Modèl ekspresyon nan -Tubulin, Inversin ak sib li yo dekouraje-1 ak mòfoloji nan sily prensipal nan devlopman nòmal ren imen ak maladi
Mar 10, 2022
Résumé:Ekspresyon espaso-tanporèl -tubulin, envèrsyon, ak pwoteyin dezord-1 (DVL{-1) ki asosye ak chemen siyal Wnt la, ak mòfoloji sily prensipal yo te analize nan devlopman.ren(14yèm a 38yèm semèn devlopman), an sante apre akouchman (1.5- ak 7-zan), ak moun ki chanje patolojikman.ren,ki gen ladan displastik multisistikren(MCDK), glomerulosclerosis segmantal fokal (FSGS) ak sendwòm nefrotik nan kalite Finnish (CNF). Analiz la te fèt pa doub imunofluorescence, mikwoskòp elèktron, metòd semiquantitative ak estatistik. Yo te obsève ko-ekspresyon sitoplasmik nan -tubulin, envèrsyon, ak DVL-1 nan tubul konvolusyon proximal yo (pct), tubul konvolusyon distal (dct), ak glomeruli (g) nan tisi analize yo. Pandanrendevlopman, ekspresyon an jeneral nan -tubulin, envèsyon, ak DVL-1diminye, pandan y ap nan peryòd la apre akouchman an yon ti kras ogmante. Ekspresyon ki pi wo nan -tubulin ak envèrsyon karakterize dct ak g, pandan y ap gwo DVL-1 karakterize pct. -tubulin, envèrsyon, ak modèl ekspresyon DVL-1 nan MCDK, FSGS, ak CNFrensiyifikativman diferan de kontwòl an sante. Konpare ak santeren, patolojikman chanjerente gen sila prensipal dysmorphic. Dinamik ekspresyon diferan nan -tubulin, envèsyon, ak DVL-1 pandanrendevlopman te kapab endike ke chanjman ant kanonik ak non canonical Wnt-siyal la esansyèl pou nòmalrenmorfogenesis. Nan contrast, ekspresyon detounen yo nan patolojikrenta ka asosye ak sila prensipal anòmal, ki mennen nan kwonikmaladi ren.
Mo kle:devlopman ren imen; -tubulin; envèsin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; ren, ren
CISTANCHE AP AMELYORE MALADI REN/REN
Entwodiksyon
Devlopman definitif la oswa metanephricrenkòmanse pandan senkyèm semèn jèstasyonèl (GW), ki Lè sa a, kontinyèlman diferansye yo fòme ren pèmanan yo [1,2]. Entèraksyon siyal ant mesenchyme metanephric la ak boujon ureterik la asire bon janrendevlopman pandan nefrogenesis. Yon ti tan, boujon ureterik la pwovoke tranzisyon mesenchymal-a-epitelial (MET) nan mesenchyme metanephric, ki kondans ak fòme.renvesik, ki te swiv pa kò ki gen fòm vigil ak ki gen fòm S, epi finalman ki mennen nan fòmasyon glomeruli [3]. An retou, mesenchyme a pwovoke plis branch nan boujon ureterik la. Ren metanephric yo vin inite fonksyonèl ekskretè nan 11yèm semèn nan devlopman imen. Sepandan, nefrogenesis fini nan 34yèm a 36yèm semèn nan devlopman fetis la, lè plizyè evènman branch yo fini, men plis pwosesis diferansyasyon nan ren ap kontinye nan peryòd apre akouchman an [4,5]. Dezòd nan entèraksyon konplèks sa yo lakòz divès kalite anomali konjenital nan ren ak aparèy urin (CAKUT), ki gen ladan displazi, maladi ren polikistik, displastik multisistik.maladi ren(MCDK), kidonk ki mennen nan kwonikmaladi ren(CKD) [6].
Nan etid sa a, nou te konsantre sou aparans sily prensipal la ak wout la siyal Wnt, ki jwe yon wòl enpòtan pandan nefrogenesis nòmal ak nanrenpwosesis reparasyon, apre egi oswa kwonikmaladi ren[7]. Egzistans nan sily prensipal pandan nefrogenesis ak gwo kantite devlopmanrendefo ki rive nan pasyan ki gen maladi silyè fè remake ke otantik prensipal fonksyon sily nesesè pou nòmalrenorganogenesis [8,9]. Silyom prensipal la se yon òganèl ki baze sou mikrotubul enpòtan pou omeyostazi tisi, kote -tubulin se eleman debaz la [10]. Pèt acetylation -tubulin nan selil imòtalize deklannche tranzisyon epithelial-a-mesenchymal (EMT), kidonk vle di ke acetylated -tubulin enpòtan nan estabilizasyon nan mikrotubul [11]. Pandan devlopman imen, wout prensipal Wnt sily-medyatè pèmèt pwopagasyon selilè, diferansyasyon ak mòfogenesis tisi [12]. Yon kantite siyifikatif timoun ki gen pwoblèm fonksyon sily prensipal ak deranje wout siyal Wnt devlope CKD, kote konjenital.renmaladi yo responsab prèske mwatye nan ka yo [13]. Maladi sistik konjenital ki pi komen nan timoun yo se displastik multisistikmaladi ren(MCDK) [14]. Plizyè spor ki pa kominike [15] epi ki manke nòmalrenparenchyma yo se rezilta mikwoskopik karakteristik MCDK. Glomerulosclerosis segmantal fokal (FSGS) se youn nan maladi glomerulè ki pi komen ki mennen nan etap final la.maladi ren[16]. Nan konmansman an, FSGS se karakteristik pou yo te fokal, ki enplike sèlman yon minorite nan glomeruli yo ak segmantè, ki enplike chanjman nan sèlman yon segman nan sèk la glomerular [17]. Sendwòm nefrotik konjenital nan kalite Finnish (CNF) se yon otozomal ki pa komen eritye.maladi renreprezante pa yon epidemi prenatal nan pèt pwoteyin vaste [18], ki asosye ak sistogenesis nan tubul proximal [19]. Anpil fòm maladi glomerulè prensipal yo devlope proteinuri kòm yon rezilta nan baryè filtraj glomerulè ki domaje [20]. Yon kantite konsiderab etid implique ke blesi ak malfonksyònman nan podosit yo gen wòl intrinsèques nan patojèn nan proteinuria CKD [21]. Etid la pa Vukojevic et al. montre yon kantite ogmante nan podosit ciliated ak mal différenciés nan CNF [22]. Etid anvan yo te endike ke Wnt/-catenin siyal chemen an gen yon wòl fondamantal nan modere malfonksyònman podocyte ak proteinuria [23]. Gen de wout prensipal Wnt-siyal, youn ke yo rekonèt kòm kanonik -catenin-depandan ak lòt ki pa canonical, -catenin endepandan. Pandan souritrendevlopman, kanonik Wnt-siyal aktif sou pwent boujon ureterik yo ak nan kò ki gen fòm S [24]. Anplis de sa, Wnt atravè siyal kanonik gen enpòtans nan kenbe MET pandan nefrogenesis [25]. Savwa, lyezon nan konplèks pwoteyin ki gen Dvl ak reseptè manbràn an obligatwa pou deklanchman Wnt chemen an, pandan y ap enfim eleman kle yo nan chemen sa a rezilta nan mòtalite perinatal bonè akòz absans nan zòn nefrojèn nan.ren[25].
