon pati nan likid bakteri an sou plat Petri ki kouvri ak 0.1 mmol/l IPTG ak 20 µg/ml X-Gal. Asyèt yo te ranvèse nan 37˚C lannwit lan. An tout, 5-16 koloni blan pou chak echantiyon yo te chwazi owaza ak sekans lè l sèvi avèk yon analizè jenetik ABI 3730XL (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Yo te konpare sekans V(D)J rearanje yo ak sa yo ki nan zouti rechèch aliyman lokal debaz la (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) pou idantifye pi bon segman ak jonksyon jèn jèm ki koresponn yo apre taye primè. .

Analiz Western blot.Selil HK-2 yo te lysed nan tanpon liz TSD [1 pousan SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM DTT] ki gen yon bwason inibitè proteaz (Applygen Technologies Inc.), sonike nan dlo glas pou 1 minit ( travay 5 segonn ak repoze 15 segonn; 3 fwa) epi lise pou 30 minit nan tanperati chanm. Apre santrifujasyon nan 12,000 xg pou 10 min nan 4˚C, yo te detèmine konsantrasyon pwoteyin nan lisat selil la lè l sèvi avèk yon twous BCA (Applygen Technologies Inc.). Imedyatman, 5X diminye tanpon loading te ajoute nan lysate la, bouyi nan 100˚C pou 10 min, epi echantiyon yo te imedyatman itilize pou analiz Western blot. Serom, ki itilize kòm yon kontwòl pozitif pou Ig, te izole nan yon donatè ki an sante (menm donatè a ke yo itilize nan PBMCs) pa santrifujasyon nan 2,103 xg pou 10 min nan tanperati chanm.

Efè cistanche: benefis nan ren

Western blotting te pote soti selon pwosedi estanda. Yon ti tan, 3{{40}} µg pwoteyin yo te separe pa SDS-PAGE sou 10 pousan jèl epi yo te transfere sou yon manbràn nitrocellulose. Apre sa, yo te bloke manbràn nan nan 5 pousan lèt ekreme nan tanperati chanm pou 1 èdtan epi yo te enkube ak antikò prensipal nan 4˚C lannwit lan, ki gen ladan Ig anti-moun lapen (chat No. ab109489; 1:1, {{8} }), lapen anti-moun Ig 4 (cat. No. ab109493; 1:1,000), anti-Igκ (cat. No. ab124727; 1:10,000), anti- Igλ (cat. No. ab124719; 1:20,000), lapen anti-moun ‑aktin (cat. No. ab8227; 1:2,000) (tout soti nan Abcam), ak RP215 antikò monoklonal (mAb) (Profesè Xiaoyan Qiu, Peking University, Beijing, Lachin, Lachin; 1:1, 000), ki te idantifye espesyalman yon epitop ki asosye ak idrat kabòn sou ki pa B-Ig. Lè sa a, yo te enkube manbràn nan ak antikò kabrit anti-lapen (chat No. 926-32211) oswa anti-sourit (cat. No. 926-32210) IgG-IRDyeTM680CW segondè antikò (tou de 1:10, 000; tou de LI-COR Biosciences) nan tanperati chanm pou 1 èdtan. Siyal la te detekte lè l sèvi avèk sistèm nan Imaging Odyssey ak lojisyèl Odyssey V3.0 (tou de LI-COR Biosciences). Lojisyèl ImageJ (vèsyon 1.8.0; National Institutes of Health) te itilize pou semi-quantifikasyon.

