FOXO kontwole ekspresyon peptides antimikwòb epi ankouraje fagositoz emosit nan iminite anti-bakteri kribich.
Aug 31, 2023
Résumé
Envètebre yo konte sou iminite natirèl, ki gen ladan iminite umoral ak selilè, pou reziste kont enfeksyon patojèn. Etid anvan yo te montre ke faktè transkripsyon bwat forkhead O (FOXO) patisipe nan repons iminitè mukozal mamifè yo ak règleman iminitè umoral zantray envètebre yo. Sepandan, si FOXO patisipe nan règleman iminite sistemik ak selilè nan envètebre yo rete enkoni. Nan etid la prezan, nou idantifye yon FOXO ki soti nan kribich (Marsupenaeus japonicus) epi nou te jwenn ke li te eksprime nan nivo relativman fondamantal nan kribich nòmal, men li te upregulated anpil nan kribich defye pa Vibrio anguillarum. FOXO te jwe yon wòl enpòtan nan kenbe omeostazi emolinf ak mikrobyota entesten lè li ankouraje ekspresyon Relish, faktè transkripsyon chemen defisyans iminitè (IMD) pou ekspresyon peptides antimikwòb (AMP) nan kribich. Nou te jwenn tou ke enfeksyon patojèn aktive FOXO ak pwovoke translokasyon nikleyè li yo pa diminye aktivite serin / treonin kinaz AKT. Nan nwayo a, aktive FOXO dirèkteman regle ekspresyon jèn Amp ak Relish sib li yo kont enfeksyon bakteri. Anplis de sa, FOXO te idantifye kòm patisipe nan iminite selilè pa ankouraje fagositoz nan emosit atravè upregulating ekspresyon reseptè fagocytotic scavenger reseptè C a (Src), ak de ti GTPases, Rab5 ak Rab7, ki gen rapò ak trafik phagosome nan lizozom la. nan sitoplasm la. Ansanm, rezilta nou yo endike ke FOXO egzèse efè li sou omeyostazi emolinf ak mikrobiota enterik la lè li aktive chemen IMD nan kribich nòmal, epi dirèkteman oswa endirèkteman ankouraje ekspresyon AMP ak amelyore fagositoz emosit kont patojèn nan kribich ki enfekte ak bakteri. Etid sa a revele fonksyon yo diferan nan FOXO nan mukozal (lokal) ak sistemik iminite anti-bakteri nan envètebre.
benefis sipleman cistanche-ki jan yo ranfòse sistèm iminitè
Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity
【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Entwodiksyon
Pwoteyin fanmi O (FOXOs) transkripsyon bwat forkhead yo enplike nan divès pwosesis byolojik kritik nan òganis yo, ki gen ladan règleman sik selilè, reparasyon ADN domaje, iminite anti-kansè, ak règleman lavi [1,2]. Mamifè yo gen kat pwoteyin diferan FOXO (FOXO1, FOXO3, FOXO4, ak FOXO6); sepandan, envètebre yo gen yon sèl FOXO, ki rele tou Daf-16 nan Caenorhabditis elegans [3]. Aktivite transkripsyon FOXO kontwole pa plizyè kalite modifikasyon apre tradiksyon, tankou fosforilasyon, asetilasyon, metilation, ak ubiquitination [4]. Modifikasyon sa yo afekte translokasyon nikleyè FOXO oswa sòti nan nwayo a, ak entèraksyon li yo ak ko-represè ak ko-aktivatè, ki ka ankouraje oswa diminye aktivite FOXO ak medyatè diferan fonksyon byolojik li yo [5,6]. Apre aktivasyon, FOXO patisipe nan anpil fonksyon fizyolojik pa reglemante transkripsyon yon varyete jèn sib [7]. FOXO yo aktive pa divès kalite stimuli ekstraselilè, ki gen ladan faktè kwasans, sitokin, ak òmòn [8]. Siyal kwasans, tankou ensilin oswa ensilin-like growth factor 1 (IGF-1), kominike avèk reseptè chemen ensilin yo epi aktive siyal fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K), ki mennen nan fosforilasyon FOXO pa la. serin/treonin kinaz, pwoteyin kinaz B (AKT) [9]. Fosforil FOXO transloke soti nan nwayo a nan sitosol la, oswa anpeche translokasyon li soti nan sitosol nan nwayo a, kote li vin omnikwitine, ki mennen nan degradasyon li pa proteazòm la [10]. Kontrèman, nan absans siyal kwasans ekstèn, chemen siyal PI3K-AKT la inaktif, epi FOXO ki pa fosforil transloke nan nwayo a pou ankouraje transkripsyon jèn sib [11]. FOXO patisipe tou nan repons iminitè natirèl anti-bakteri ak anti-viris envètebre [12,13]. Aktivasyon kwonik nan FOXO nan trip yo ki aje nan Drosophila reprime ekspresyon an nan peptidoglycan rekonesans pwoteyin SC2 (yon regilatè negatif nan chemen an defisi iminitè (IMD)) ak kraze omeyostazi iminitè entesten [14]. FOXO dirèkteman kontwole jèn peptide antimikwòb (AMP) nan tisi epitelyal Drosophila ki pa enfekte an repons a estrès grangou, ki se endepandan de chemen iminite natirèl ki reponn