Yo te jwenn yon pwoteyin enpòtan kòm yon switch molekilè ant kanonik ak non kanonik chemen siyal Wnt yo se envèsyon [26]. Malgre ke yo te detekte entèraksyon divès pwoteyin ak envèrsyon, fonksyon egzak li poko klarifye nèt. Nanrenselil epitelyal, envèsyon sitiye nan sily prensipal la, aji kòm yon pwoteyin silyè [27]. Anplis de sa, envèrsyon fòme yon konplèks fiks ak tubulin nan kilti nanrenselil yo, epi yo colocalize nan vivo [27,28]. Envèrsyon sanble jwe yon wòl esansyèl nan morfogenesis bonè nan sistèm pronephric la ak detèminasyon simetri gòch-dwat pandan devlopman [29,30]. Yon evènman enpòtan pou tou de kanonik ak non canonical Wnt-siyal chemen nan rekritman nan Dvl nan sitoplasmik nan manbràn selilè a. Depi konklizyon anvan yo te montre ke envèrsyon ak Dvl colocalize nan selil epitelyal ren yo, li ka espekile ke envèsyon ta ka tou gen yon wòl nan siyal non canonical. Dysregulation nan Wnt-siyal medyatè pa envèsyon deklanche pwopagasyon aberan nan tubules [31]. Tès jenetik te revele yon mitasyon DVL-1 nan pasyan ki gen sendwòm Robinow otosomal-dominan, ki prezante maladi etewojèn nan kèk pasyan ki asosye ak urojenital akrenanomali [32].
CISTANCHE AP AMELIORE DYALIZ REN/REN
Yo te envestige modèl ekspresyon devlopman -tubulin, envèsyon ak DVL-1 nan diferan modèl bèt. Kidonk, ekspresyon yo nan pronephros Xenopus laevis te konfime lè l sèvi avèk mikwoskòp intravital [31], pandan y ap yo te jwenn nan liy selil ki sòti nan selil murine proximal tubulaires lè l sèvi avèk mikwoskospi konfokal ak espektrometri mas [33]. Anplis de sa, mikwoskospi limyè ak imunofluoresan doub revele prezans yo nan seksyon sourit yoren[34]. Etid sou sourit knockout envèrsyon rapòte elaji, spor difize nan larenmedulla ak cortical ki asosye ak envèsyon visceral situs [35]. Nan imen, yo te prezante mitasyon nan envèrsyon ak nefronoftiz timoun ki te mennen nan fen gwosès la [36]. Malgre anpil etid souren-tubulin, envèrsyon ak DVL-1 modèl ekspresyon ak fonksyon, nan pi bon nan konesans nou an, yon modèl ekspresyon nan pwoteyin sa yo nan tisi imen fetis la ak apre akouchman poko te envestige epi yo te mennen nan yon korelasyon. Anplis de sa, pa te rapòte prèv ki konsidere ekspresyon envèsyon ak DVL-1 nan kòmansman devlopman imen. Se poutèt sa, etid sa a te vize analize modèl ekspresyon espasyal ak tanporèl nan -tubulin, envèsyon ak DVL-1 pandan etap fetis la ak apre akouchman an sante moun.ren, osi byen ke nanrentisi nan MCDK, FSGS ak CNFrenyo nan lòd yo etabli yon posib lyen ki manke ant antite sa yo. Savwa, nou pwopoze ke modèl ekspresyon detounen nan -tubulin, envèrsyon ak DVL-1 pwoteyin ta ka pwosesis la sistogenesis kache ak yon fonksyon nòmal nan sily prensipal ki mennen nan kwonik.maladi ren.
Rezilta yo
Analiz la nan devlopman ak apre akouchmanrentisi yo te fèt sou estrikti diferan diferansye nan laren:proximal tubul convoluted (pct), distal tubul convoluted (dct) ak glomeruli (g). Pandan etap devlopman yo analize ak apre akouchman anrentisi, -tubulin, envèrsyon ak DVL-1 te montre modèl ekspresyon pozitif men ak diferans nan entansite, distribisyon ak kantite. Analiz la nan patolojik latisi rennan MCDK, FSGS ak CNF te fèt sou konte imaj konplè nan selil yo pozitif konpare ak kontwòl tisi ren an sante.
2.1. Mikwoskopi limyè, mikwoskopi elektwonik ak imunohistochimi (-Tubulin) nan tisi ren moun ki an sante ak patolojik ki chanje apre akouchman.
2.1.1. Limyè ren ki an sante apre akouchman
mikwoskopi apre akouchman anrentisi demontre byen definirenestrikti, ak yon diferans distenk ant medul ak cortical ak fòmasyon nan pct, dct, ak g nan rejyon an kortik. Tach imunohistochimik nan -tubulin revele prezans nan yon sèl sily prensipal nan sant la nan sifas selil apical chak selil tubulaires ak nan 0.018 pousan ± 0.00014 pousan SD sou sifas selil glomerulè yo. Mikwoskopi elektwonik montre prezans yon sèl sily prensipal ki soti nan kò fondamantal la nan sifas selil apical tubul la (Figi 1a).
2.1.2. CNF
Pifò nan g analize yo pi piti ak lobulasyon (80 pousan), pandan ke minorite a gen gwosè nòmal oswa ipètrofik (20 pousan, n=100). Segmantal oswa global sclerosis nan g jwenn, pandan y ap pct ak dct yo pasyèlman dilate ak kouvwi ak epitelyal atwofik. Ultrastructurally, pèt microvilli ak diminisyon nan wotè selil ak miltifragmantasyon nwayo yo obsève. Nan podocytes, pwosesis pye yo ap difize pèdi. Sili prensipal tubulaires yo dezorganize, patikilyèman nan spor proximal tubules yo, ki montre chanjman nan longè ak pozisyon sitoplasmik (Figi 1b).
2.1.3. MCDK
Nan tisi ren yo, yo ka jwenn g ki pa gen matirite ak matirite.rentisi plen ak anpil spor oval. Selil epitelyal kolòn yo kouvri spor yo epi yo antoure pa tisi konjonktif ki lach. Tach imunohistochimik nan -tubulin montre plizyè silos prensipal long ak dezoganize sou sifas selil epitelyal yo (Figi 1c).
2.1.4. FSGS
Nan 90 pousan g, yo jwenn gwo paralezit segmantal (n=100), ki asosye ak fibwoz entèrstisyèl ak siy domaj tubulaires. Diminisyon nan wotè selil epitelyal ak pèt mikwovilli yo jwenn nan mikwoskòp elèktron, pandan y ap selil andotelyo ak rejyon mezanjyal yo gen ultrastruktur regilye. Nan mikwoskòp elèktron, silyòm ki trè long ak desantralize (desantralize) yo obsève sou sifas selil tubulèr distal la (Figi 1e). Podosit montre pèt difize nan pwosesis pye ak tisi mikrovillus vaste. Tach imunohistochimik nan a-tubulin montre plizyè sila prensipal long ak dezoganize sou sifas selil epitelyal yo (Figi 1c).