Pirifikasyon IgG ak espektrometri mas.Apre selil HK-2 yo te kiltive nan DMEM/F12 san FBS pou 48 èdtan, yo te kolekte sipènatant kilti a apre santrifujasyon nan 2,103 xg pou 10 min nan 4˚C. Sipènatant selil la te pirifye pa kwomatografi afinite lè l sèvi avèk pwoteyin G Sepharose, dapre enstriksyon manifakti a (chat No. 17-0618-02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eliyan an te ultra-filtre pou ranplase tanpon elisyon an (0.1 M Glycine; pH 2.4) ak PBS. Pwoteyin pirifye yo te separe pa SDS-PAGE sou jèl 10 pousan, detekte pa Western blotting, epi analize plis pa espektometri mas, fèt pa Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Iminofluoresans.Selil HK-2 yo te kiltive sou kouvèti, ki te fikse nan asetòn frèt san dilye pou 5 minit nan tanperati chanm. Apre sa, yo te lave glisad yo de fwa nan PBS epi yo te bloke ak 5 pousan FBS/PBS nan tanperati chanm pou 20 minit, apre sa yo te enkube ak antikò prensipal nan 4˚C lannwit lan. Antikò yo te menm jan ak sa yo itilize nan Western blotting: lapen anti-moun Ig (1:150), anti-moun Igκ (1:250), anti-moun Igλ (1:250), ak RP215 mAb (1:200). ); PBS te itilize kòm yon kontwòl negatif. Apre yo fin lave yo nan PBS, yo te enkube glisad yo ak antikò kabrit anti-lapen (chat No. A11008) oswa kabrit anti-sourit (cat. No. A11001) ki gen etikèt sou IgG (1:1, 000); Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) nan tanperati chanm pou 1 èdtan. Nwayo yo te tache ak DAPI. Imaj yo te kaptire anba yon mikwoskòp fliyoresan Leica DFC300 FX (Leica Microsystems GmbH).

Tach imunohistochimik.Kortik ren parakansere yo te kolekte nan kat pasyan gason (laj, 38-49 ane) ki gen karsinom ren. Kortik ren nòmal parakansè apre nefrektomi yo te fikse ak 10 pousan fòmalin pou 48 èdtan nan tanperati chanm epi answit entegre nan parafine. Echantiyon ren imen ki entegre nan parafin yo te koupe an seksyon 3-µm epi yo te deparafinize ak reyidrate atravè yon seri konsantrasyon etanòl gradye. Yo te fè rekiperasyon antijèn nan bouyi nan 0.05 M Tris-EDTA (pH 9.0) nan yon cuisinier a presyon pou 3 min. Lè sa a, yo te enkube seksyon yo ak 3 pousan solisyon H2O2 pou 10 minit nan tanperati chanm pou elimine peroksidaz andojèn epi yo te enkube ak serom kabrit nòmal (chat No. ZLI-9022, ZSGB-BIO, Lachin) pou 30 minit nan tanperati chanm pou bloke non espesifik. sit obligatwa antikò nan tanperati chanm. Answit, yo te fè tach imunohistochimik endirèk ak antikò prensipal nan 4˚C lannwit lan, ki gen ladan RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), lapen anti-moun Ig (1:2,000), anti-moun. Igκ (1:1,000), anti-moun Igλ (1:1,000) (menm antikò yo itilize nan Western blotting). Seksyon san antikò prensipal yo te itilize kòm kontwòl negatif. Lè sa a, glisad yo te enkube ak antikò segondè ki make ak peroksidaz refor ki pa dilye (nèm chat PV-6001 ak PV-6002; tou de OriGene Technologies, Inc.) nan tanperati chanm pou 30 min. Antikò ki mare yo te detekte lè l sèvi avèk diaminobenzidine. Finalman, glisad yo te kontre ak ematoksilin. Imaj yo te kaptire lè l sèvi avèk yon mikwoskòp limyè (x200 agrandisman). Analiz estatistik. Done yo prezante kòm mwayen ± devyasyon estanda epi yo analize lè l sèvi avèk SPSS 20.0 pou Windows (IBM Corp.). Tout eksperyans yo te repete 3 fwa. Diferans ki genyen ant plizyè gwoup yo te analize lè l sèvi avèk yon sèl-fason ANOVA ak tès posthoc Tukey la. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Efè cistanche: benefis nan ren

Rezilta yo

Ekspresyon IgG nan selil epitelyal ren nan cortical ren an.Cortical ren nòmal, ki te kolekte nan men donatè ki te sibi nefrektomi kòm yon rezilta nan karsinom selil ren, yo te itilize pou detèmine ekspresyon IgG nan selil epitelyal tubulaires ren pa imunohistochimi lè l sèvi avèk antikò kont imen Ig , Igκ, Igλ, ak RP215 (yon antikò ki sitou. mare ak ki pa B-IgG). Pozitif tach nan chenn IgG lou ak limyè pa sèlman detekte nan PTECs yo, men tou nan selil epitelyal distal tubul konvolute, swa nan sitoplasm nan, manbràn selilè, oswa lumèn Echafodaj (figi 1).

Transkripsyon ak V (D) J rekonbinasyon IgG nan PTEC sèl. Pou evite entèferans nan san rezidyèl, lyezon, ak transsitoz nan IgG pa PTEC nan cortical ren an, epi jwenn prèv dirèk nan ekspresyon IgG nan PTECs, yo te klase PTEC sèl soti nan cortical ren imen an lè l sèvi avèk CD10 ak CD13 ko-etikèt pa koule. sitometri (20). Jan yo montre nan Fig. 2A, CD10/CD13 doub-pozitif PTEC te konte pou 4.1 pousan nan selil solid nan echantiyon an. PTEC izole yo te konfime plis lè l sèvi avèk jèn makè espesifik LRP2 a, epi CD19 te elimine kontaminasyon selil B yo. Transkripsyon rejyon varyab Ig yo te anplifye nan senk PTEC sèl pa PCR enbrike (figi 2B ak C). Rezilta sekans Sanger yo te revele ke PTEC yo te montre rekonbinasyon VDJ fonksyonèl ak konsèvatif nan chèn lou IgG (Tablo I), ki endike ke ekspresyon IgG ka rive nan PTEC yo.

Ekspresyon chèn lou ak lejè IgG nan selil HK-2. Piske li te difisil pou detekte ekspresyon pwoteyin IgG nan yon sèl PTEC epi pou jwenn ase PTEC pou Western blotting, yo te chwazi liy selil HK-2, ki gen ladann PTEC imòtalize, pou konfime plis ekspresyon pwoteyin IgG. Analiz imunofluoresan te demontre tach pozitif nan Ig, Igκ, ak Igλ nan sitoplasm la, ak pi fò tach pozitif nan RP215 majorite nan sitoplasm la ak manbràn selilè (Fig. 3A).

Imedyatman, ekspresyon de chèn lou ak lejè IgG nan selil HK-2 yo te detekte pa Western blotting nan kondisyon diminye. Pou elimine entèferans FBS nan mwayen kilti a, mwayen ki gen FBS te efase ak antikò korespondan ak tache negatif. Yon antikò IgG komèsyal te kapab detekte IgG ki sòti nan serom men se pa IgG ki sòti nan HK-2. Kontrèman, RP215 te kapab detekte IgG ki sòti nan HK-2, men se pa IgG serik. Tou de antikò IgG komèsyal ak RP215 yo te kapab detekte Ig nan 55 kDa. Yo te detekte yon bann Ig 4 (36 kDa) nan selil HK-2, ki konsistan avèk pwa molekilè prevwa a. Anplis de sa, ekspresyon Igκ (25 kDa) ak Igλ (50 kDa, dimer) yo te obsève nan lysate selil yo (figi 3B). Imedyatman, IgG nan sipènatant selil la te pirifye pa pwoteyin G, konfime pa Western blotting ak sekans pa espektometri mas, ki te demontre ke gwoup 55-kDa a te genyen fragman nan chèn Igκ la ak rejyon varyab chèn lou Ig, dapre Sant Nasyonal pou Enfòmasyon sou Biotechnology (NCBI) baz done (Fig. 3C-E). Done sa yo sijere ke selil HK-2 pwodui ak sekrete pwoteyin IgG.