2.2. Tach imunohistochimik nan 心Tubulin, Envèrsyon ak DVL-1- ak analiz estatistik sou devlopman ak an sante ren imen apre akouchman
Nan 14yèm, 15yèm ak 16yèm semèn jèstasyonèl larentisi yo prezante ak diferan etap devlopman nan fòmasyon nefwon: soti nan tas metanephric,renvesik etap yo kòmande nefron ki gen fòm S, konsa fòme zòn nefrojèn nan cortical eksteryè a (Figi 2). Diferansye pct, dct ak g ka obsève nan rejyon cortical ki pi pre arenmedul. Pandan 22yèm GW la, pati nan medul la ak cortical te vin klèman diferan, pandan y ap nan 38yèm GW,renestrikti parèt kòm trè différenciés, ki gen fòm matirite nan pct, dct ak g
2.2.1. a-Tubulin
Pandan devlopman, a-tubulin fòtman eksprime nan tout devlopmanrenestrikti, prensipalman vizyalize fòm sily prensipal yo sou sifas selil epitelyal parietal kapsil Bowman a, g, pct ak dct. Nanrentisi, 82-97 pousan nan selil pct eksprime a-tubulin, pandan y ap nan ekspresyon dct gout soti nan 99 pousan a 72 pousan nan 38th GW (gade Figi 3, Tablo 1). Pami diferan etap devlopman, ekspresyon ki pi fò nan a-tubulin yo jwenn nan g nan 16th GW la.ren, ki gen 93 pousan nan selil pozitif. 14yèm, 15yèm ak 22yèm GW (gade Figi 3a,b, Tablo 1), anviwon 70 pousan nan selil g yo eksprime a-tubulin, pandan ke yo obsève pi piti ekspresyon nan 38yèm GW (p < 0.01)="" ak="" 34="" pousan="" nan="" selil="" pozitif="" yo="" (figi="" 3c).="" nan="" apre="" akouchman="">rentisi (1.5-ane ak 7-zanren), se iminoreaktivite ki pi fò nan a-tubulin obsève sou sifas selil apical pct ak dct (Figi 3d-f). Ekspresyon a-tubulin prezan tou nan sitoplasm perinuclear dct a ak selil epitelyal parietal kapsil Bowman a. a-tubulin tach toutrenestrikti ak yon mwayèn de 50 pousan nan selil pozitif nan PCT, 94 pousan nan dct ak 85 pousan nan g (Figi 3f). Dct tach siyifikativman diferan de pct (p <0.0001). tout="" estrikti="" envestige="" yo="" tach="" pozitif="" nan="" a-tubulin,="" ak="" 77="" pousan="" nan="" selil="" pozitif="" nan="" pct,="" 72="" pousan="" nan="" dct="" ak="" 58="" pousan="" nan="" g="">
Figi 3. Tach imunofluoresan nan -tubulin ak DAPI nan tisi ren moun ki devlope ak apre akouchman (a-e). ren 14yèm, 15yèm/16yèm, 38yèm GW (a–c);rennan timoun 1.5- ak 7-zan (d,e). Tach pozitif nan -tubulin (flèch) yo montre nan chak estrikti nan cortical a atravè faz devlopman ak apre akouchman (a–e), proximal tubul convoluted (pct), distal tubul convoluted (dct) ak glomeruli (g). Detay sou sily prensipal yo nan pct (d) ak dct (a–c,e) yo montre kòm pi gwo ensèkle agrandisman (bwat blan). Agrandisman × 40, ba echèl 100 µm. Distribisyon selil pozitif -Tubulin pou chak estrikti nan diferan etap devlopman ak nan peryòd apre akouchman an montre nan graf (f). Grafik (g) (kantite an jeneral selil pwoteyin pozitif nan estrikti obsève) montre ekspresyon pwoteyin ki gen rapò ak tan devlopman (regression lineyè) ak entèrelasyon -Tubulin ak DVL-1 atravè devlopman ak spirasyon (ANOVA de-fason ki te swiv pa tès posthoc SIDAK). Done yo montre kòm mwayen ± SD.
Nan graf (f), yo montre distribisyon selil -tubulin-pozitif pou chak estrikti nan diferan etap devlopman ak nan peryòd apre akouchman an. Grafik (g) (kantite an jeneral selil pwoteyin pozitif nan estrikti yo obsève) montre ekspresyon pwoteyin ki gen rapò ak tan devlopman (regression lineyè) ak relasyon ant -tubulin ak DVL-1 atravè devlopman ak spirasyon (ANOVA de-fason ki te swiv pa Tès post hoc Sidak la). Done yo montre kòm vle di ± SD.
2.2.2. Double tach imunoflfluoresans nan envèsyon ak DVL-1 ak tach nikleyè DAPI nan devlopman ak an sante ren apre akouchman ekspresyon envèsyon nan devlopman ak tisi ren apre akouchman
Nan 14yèm, 15yèm ak 16yèm GW, envèsyon montre ekspresyon granulaire fò nan g, ak ekspresyon granulaire twò grav nan sitoplasm PCT ak dct (Figi 4a, b), pandan ke yo nan 22yèm ak 38yèm GW (gade Figi 4c), fòtman. yo obsève ekspresyon pozitif nan g (Tablo 1). Ant 14yèm ak 22yèm GW, anviwon 50 pousan selil yo eksprime vèsyon an. Nan 16yèm GW a, selil pct eksprime envèrsyon nan 73 pousan selil yo, pandan y ap diminye a 29 pousan selil yo (p <0.05) nan="" 38yèm="" gw="" (gade="" figi="" 4f).="" ekspresyon="" pozitif="" nan="" envèsyon="" yo="" jwenn="" nan="" apeprè="" 80-90="" pousan="" nan="" selil="" dct="" ak="" g="" nan="" fetis="">rentisi nan 14yèm ak 16yèm GW, ak ekspresyon ki pi ba nan dct nan 38yèm GW (p <{3}}.05, p=""><0.0001, respektivman)="" kote="" 66="" pousan="" nan="" selil="" yo="" te="" pozitif.="" nan="" apre="">ren, PCt tach fòtman nan manbràn selilè apical la, pandan y ap dct tach sitou nan manbràn selilè fondamantal ak nan sitoplasm perinuclear (Figi 4d, e). Nan etap sa a, nou te jwenn ekspresyon de envèsyon nan tout envestige yorenestrikti, ki gen ladan pct, dct ak g, ak yon ekspresyon mwayèn selil pozitif nan 92 pousan pou pct, 88 pousan pou dct ak 90 pousan pou g (Figi 4f). Nou pa t 'obsève yon diferans enpòtan nan fòs siyal ekspresyon envèsyon ant estrikti yo. Ekspresyon ki pi wo nan envèsyon yo jwenn nan g, ak yon mwayèn de 94 pousan nan selil pozitif (Figi 4f). Yo jwenn yon diferans enpòtan lè w konpare tach g (kote 94 pousan selil yo tach pozitivman) ak pct, kote 58 pousan selil yo tach pozitivman (p < 0.01)="" ak="" dct,="" kote="" 49="" pousan="" selil="" yo="" se.="" pozitif="" (p=""><0.0001, figi="">
Ekspresyon DVL-1 nan devlopman ak tisi ren apre akouchman an
Yo obsève ekspresyon DVL{{0}} ki pa twò grav ak fò nan sitoplasm pct, dct ak g nan peryòd fetis la (gade Figi 4a–c, Tablo 1). Nan PCT, 76–86 pousan nan selil yo eksprime DVL-1 nan 14yèm-22yèm GW, pandan y ap nan 38yèm GW, gen 57 pousan nan selil pozitif (Figi 4g). Nan dct 14yèm ak 15yèm GW, 68–70 pousan nan selil yo eksprime DVL-1, nan 16yèm ak 22yèm GW, kantite selil pozitif desann nan 42–5{{41} } pousan, pandan ke yo nan 38th GW ekspresyon (p < 0.001),="" yo="" obsève="" nan="" 19="" pousan="" nan="" selil="" dct.="" ekspresyon="" dvl-1="" ogmante="" nan="" g="" pandan="" tout="" etap="" fetis="" yo:="" nan="" 14yèm="" gw,="" li="" se="" 6="" pousan,="" pandan="" ke="" nan="" 15yèm,="" 16yèm="" ak="" 22yèm="" gw,="" li="" ogmante="" a="" 10="" pousan="" (p="">< 0.01).="" nan="" 38="" gw="" la,="" 14="" pousan="" nan="" selil="" g="" yo="" eksprime="" dvl-1="" (figi="" 4="" g).="" nan="" peryòd="" apre="" akouchman="" an,="" iminoreaktivite="" dvl-1="" gaye="" nan="" sitoplasm="" (tablo="" 1)="" tou="" de="" pct="" ak="" dct="" (figi="" 4d,="" e).="" yo="" jwenn="" siyal="" la="" nan="" tout="" estrikti="" envestige="" yo="" men="" sitou="" nan="" sitoplasm="" perinuclear="" la.="" entansite="" ekspresyon="" dvl-1="" siyifikativman="" pi="" wo="" nan="" pct="" konpare="" ak="" dct="" ak="" g="" (p=""><0.01). 39-45="" pousan="" nan="" selil="" yo="" nan="" pct="" ak="" dct="" eksprime="" dvl-1,="" pandan="" y="" ap="" nan="" g,="" 21="" pousan="" nan="" selil="" yo="" pozitif="" (figi="" 4="" g).="" nou="" pa="" t="" 'jwenn="" yon="" diferans="" enpòtan="" ant="" pousantaj="" la="" nan="" selil="" imunoreactive="" nan="">renestrikti. Pousantaj selil imunoreaktif DVL-1 yo se 34 pousan an pct, 36 pousan nan dct ak 27 pousan nan g, respektivman (Figi 4g).
Figi 4. Tach doub imunofluoresans nan envèsyon (vèt), DVL-1 (wouj) ak DAPI (ble) nan tisi ren ki devlope ak apre akouchman (14yèm-38yèm GW, 1.5- ak {{6) }}tisi ren ki gen ane). Yo montre tach pozitif (flèch) nan chak estrikti pandan tout faz devlopman (a–c) ak peryòd apre akouchman an (d,e). Fizyone mikwofòn ansanm ak estrikti ki enterese nan korèks: tubul konvolutè proximal (pct), tubul konvolutè distal (dct) ak glomeruli (g). Kolokalizasyon envèrsyon/DVL-1 (tèt flèch) yo montre nan mikrofotografi fizyone yo. Tach kontwòl negatif yo montre kòm ensèk sou envèsyon ak DVL-1 (a). Eritrosit yo ka wè kòm selil fòtman tache tou pre dct. Detay yo montre kòm pi gwo agrandisman ensèk. Agrandisman × 40, ba echèl 100 µm. Distribisyon dinamik selil pozitif nan envèsyon ak DVL-1 nan estrikti ren yo (pct, dct, g) nan tout etap devlopman ak apre akouchman yo montre nan graf (f, g). Grafik (h) montre ekspresyon pwoteyin (kantite jeneral selil pozitif nan estrikti) ki gen rapò ak tan devlopman (regression lineyè) ak entèrelasyon envèrsyon nan DVL-1 atravè devlopman ak spirasyon (ANOVA de-fason ki te swiv pa tès post hoc Sidak la). ). Done yo montre kòm vle di ± SD.
Yo obsève ko-ekspresyon envèrsyon ak DVL-1 nan sitoplasm g ren, dct ak pct pandan devlopman (gade Figi 4a–c, fizyon). Nan peryòd apre akouchman an, ko-ekspresyon nan envèsyon ak DVL-1 karakterize diferan konpatiman selilè nan selil tubulaires nan pct ak dct, pandan y ap ko-ekspresyon nan g karakterize pa gwo prévalence nan ekspresyon envèsyon (gade Figi 4d, fizyone). ). Nan 7-ane apre akouchman an, yo wè ko-ekspresyon envèrsyon ak DVL-1 nan selil tubulaires dct ak pct, ak nan g kote ekspresyon envèrsyon an yon ti kras genyen an konparezon ak DVL-1 (Figi 4e, rantre).