Transkripsyon ak V (D) J rekonbinasyon nan chenn lou ak limyè IgG nan selil HK-2. Ig jèn transkripsyon ak fonksyonèl V(D)J rekonbinasyon se yon avantou pou ekspresyon Ig. Pou konfime ekspresyon IgG nan selil HK-2, yo te evalye transkripsyon Ig, Igκ, ak Igλ lè yo anplifye rejyon konstan ak varyab nan selil HK-2 (Fig. 4A ak B). Sekans nan pwodwi yo PCR konstan ekspoze segondè omoloji ak sekans ki pibliye nan baz done a NCBI. Klonaj T-A ak sekans Sanger te demontre ke Ig nan selil HK-2 te montre konsèvatif V(D)J rekonbinasyon ak VH4-4/D2-8/JH5. Kontrèman, yo te obsève divèsite recombinasyon V(D)J nan PBMC yo, ki te elimine patipri primè (Tablo II). Menm jan ak selil B yo, IgG ki sòti nan HK-2 te parèt tipik pwodiktif V(D)J rekonbinasyon ak junctions V-D ak D-J (Fig. 4C). Anplis, ipèrmutasyon somatik yo te detekte nan Ig ki sòti nan HK-2 (ranje, 6.8-8.4 pousan) ak 7 sou 15 motif hotspot (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) prezante ak mitasyon.

Anplis de sa, transkripsyon AID (yon eleman esansyèl pou ipèrmutasyon somatik ak rekonbinasyon switch klas nan selil B), ak RAG1 ak RAG2 [nesesè pou recombinasyon V (D) J] yo te detekte nan selil HK-2 (Fig. 4B), ki endike ke Mekanis ki kache nan sentèz Ig nan selil HK-2 ka sanble ak sa ki nan selil B yo.

TGF-1 kontwole ekspresyon IgG nan selil HK-2 yo. Selil HK-2 yo te ankouraje ak divès konsantrasyon TGF-1 pou 48 èdtan. Immunofluorescence tach revele ke cytoplasmic IgG ekspoze amelyore tach pozitif konpare ak gwoup kontwòl la (figi 5A). Western blotting konfime ke IgG te siyifikativman regilasyon pa TGF-1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Efè cistanche: benefis nan ren

Diskisyon

Etid la te demontre ke PTEC yo te eksprime IgG ak transkripsyon jèn ak fonksyonèl konsèvatif V(D)J rekonbinasyon, ki te menm jan ak ki pa B-IgG. TGF-1 ogmante ekspresyon IgG nan selil HK2.

Pou mennen ankèt sou si PTEC yo te eksprime IgG, yo te premye detekte IgG nan sitoplasm, manbràn selilè, ak lumèn PTEC nan korèks nòmal imen ren pa imunohistochimi; rezilta yo endike ke PTEC yo pwodui ak sekrete IgG. Sa a se kontrèman ak egzamen woutin patolojik nou an, kote pa gen okenn IgG aparan yo te detekte nan PTECs. Sa a ta ka akòz tach PTEC trè fèb, ki te twò ba yo dwe detekte, patikilyèman nan maladi glomerulè ki gen rapò ak iminitè kote Ig yo trè pozitif nan glomeruli yo ak tach PTEC ka pèdi san entansyonèlman men atifisyèlman. Transcytosis IgG soti nan sikilasyon an pa PTECs atravè reseptè a Fc te pasyèlman regle, kòm tach klè nan IgG pa RP215 te obsève nan manbràn selilè a ak sitoplasm. Konklizyon sa yo sijere ke IgG ki sòti nan PTEC te sanble ak lòt ki pa B-IgG epi yo ka gen epitop inik glikozile, ki ka espesyalman rekonèt pa RP215 olye pou yo yon antikò komèsyal anti-IgG (15). Konklizyon an ke sèlman yon pati nan selil epitelyal Echafodaj ki eksprime IgG ka eksplike pa ekspresyon dinamik nan sik selil diferan, ki te menm jan ak modèl la ekspresyon nan IgA selil mesangial ki sòti (18). Ko-tach nan IgG ak makè Echafodaj (tankou akwaporin 1 ak akwaporin 3) ta itil pou plis etid amelyore rezilta yo nan etid prezan an.