2.2.3. Diferans nan ekspresyon -Tubulin, Envèsyon ak DVL-1 ant diferan etap devlopman ren ak ren apre akouchman
Kantite selil -tubulin-pozitif nan tisi ren fetis la te estatistikman pi wo anpil an konparezon ak tisi ren timoun ki gen lane 7-(13yèm (p < 0.0{)="" {11}}1),="" 15yèm="" (p=""><0.0001) ak="" 16yèm="" (p=""><0.00001) gw).="" dct="" nan="" premye="" etap="" fetis="" yo="" (13yèm,="" 15yèm,="" 16yèm="" ak="" 22yèm="" gw)="" te="" gen="" plis="" selil="" pozitif="" an="" konparezon="" ak="" tisi="" ren="" timoun="" 38yèm="" gw="" ak="" 1.5-zan="" (p=""><0.0001, respektivman,="" figi="" 3f).="" lè="" diferan="" etap="" devlopman="" yo="" te="" konpare,="" nou="" te="" jwenn="" pi="" ba="" nivo="" ekspresyon="" envèsyon="" nan="" pct="" nan="" 13yèm="" (p=""><0.0001), 15yèm="" (p=""><0.00001), 22yèm="" (p=""><0.001) ak="" 38yèm="" (p=""><0.0001) gw="" an="" konparezon="" ak="">rentisi timoun ki gen 1.5-zan. Nan dct, yo te jwenn pi ba ekspresyon envèrsyon estatistik siyifikatif lè w konpare 16yèm GW ak 38yèm tisi ren GW (p <0.0001). anplis="" de="" sa,="" yo="" te="" obsève="" ekspresyon="" ki="" pi="" ba="" nan="" envèrsyon="" nan="" dct="" nan="" tisi="" ren="" timoun="" 7-zan;="" konpare="" 13yèm,="" 15yèm="" (p=""><0.001, tou="" de),="" 16yèm="" ak="" 1.5-tisi="" ren="" ki="" gen="" lane="" ak="" dct="" nan="" tisi="" ren="" 7-zan="" (p=""><0.00001, respektivman,="" figi="" 4f).="" siyal="" la="" obsève="" nan="" ekspresyon="" dvl-1="" atravè="" etap="" yo="" diferan="" revele="" ke="" pct="" nan="" 13yèm="" (p="">< 0.01),="" 15yèm,="" 16yèm="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. Relasyon ant ekspresyon -Tubulin ak envèsyon nan DVL-1 nan devlopman ak tisi ren apre akouchman
-Tubulin ak ekspresyon envèsyon yo te konpare ak ekspresyon DVL-1 nan tout etap devlopman yo ak nan tisi ren apre akouchman an. -tubulin te gen ekspresyon estatistik pi wo nan tout etap obsève yo, konpare ak ekspresyon DVL-1 (p <0.001, figi="" 3g).="" atravè="" tout="" etap="" yo="" obsève,="" envèsyon="" te="" gen="" yon="" ekspresyon="" ki="" pi="" wo="" lè="" yo="" konpare="" ak="" dvl="" -1="" (p=""><0.0001, figi="" 4="">
2.2.5. Konparezon tach imunohistochimik ak -Tubulin, vèsyon ak DVL-1- ak analiz estatistik tisi ren patolojikman chanje (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Diferans nan tach tubulin nan MCDK, FSGS ak CNF te estatistik enpòtan an konparezon. nan tisi ren ki an sante apre akouchman kòm yon gwoup kontwòl (p < 0.0001,="" respektivman).="" tisi="" ren="" dysplastic="" te="" gen="" ekspresyon="" siyifikativman="" pi="" wo="" konpare="" ak="" gwoup="" kontwòl="" la,="" pandan="" y="" ap="" fsgs="" ak="" cnf="" te="" montre="" siyifikativman="" pi="" ba="" ekspresyon="" nan="" -tubulin="" lè="" yo="" konpare="" ak="" kontwòl="" an="" sante="" (figi="">
Envèsyon
Envèrsyon eksprime nan sitoplasm selil epitelyal dezoganize ak tubul MCDK (Figi 5a). Nan CNF, ekspresyon envèsyon karakterize g ak dct, pandan ke li montre mwens entansif nan spor pct (Figi 5b). Nan FSGS, envèsyon fòtman eksprime nan g ak dct men mwens entansif nan spor pct (Figi 5c). Ekspresyon espasyal nan envèsyon te montre yon pousantaj estatistik siyifikatif ki pi wo tach nan tisi ren ki an sante (Figi 5g) lè yo konpare ak MCDK, FSGS ak CNF (p <{4}}.0001,>
Figi 5. Tach doub iminofluoresans nan envèsyon (vèt), DVL -1 (wouj) ak DAPI (ble) nan tisi ren patolojik nan MCDK (a), CNF (b) ak FSGS (c): tubules (t) , glomeruli (g), pct kyst (c), wotè pct selil epitelyal (*). Estrikti ak selil ko-lokalizasyon envèrsyon ak DVL-1 (tèt flèch) yo montre nan seksyon yo fizyone ak detay nan ensèk pi wo agrandisman. Tach kontwòl negatif yo montre kòm ensèk sou envèsyon ak DVL-1 (a). Agrandisman ×40, ba echèl 10{{20}} µm. Relasyon nan -tubulin (d) ak envèsyon (e) nan ekspresyon DVL-1 nan MCDK, FSGS ak CNF (de-fason ANOVA ki te swiv pa tès post hoc SIDAK la). Diferans nan wotè selil epitelyal (f) nan FSGS, CNF ak MCDK pct konpare ak kontwòl an sante (yon-fason ANOVA ki te swiv pa tès post hoc Tukey a, n=50). Diferans nan pousantaj an jeneral selil pozitif nan -tubulin, envèsyon ak DVL-1 nan MCDK, CNF ak FSGS lè yo konpare ak kontwòl sante (g–i), ANOVA yon sèl-fason ki te swiv pa tès post hoc Tukey la). Done yo montre kòm vle di ± SD. Diferans enpòtan yo endike pa p-valè (* p <0.05, **="" p=""><0.01, ****="" p=""><0.0001). dvl-1="" dvl-1="" eksprime="" yon="" ti="" kras="" sèlman="" nan="" tib="" mcdk="" ki="" pa="" òganize,="" pandan="" y="" ap="" nan="" cnf,="" ekspresyon="" li="" karakterize="" dct="" ak="" g="" (figi="" 5a,b).="" nan="" fsgs,="" dvl-1="" obsève="" kòm="" reyaksyon="" twò="" grav="" nan="" g,="" dct="" ak="" pct="" (figi="" 5c).="" tisi="" ren="" ki="" an="" sante="" tache="" nan="" dvl-1="" te="" montre="" yon="" pousantaj="" siyifikativman="" pi="" wo="" nan="" tach="" (figi="" 5="" h)="" nan="" kontrèman="" ak="" mcdk="" ak="" fsgs="" (p=""><0.0001, tou="" de),="" pandan="" ke="" yo="" pa="" te="" jwenn="" okenn="" diferans="" enpòtan="" pou="">
2.2.6. Relasyon ant ekspresyon -Tubulin ak envèsyon DVL-1 nan tisi ren ki chanje patolojik (MCDK, CNF, FSGS)Nan MCDK, FSGS ak CNF, -tubulin tache siyifikativman pi wo pase DVL-1 (p <0.0001, respektivman,="" figi="" 5d).="" envèsyon="" tache="" siyifikativman="" pi="" wo="" lè="" yo="" konpare="" ak="" dvl-1="" nan="" mdck="" (p=""><0.0001) ak="" nan="" fsgs="" (p=""><0.01, figi="">
2.2.7. Diferans ki genyen nan wotè selil epitelyal nan tib konvolusyon pwoksimal ant kontwòl sante ak tisi ren ki chanje patolojikman (MCDK, CNF, FSGS)Wotè selil epitelyal pct yo (n {{0}} pou chak gwoup) te konpare ant selil tubul yo nan tisi ren ki an sante ak tisi ren ki chanje patolojikman (Figi 5b, c, f). Mwayèn wotè selil epitelyal nan HC te 12.91 µm ± 1.847 µm e li te siyifikativman pi wo lè yo konpare ak CNF ak FSGS (p <0.0001, respektivman).="" mwayèn="" wotè="" selil="" nan="" cnf="" pct="" te="" 9.011="" µm="" ±="" 1.453="" µm,="" pandan="" ke="" yo="" nan="" fsgs="" te="" 8.114="" µm="" ±="" 0.9248="" µm.="" selil="" epitelyal="" pct="" nan="" mcdk="" pa="" t="" 'montre="" chanjman="" enpòtan="" nan="" wotè="" (12.17="" µm="" ±="" 1.476="" µm)="" lè="" yo="" konpare="" ak="">
2.2.8. Diferans nan longè sily prensipal ant kontwòl ki an sante ak tisi ren ki chanje patolojikman (MCDK, CNF, FSGS)
Longè sily prensipal (n= 50 pou chak gwoup) te konpare ant HC ak tisi ren ki chanje patolojikman (Figi 6c). Tisi ren ki an sante yo ak MCDK yo te tache ak -tubulin pou rasire espesifik nan -tubulin cilium tach (Figi 6a, b). Nan tisi ren ki an sante, silyom prensipal te 5.065 µm ± 1.229 µm longè, pandan ke nan MCDK, CNF ak FSGS te siyifikativman pi long (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
Diskisyon
Objektif etid nou an se te mennen ankèt sou yon ekspresyon imunoistochimik nan a-tubulin, envèsyon ak DVL-1 nan fetis la.rentisi ak tisi ren apre akouchman. Anplis de sa, nou te vle eksplore si ekspresyon ak modèl tach a-tubulin, envèsyon ak DVL-1 detounen nan diferan maladi ren lè yo konpare ak kontwòl an sante. Savwa, malgre enterè anpil lòt chèchè yo sou wòl a-tubulin, envèrsyon ak DVL-1 pandan devlopman ren, pifò etid anvan yo te itilize bèt oswa modèl eksperimantal vitro. Dapre nou konnen, sa a se premye etid ki te montre ekspresyon ak lokalizasyon nan a-tubulin ansanm ak envèsyon ak DVL-1 nan ren fetis ak apre akouchman imen, epi ki te eksplore ekspresyon nan pwoteyin mansyone nan ren. maladi, tankou MCDK, FSGS ak CNF. Nou te analize tou chanjman nan longè sily ak aparans pa limyè ak mikwoskòp elèktron, kòm etid anvan nou an te deja endike ke twoub silyè yo ka asosye ak cystogenesis nan FSGF ak CNF [19].
Nan chemen kanonik Wnt-siyal la, lyen Wnt ligand yo ak reseptè rekrite Dvl [37]. Pwosesis MET la ak wout polarite selil planè a pandan premye etap yo nan morfogenesis ren yo kontwole pa siyal Wnt la. Pa medyatè chemen Wnt la, sily prensipal la kontwole pwopagasyon selil, diferansyasyon ak mòfogenesis tisi [12] atravè òganize sitoskelèt selilè a ak oryantasyon selil yo ansanm ak elongasyon estrikti tubulaires [2,38]. Nan etid nou an, -tubulin, envèrsyon ak DVL-1 yo tout te prezan nan estrikti ren yo, epi yo te colocalize pa sèlman pandan devlopman ren fetis la, men tou nan tisi ren ki soti nan 1.5- ak {{9. }}timoun ki gen ane. Konklizyon sa yo an akò ak deklanchman Wnt-siyal chemen an ki te pwouve yo rive deja pandan tubulogenesis [39]. Anplis de sa, rezilta nou yo te revele ke ekspresyon -tubulin ak envèsyon yo gen rapò resipwòk ak DVL-1 epi yo montre yon diferans estatistik enpòtan ant modèl ekspresyon yo. Sa se nan korelasyon ak modèl eksperimantal, kòm mitasyon an nan fanmi an plen pwoteyin Dvl nan sourit rezilta nan yon mank de pwosesis gastrulation, pandan y ap mitasyon ki pa enkli tout fanmi an pwoteyin montre domaj nan plasman sily nodal ansanm ak domaj ògàn [40] . Konklizyon anvan yo sijere ke envèrsyon gen yon wòl nan migrasyon selil nan Xenopus pronephros. Piske segman sa a gen rapò ak bouk mamifè Henle ak tib distal yo, sa ka endike enpòtans envèrsyon pandan devlopman ren nan imen tou [41]. An akò ak site sa a, etid anvan yo divilge ke mitasyon nan jèn envèsyon an te kapab lakòz nefronoftiz tip 2, ki se medyatè pa nòmal ekspresyon DVL-1 [42]. Malgre wòl silyom prensipal yo te kontwovèsyal nan règleman Wnt-siyal wout la, nou te jwenn ke -tubulin colocalized ak envèrsyon ak DVL-1 nan echantiyon ren yo analize. Anplis de sa, etid anvan yo te fè remake ke silyom prensipal la ansanm ak envèrsyon kontwole degradasyon Dvl pa enfliyanse wout la siyal Wnt [43]. Nan maladi ren moun ki asosye ak devlopman spor, yo te obsève lokalizasyon nòmal ak fonksyon sily prensipal [19]. Menm jan an tou, etid aktyèl la konfime tou chanjman mòfolojik nan fòmasyon sily prensipal nan kondisyon patolojik tankou CNF, FSGS ak MCDK. Konklizyon anvan yo te rekonèt ke twòp-aktivasyon nan chemen Wnt kanonik la apre domaj nan ren mennen nan chanjman estriktirèl irevokabl nan tisi ren [44]. Okontrè, silyom prensipal yo te bay wòl nan chanje soti nan chemen Wnt kanonik ak non kanonik nan ede.renreparasyon. Anplis de sa, sou-aktivasyon nan chemen an kanonik Wnt nan tisi ren transplante'tèt yo te jwenn yon valè prediksyon pozitif nan direksyon fibwoz ren [45]. Si chemen Wnt kanonik la genyen plis pase sou depans ki pa kanonik, li sipòte teyori fibwoz ren an kòm rezilta. Konklizyon nou yo nan bese-tubulin ak ekspresyon envèsyon nan CNF ak FSGS vle di inaktivite nan chemen Wnt ki pa canonical, espesyalman paske tou de kondisyon yo gen tandans mennen nan etap final la.maladi ren.Savwa, yo kwè ke lokalizasyon nòmal ak fonksyon silyom prensipal ta ka yon faktè nan kenbe yon chemen Wnt regilye epi, Se poutèt sa, yon avantou pou devlopman nòmal. Kontrèman, si wout Wnt la amelyore, li ka lakòz pwopagasyon selilè disregulated ak diferansyasyon ki mennen nan kanserojèn [46]. Jan yo te dekri anvan an, chemen Wnt kanonik la obligatwa pou inisyasyon MET ak fòmasyon nefwon an, alòske twoub li ka mennen nanrenipoplasi [47]. Rezilta nou yo sipòte lide sa a nan revele ekspresyon ki pi ba nan DVL-1 ak ekspresyon ki pi wo nan -tubulin nan MCDK an konparezon ak kontwòl an sante. Rezilta sa yo ka vle di deklanchman ki pi ba nan chemen Wnt kanonik la, ki ta ka yon kòz kache pou absans fòmasyon nefwon an. Kontrèman, ekspresyon ki pi wo a -tubulin ak ekspresyon DVL-1 ki pi ba a ta ka eksplike rezilta plizyè spor paske pa gen okenn elongasyon òganize ak polarizasyon selil ki gide pa chemen Wnt ki pa canonical la. Etid anvan yo te montre tou ke envèrsyon anpeche chemen siyal Wnt kanonik la lè yo vize Dvl pou degradasyon [26]. Etap sa a nan entèraksyon yo te jwenn nesesè yo anpeche kanonik Wnt-siyal nan antretyen an nan elongasyon nòmal tubulaires ak pwezante. Mitasyon envèsyon rezilta nan regilasyon nan siyal Wnt kanonik, ki imedyatman pwovoke pwopagasyon nòmal nan selil tubulaires. Yo te pwouve etap sa a enpòtan anpil nan cystogenesis [42], pandan ke knockout nan envèsyon nan sourit mennen nan maladi ren polikistik [48]. Dapre teyori a nanrencystogenesis, envèsyon konsidere kòm yon "mycoprotein", paske nan lokalizasyon li nan sily prensipal nanrenselil tubulaires. Nan etid nou an, sily prensipal yo te prezan sou sifas selil apical selil tubulèr yo nan tout etap yo analize, pandan y ap pandan etap fetis la, ekspresyon -tubulin te pi fò pase nan peryòd apre akouchman an.