Sekans RNA yon sèl selil ka montre klèman transkripsyon yon jèn espesifik nan yon selil bay yo. Yo te detekte transkripsyon chèn Ig ak V(D)J rekonbinasyon nan yon sèl PTEC. Malgre ke sèlman senk sèl PTEC yo te itilize, pwosesis la te solid kòm cortical ren yo te kolekte lwen timè a, epi chak selil sèl te klase pa sikometri koule ak de jèn makè espesifik PTEC, rekonfime lè l sèvi avèk yon twazyèm jèn makè espesifik (LRP2). epi kontaminasyon selil B yo te elimine. Rezilta yo te revele ke PTEC yo pa sèlman prezante ak transkripsyon jèn IgG, men tou klasik V (D) J recombination nan rejyon an varyab kòm selil B, tankou pwodiktif V (D) J recombination ak V-D ak D-J. junctions (Fig. 4), ki endike ke PTEC yo gen potansyèl pou pwodwi IgG. Anplis de sa, rekonbinasyon V(D)J ki pi konsèvatif montre ke PTEC yo prezan ak transkripsyon jèn IgG ak rekonbinasyon V (D)J ki sanble ak lòt selil ki pa B yo.

HK-2, yon liy PTEC imòtalize, fasil pou kiltive an gwo kantite. Etid prezan an konfime ekspresyon pwoteyin IgG nan selil HK-2 kiltive yo; IgG te detekte nan selil HK-2 pa tou de imunofluoresans ak Western blotting. Ig 4, yon sous-klas Ig, te detekte tou nan yon gwosè gwoup ki konsistan avèk pwa molekilè prevwa a. Spectrometri mas te revele ke pwoteyin nan pirifye nan sipènatant selil lè l sèvi avèk pwoteyin G genyen fragman nan rejyon an varyab chèn lou Ig ak chèn Igκ, bay prèv pou sekresyon IgG pa PTECs. IgG transkripsyon nan selil HK-2 sipòte plis ekspresyon IgG nan PTECs, ak konsèvatif V(D)J rekonbinasyon ak IGHV4-4/IGHD2-8/IGHJ5 nan selil HK-2 plis sipòte prezans nan IgG nan selil HK-2 menm jan an. nan lòt selil ki pa B yo.

Etid la kounye a te envestige tou mekanis ki kache nan pwodiksyon IgG nan PTEC yo lè li egzamine transkripsyon RAG1, RAG2, ak AID nan selil HK-2. Li te revele ke RAG1, RAG2, ak AID yo te transkri nan selil HK-2. Anplis de sa, yo te deja detekte transkripsyon RAG1, RAG2 oswa AID nan anpil lòt selil ki pa B, tankou podosit (19) ak plizyè liy selil kansè (23). Rezilta sa yo sigjere ke selil ki pa B yo, ki gen ladan PTEC yo, ka gen mekanis sentèz Ig ki sanble ak selil B yo. Sepandan, si AID ak/oswa RAG1/2 se jèn ki nesesè pou IgG ki sòti nan PTEC mande plis envestigasyon. Anplis de sa, selil T CD4 asistan folikulèr yo enpòtan pou kontwole diferansyasyon selil B nan sant jèminal nan selil plasma epi sipòte pwodiksyon Igs (24). Done ki pa pibliye nou yo te revele ke yo te toujou detekte ki pa B-Ig nan sourit NOD-SCID ki pa gen selil T ak B, sa ki endike ke ki pa B-Ig yo pa t depann totalman de selil T asistan yo. Kit selil T asistan yo obligatwa pou PTEC yo eksprime IgG mande pou plis rechèch.