CISTANCHE AP AMELIORE DOULÈ REN/REN
Etid anvan yo te montre ke fonksyon sily prensipal yo ka afekte pa dysregulation nan -tubulin pandan devlopman, ki ka mennen nan cystogenesis, devlopman nòmal nan ren ak posib maladi ren kwonik nan anfans [31,49]. Sa a se an akò ak konklizyon nou yo nan sila prensipal ki pi kout ak dismorphic obsève nan MCDK oswa ak sily miltip ak ekstrèmman long oswa disloke yo te jwenn nan tubul dilate nan CNF ak FSGS lè yo konpare ak kontwòl an sante. Pou sipòte lefèt ke kanonik ak non kanonik Wnt-siyal chemen yo, reglemante pa sily prensipal yo, yo konsidere kòm obligatwa pou devlopman nòmal ren, nou te jwenn siyifikativman pi ba tach nan envèsyon ak DVL-1 nan MCDK lè yo konpare ak kontwòl an sante. [31,49]. Diferan dinamik modèl ekspresyon nan -tubulin, envèrsyon ak DVL-1 nan diferan faz devlopman ren yo ka endike chanje ant chemen siyal Wnt kanonik ak non kanonik pandan mòfogenesis ren nòmal. Nou sijere ke echanj yo detèmine transkripsyon nan chemen kanonik oswa lòd migrasyon selil ak polarizasyon pandan devlopman ren nan yon chemen siyal ki pa kanon. Balans yo ak ekspresyon yo nan tout estrikti ren envestige yo vle di wòl enpòtan yo nan devlopman nòmal nan ren yo. Pandan devlopman nòmal nan ren (soti nan 13yèm GW rive nan 38yèm GW), ekspresyon jeneral -tubulin, envèsyon ak DVL-1 ap diminye pandan tisi ren yo vin gen mòfoloji ki gen matirite. Nan tisi ren 1.5- ak 7-zan, -tubulin ak envèsyon te montre yon ti ogmantasyon nan ekspresyon ki sipòte lefèt ke chemen Wnt ki pa canonical la rete aktif apre nesans. Okontrè, DVL-1 pèsiste ak modèl ekspresyon diminye, sa ki ka ajoute nan yon konklizyon ke chemen Wnt kanonik la silans nan tisi ren ki an sante. Kòm yon rezilta nan kondisyon ren patolojik, selil epitelyal nan ren an ta ka reyaji ak re-aparisyon nan EMT ak fibwoz [50] ki asosye ak reyaktivasyon nan chemen an kanonik Wnt [44]. Se poutèt sa, latwoublay nan -tubulin, envèrsyon ak DVL-1 yo te jwenn nan ren malad yo ta ka mekanis ki kache a patolojik ak yon rezilta nan chanjman an soti nan non-kanonik nan kanonik Wnt chemen nan ren an devlope alizyon ak chanjman ki genyen ant revèsib a irevokabl. domaj. Anplis de sa, chanjman nan prenatal ak apre akouchman yorenmodèl ekspresyon ka asosye ak defisyans nan fonksyon ren nan adilt, ki mennen nan maladi konjenital ak ensifizans ren kwonik.
4. Materyèl ak Metòd
4.1. Echantiyon Imèn
Echantiyon tisi ren fetis yo te kolekte apre pèt gwosès nan 14yèm, 15yèm, 16yèm, 22yèm ak 38yèm GW nan Depatman jinekoloji ak òvejyen nan University Hospital Center Split. Tout materyèl fetis akeri te egzamine pa yon patolojis, epi sèlman tisi ki pa gen siy anomali, maserasyon oswa lanmò nan matris ak kariogram nòmal yo te itilize pou etid la. Dosye medikal manman yo te egzamine anvan yo te pran echantiyon yo epi nan ka ta gen pwoblèm sante ki ta ka enfliyanse rezilta gwosès, tisi ren yo te eskli nan etid la. Matirite te detèmine pa sikonferans tèt, sikonferans nan vant ak longè femoral [51] nan korelasyon ak kalandriye règ pasyan yo. Yo te kolekte echantiyon tisi ren ki gen 1.5- ak 7-an apre lanmò aksidan. Yo te jwenn echantiyon yo nan Depatman Patoloji nan University Hospital Center Split. Echantiyon yo nan tisi ren dysplastic multicystic (MCDK) yo te jwenn apre pèt gwosès, glomerulosclerosis segmantal fokal (FSGS) ak sendwòm nefrotik nan kalite Finnish (CNF) yo te jwenn akòz nefrektomi. Tout materyèl akeri yo te egzamine ak evalye pa yon patolojis, ki klasifye dyagnostik yo. Pwotokòl etid la te apwouve pa Komite Etik nan University of Split School of Medicine (20 me 2016) an akò ak Deklarasyon èlenki a ak mizajou li yo (klasifikasyon nimewo: 003-08/16-03/0001, nimewo rejis: 2181-198-03-04-16-0024, 20 me 2016) [52].
4.2. Imunohistochimi
Yo te trete fiksasyon echantiyon tisi yo kolekte ak 4 pousan paraformaldehyde nan saline tampon fosfat (PBS) pou 24 èdtan nan 22 ◦C. Apre dezidratasyon nan 100 pousan etanòl, echantiyon yo te entegre nan parafine, jan sa dekri deja [53]. Espesimèn yo te tranche nan seksyon 5 µm epè lè l sèvi avèk yon mikrotom epi answit monte sou glisad mikwoskòp. Pou verifye konsèvasyon tisi yo, yo te tache chak 10yèm seksyon ak ematoksilin ak eozin [54]. Depart-feminizasyon ak imunohistochimi yo te fèt jan sa te dekri deja [2,55,56]. Apre rense nan PBS, glisad mikwoskòp yo te enkube lannwit lan ak antikò prensipal nan yon chanm imid nan 22 ◦C (StainTray glisad tach sistèm; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Antikò prensipal yo te itilize yo te lapen monoklonal anti-alfa tubulin antikò (dilution 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), lapen poliklonal Anti-envèsyon antikò (dilution 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), sourit monoklonal DVL -1 antikò (dilusyon 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) ak antikò poliklonal anti-gama tubulin lapen (pou verifye tach prensipal sily espesifik ak alfa- tubulin, 1:500 dilution; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Apre rense nan PBS, antikò segondè yo te administre pou inèdtan jan lis la: bourik anti-lapen IgG H&L, Alexa Fluor 488 (dilution 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) ak kabrit anti-sourit IgG H&L, TRITC (dilution). 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) yo te itilize 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) pou tach nwayo yo epi apre yon 2-min enkubasyon, glisad. yo te lave nan PBS ak kouvri ak mwayen aliye ak kouvèti. Yo te anpeche tach ki pa espesifik lè w itilize blòk pwoteyin (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) anvan aplikasyon antikò prensipal la. Kòm yon kontwòl negatif, yo te fè yon tès pre-adsorption, pandan y ap spécificité nan antikò segondè yo te tcheke pa omisyon antikò prensipal yo nan pwosedi yo tach.