TGF-1 gen yon wòl iminomodulatwa kle nan pwodiksyon Ig. Pou egzanp, TGF-1 pwovoke chanjman klas IgA ak sekresyon nan selil B ankouraje nan larat sourit (25) ak selil B amigdal imen (26). McIntyre et al (27) te demontre ke TGF-1 selektif stimulé sekresyon IgG2b pa lipopolysaccharide-aktive selil B gen plis chans lè yo pwovoke yon switch IgM a IgG2b. Duan et al (28) te demontre ke TGF-1 ogmante ekspresyon IgA lè yo kontwole faktè transkripsyon Ets-1 nan selil kansè epitelyal yo. Etid la te demontre ke TGF-1 ogmante ekspresyon IgG nan selil HK-2. Etandone ke sèlman IgG te detekte nan selil HK-2, li te ipotèz ke TGF-1 pwovoke ekspresyon IgG endepandan de chanje klas Ig. Mekanis regilasyon pwodiksyon IgG pa TGF-1 mande pou plis envestigasyon.

PTEC yo sèvi yon wòl enpòtan nan fibwoz entèrstisyal tubulaires atravè EMT ak TGF-1 aji kòm yon medyatè pwofibrotik mèt. Nan etid sa a, adisyon TGF-1 nan selil HK-2 kiltive yo ogmante ekspresyon IgG, sa ki endike ke IgG ki sòti nan HK-2 ka asosye pozitivman ak EMT. Etid anvan yo te rapòte ke kansè-IgG te asosye ak metastaz ak ankouraje EMT pa diminye E-cadherin nan saliv adenoid kansyòm sistik (29) ak kansè nan poumon (30). Li vo envestige si IgG ki sòti nan PTEC ka sèvi yon wòl nan EMT tubulaire ren ak fibwoz entèstisyal nan kondisyon maladi, tankou blesi ischemi / repafizyon oswamaladi ren kwonik.

An konklizyon, nan pi bon konesans nou an, etid prezan an se premye moun ki demontre ke PTEC yo ka eksprime ak sekrete IgG, ak TGF-1 ka ogmante ekspresyon IgG nan selil HK-2. Sepandan, wòl potansyèl IgG ki sòti nan PTEC nan fibwoz tubulointerstitial mande plis envestigasyon.

Efè cistanche: benefis nan ren

Finansman

Etid sa a te sipòte pa sibvansyon ki soti nan Fondasyon Nasyonal Syans Natirèl Lachin nan (sibvansyon nb 82070736, 91642109, ak 81870488), Fondasyon Syans Natirèl Hainan (sibvansyon nimewo 819QN355), Hainan Medical University Scientific Research Kiltivasyon Fondasyon (sibvansyon non. HYPY201926), ak Pwojè Sipò Kle nan Gwo Pwogram Rechèch Nasyonal Syans Natirèl Fondasyon an (sibvansyon nimewo 91642206).

Disponibilite done ak materyèl

Ansanm done yo itilize ak/oswa analize pandan etid aktyèl la disponib nan men otè ki koresponn lan sou demann rezonab.

Kontribisyon otè yo

Kòm otè korespondan yo, YW ak XQ te vin ansent ak fèt etid la. ZD te patisipe nan konsepsyon rechèch la, te fè eksperyans istolojik ak yon sèl selil, prepare echantiyon pou espektometri mas, analize done, epi ekri maniskri a. ZJ te patisipe nan konsepsyon rechèch la, pifò eksperyans konsènan ekspresyon IgG nan selil HK-2, ak analiz done ki enpòtan. YG, JM, HD, ak YL fè eksperyans pasyèl liy selilè. ZC ak YP te chwazi ka apwopriye pou eksperyans selil sèl selon karakteristik klinik yo. HY ak ZS te patisipe nan eksperyans yon sèl selil. SW te patisipe nan tach imunohistochimik, analize done tach tisi yo, epi ekri ak revize maniskri a. YW, ZD, ak ZJ konfime otantisite tout done anvan tout koreksyon yo. Tout otè yo te revize maniskri a epi yo te revize done yo. Tout otè li epi apwouve maniskri final la.

Apwobasyon etik ak konsantman pou patisipe

Etid la te konfòme ak prensip Deklarasyon èlenki, epi li te apwouve pa Komite Etik Medikal nan Peking University Twazyèm Lopital (apwobasyon No S2020121) epi li te fèt an akò ak pwotokòl la. Tout donatè yo te bay kòtèks ren volontèman epi yo te bay konsantman enfòme alekri anvan yo te bay cortical ren an nan etid la. Tout metòd yo te fèt an akò ak direktiv ak règleman ki enpòtan yo. Echantiyon sa yo te entèdi anonimize. Serom imen ak PBMC yo, yo te itilize kòm kontwòl pozitif nan Western blotting oswa ranvèse transcription-PCR nan etid sa a, yo te jwenn nan san an nan yon volontè ki an sante, ki te bay konsantman enfòme alekri pou pran echantiyon.

Efè cistanche: benefis nan ren

Referans

1. Schlondorff DO: Apèsi sou faktè ki kontribye nan fizyopatoloji nan maladi ren pwogresif. Kidney Int 74: 860-866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chili F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Reseptè Toll-like, imunoproteasome ak selil T regilasyon nan timoun ki gen Henoch-Schonlein purpura ak nefropati IgA prensipal. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G, ak Neumann K: Selil epitelyal proximal tubulaires ren yo egzèse fonksyon imunomodulateur lè yo kondwi repons enflamatwa CD4 plis selil T. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77-F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL, ak Lan HY: blesi nan tubul ren: Yon fòs kondwi nan direksyon maladi ren kwonik. Kidney Int 93: 568-579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C, ak Tomino Y: FcRn-medyatè transsitoz nan imunoglobulin G nan selil ren imen proximal epitelyal tubulaires. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358-F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Solèy X,et al: Kansè epitelyal imen sekrete imunoglobulin g ak espesifikasyon yo pa idantifye pou ankouraje kwasans ak siviv selil timè yo. Kansè Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Solèy X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Transkripsyon jèn imunoglobulin yo gen karakteristik rekonbinasyon VHDJH diferan nan selil kansè epitelyal imen yo. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: IgG ak IgA ak potansyèl aktivite mikwòb-obligatwa yo eksprime pa nòmal selil po moun epidèm. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X ak Wang B: Immunoglobulin M, yon molekil roman nan selil myokad nan sourit. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Solèy Y, Wang S, Solèy Y, Korteweg C, Gao W, ak Gu J: Ekspresyon ak distribisyon imunoglobulin G ak reseptè li yo nan yon sit iminitè-privilejye: Je a. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Solèy X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J, ak Qiu XY: Ekspresyon jèn imunoglobulin ak reyajman klasik V-(D)-J nan newòn nan sèvo sourit. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C, ak Gu J: Ekspresyon ak distribisyon imunoglobulin G ak reseptè li yo nan sistèm nève imen an. Int J Biochem Cell Biol 43: 556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W, ak Gu J: De modèl distribisyon ultrastructural nan imunoglobulin G nan plasenta imen ak enplikasyon fonksyonèl. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P, ak Qiu X: Ekspresyon jèn imunoglobulin ak klasik V-(D)-J reyaji nan tèstikul sourit ak epididim. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Selil karsinom selil squamous nan poumon yo eksprime IgG ki pa canonically glycosylated ki aktive siyal integrin-FAK. Cancer Lett 430: 148-159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q, ak Zhao Y: Ekspresyon segondè nan imunoglobulin G glycosylated ki sòti nan kansè nan predi move pronostik nan adenokarcinom ductal pankreyas. J Kansè 11: 2213-2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q ak Zhao YP: Imunoglobulin G ki sòti nan kansè: Yon makè roman pou dyagnostik diferans ak prediksyon rplonje nan kansòm paratiwoyid. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X, ak Wang Y: ekspresyon de imunoglobulin A nan selil mesangial imen ak efè li sou apoptoz selil ak adezyon. Mol Med Rep 17: 5272‑5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X, ak Wang Y: ekspresyon de imunoglobulin G nan podosit imen, ak wòl li nan viabilite selil ak adezyon. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Izolasyon ak karakterizasyon yon modèl selil epitelyal prensipal proximal nan ren imen pa CD10/CD13 doub etikèt. PLoS One 8: e66750, 2013.