4.3. Mikwoskopi elektwonik
Fiksasyon nanrentisi yo te fèt nan 4 pousan paraformaldehyde pou 24 èdtan, ki te swiv pa post-fixation nan 1 pousan osmium tetoksid pou 1 èdtan. Pwosesis dezidratasyon an te fèt ak seri etanòl epi li te fini ak entegre nan résine LX 112 [22]. Yon sèl-mikromèt seksyon mens yo te tache lè l sèvi avèk toluidin ble ak etidye yo chwazi seksyon ultrathin. Seksyon ultramens ak yon epesè 0.05 mikromèt yo te egzamine apre tach ak acetate uranyl ak sitrat plon. Yo te itilize mikwoskòp JEOL 1200 EX pou jwenn mikrofoto yo.
4.4. Analiz jenetik
Jan yo te dekri deja [19], lè l sèvi avèk lekosit ki soti nan san periferik la, yo te ekstrè ADN jenomik. Yo te jwenn yon mitasyon omozigot missense nan jèn NPHS1 (c.1096A> C; p.Ser366Arg) ki konfime dyagnostik sendwòm nefrotik konjenital kalite Finnish (CNF) [57].
CISTANCHE AP AMELIORE RENFEKSYON REN/REN
4.5. Analiz done
Analiz seksyon an te fèt sou yon mikwoskòp fliyoresan FL lè l sèvi avèk 3 chanèl fliyoresan FL (Olympus BX51, Tokyo, Japon). Imaj yo te kaptire pa kamera dijital DP71 (Olympus, Tokyo, Japon) sou gwo pouvwa (×40) agrandisman. Se sèlman larencortical ki gen tibil proximal convoluted (pct), distal tubul convoluted (dct) ak glomeruli (g) te enterese. Apre sa, imaj yo te trete pa lojisyèl ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (aksè sou 15 oktòb 2018), 1997–2021. ) ak Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kalifòni, USA) pou plis evalyasyon. Anvan konte selilè yo, yo te itilize zouti ImageJ chanèl fann yo. Apre sa, foto mikwoskopik imunofluoresans orijinal la te soustraksyon pa chanèl wouj oswa vèt (selon sa kanal orijinal la te) lè l sèvi avèk zouti ImageJ kalkilatris imaj la pou anpeche flit siyal. Valè ki anba nivo papòt 50 yo te konsidere kòm negatif. Nou konte siyal iminoreaktif nan selil ki gen omwen 20 estrikti (pct, dct oswa g) pou chak etap oswa kantite total pozitif pou chak mikwo foto displastik multisistik.rentisi, FSGS ak CNF. Nou klase selil yo kòm pozitif si siyal imunofluoresans la akimile nan nenpòt nivo manbràn, sitoplasm oswa nwayo ki pi wo a valè 50 mezire sou lojisyèl ImageJ lè l sèvi avèk lòd papòt la. Selil negatif yo te klase kòm selil ki pa gen okenn iminoreaktivite. De envestigatè endepandan analize done yo.
4.6. Analiz semiquantitative
Entansite -tubulin, envèrsyon ak siyal tach DVL-1 te evalye pa de chèchè endepandan ki itilize lojisyèl ImageJ. Yo te mezire entansite siyal jeneral apre imaj la te mete nan 8-ti kalite; apre sa, yo te evalye entansite makè makè a nan 20 pct, dct ak g lè w mezire zòn ki dekri nan estrikti a. Si rezilta ant evalyatè yo te diferan, yon twazyèm chèchè endepandan klarifye dout la. Maksimòm entansite siyal pou -tubulin te 84.125 ± 3.214 SD, pou envèrsyon te 71.50 ± 2.715 SD ak pou DVL -1 80.916 ± 1.875 SD. Saturasyon ki pi wo nan koulè siyal sou foto mikwoskòp yo te make kòm 3 (66.66-99.99 pousan nan entansite imaj siyal jeneral), ki te swiv pa 2 (33.33-66.66 pousan) pou entansite entèmedyè siyal la ak 1 (0.33 pousan -33.33 pousan) pou entansite siyal ki ba (Tablo 1.).
4.7. Analiz estatistik
Pou detèminasyon diferans ki genyen ant etap ak estrikti, tès Kruskal-Wallis la te fè, ki te swiv pa post hoc Dunn a lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego Kalifòni, USA, www.graphpad.com (aksè sou 15 Oktòb). 2018.)). Nimewo a nan selil pozitif yo te eksprime nan pousantaj kòm valè vle di ± devyasyon estanda (SD), pandan y ap siyifikasyon estatistik yo te rekonèt nan p <0.05. kantite="" estrikti="" analize="" yo="" te="" 4200="" nan="" 35="" echantiyon,="" ak="" yon="" kantite="" total="" 135,256="" selil="" konte.="" nou="" te="" itilize="" 2-way="" anova="" ak="" tès="" post="" hoc="" sidak="" la="" pou="" teste="" diferans="" ki="" genyen="" nan="" ekspresyon="" -tubulin,="" envèrsyon="" ak="" dvl-1="" nan="" diferan="" etap="" devlopman.="" pou="" etidye="" ekspresyon="" pwoteyin="" konsènan="" tan="" devlopman,="" nou="" itilize="" lineary="" regresion.="" yon="" sèl-fason="" anova="" ki="" te="" swiv="" pa="" tès="" post="" hoc="" tukey="" a="" te="" itilize="" pou="" eksplore="" diferans="" ki="" genyen="" nan="" ekspresyon="" -tubulin,="" envèrsyon="" ak="" dvl-1="" nan="">rentisi konpare ak tisi nan MCDK, FSGS ak CNF. Diferans nan ekspresyon pwoteyin ant MCDK, FSGS ak CNF yo te envestige ak 2-way ANOVA ki te swiv pa tès post hoc Sidak la. Yon sèl-fason ANOVA ki te swiv pa tès post hoc Tukey a te itilize pou evalye diferans ki genyen nan longè sily ak wotè selil epitelyal nan PCT ant kontwòl sante ak patolojik.rentisi yo. Done yo te montre kòm valè mwayèn ± devyasyon estanda (SD) ak diferans estatistik rekonèt nan p <>