a patojèn [15]. Sepandan, enfeksyon patojèn kapab tou pwovoke enterocyte FOXO antre nan nwayo a soti nan sitoplasm la dirèkteman nan trip Drosophila [12]. Règleman FOXO-depandan nan AMP yo rive tou nan tisi epitelyal mamifè yo, sijere ke sa a se evolisyonèman konsève nan bèt [16]. Plizyè etid te montre ke FOXO yo aktive pa patojèn oswa eksitasyon cytokine nan repons iminitè mukozal [17]. Translokasyon yo nan nwayo a ak obligatwa nan pwomotè jèn sib yo ankouraje pa chemen kinaz pwoteyin mitogen-aktive (MAP) ak inibit pa chemen an PI3K/AKT. Jèn sib yo nan FOXO yo gen ladan molekil siyal pro-enflamatwa, molekil adezyon, ak reseptè chemokine [17]. Si FOXO yo patisipe nan repons iminitè sistemik kont patojèn yo pa klè. Pwomosyon ekspresyon AMP kont ajan patojèn se yon mekanis enpòtan nan iminite immoral natirèl nan envètebre [18]. Nan iminite natirèl Drosophila, chemen Toll ak IMD yo patisipe nan règleman ekspresyon AMP, ak AMP yo jwe wòl enpòtan nan eliminasyon patojèn anvayi [19-21]. Menm jan ak iminite ensèk, Toll, IMD, ak Janus kinaz (JAK) / transducer siyal ak activator nan transcription (STAT) chemen yo patisipe nan règleman ekspresyon AMP nan kristase [22,23]. Si FOXO ka kontwole ekspresyon AMP yo endepandan de chemen Toll, IMD, ak JAK/STAT kont enfeksyon patojèn nan kristase yo mande pou klarifikasyon. Anplis iminite umoral, envètebre tou konte sou iminite selilè pou fè fonksyon iminite natirèl kont enfeksyon patojèn. Fagositoz pa emosit se youn nan mekanis enpòtan pou iminite selilè kont enfeksyon patojèn [24]. Etid anvan yo te jwenn ke FOXO 1-medyatè otofaji obligatwa pou devlopman selil asasen natirèl (NK) [25]. Anplis, FOXO patisipe nan pwomosyon fagositoz bakteri pa netrofil [26]. Malgre ke pa gen okenn selil iminitè espesyalize nan kristase, tankou selil NK oswa neutrofil, emosit kribich yo ka egzèse iminite sistemik natirèl kont enfeksyon bakteri patojèn atravè fagositoz [27]. Sepandan, si FOXO patisipe nan fagositoz patojèn nan emosit nan kribich la pa klè. Akwakilti kribich la se youn nan endistri ki pi rapid nan mond lan pou pwodui pwoteyin bèt e li te fè yon kontribisyon enpòtan pou satisfè demann ogmante atravè lemond pou pwoteyin bèt. Kounye a, pwodiksyon mondyal kribich la se apeprè 4.88 milyon tòn ak yon valè anviwon 39 milya USD [28]. Sepandan, elve gwo kantite bèt ansanm rezilta nan estrès bèt sibstansyèl, ki fasilite patojèn, tankou bakteri ak viris, miltiplikasyon ak maladi klinik, ki lakòz gwo pèt ekonomik nan endistri a [29]. Etid mekanis iminitè kribich yo ka bay nouvo estrateji pou prevansyon ak kontwòl maladi [30]. Nan etid sa a, nou idantifye yon FOXO nan kribich kuruma (Marsupenaeus japonicus). Apre knockdown ekspresyon Foxo, swiv defi Vibrio anguillarum, nou te jwenn ke kapasite nan clearance bakteri ak pousantaj siviv kribich diminye anpil. Plis etid endike ke FOXO ankouraje ekspresyon AMP yo dirèkteman oswa endirèkteman, ak amelyore fagositoz nan bakteri nan kribich la. Mekanis posib efè FOXO kont enfeksyon patojèn nan kribich yo te analize.
cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè
Rezilta yo
FOXO eksprime nan nivo fondamantal nan kribich ki pa konteste epi li se regilasyon anlè nan kribich ki defye ak V. anguillarum.
Soti nan sekans transcriptom emosit nan M. japonicus, nou te jwenn tout longè sekans cDNA Foxo (nimewo aksè GenBank: MW080526). Konparezon domèn te montre ke pwoteyin FOXO prevwa a gen yon domèn Forkhead (FH), ki sanble ak Homosapiens FOXO ki gen ladan FOXO1, FOXO3, FOXO4, ak FOXO6, epi li pote fosforilasyon AKT menm jan an (S1A Fig). Rezilta analiz filogenetik yo te montre ke FOXO yo te divize an de grap ki gen ladan FOXO vètebre ak envètebre, ak FOXO kribich la te gwoupe nan branch envètebre nan pye bwa a filogenetik (S1B Fig). Menm jan ak FOXO imen [31], kribich FOXO gen sit modifikasyon fosforilasyon ekstraselilè kinaz reglemante (ERK) ak sit modifikasyon acetylation CREB Binding Protein (CBP), men pa gen sit modifikasyon sir tuin 1 (SIRT1) deacetylation ak c-JUN N-terminal. kinaz (JNK) fosforilasyon modifikasyon sit (S2 Fig). Antikò poliklonal ki rekonèt kribich FOXO yo te prepare lè l sèvi avèk domèn FH recombinant nan FOXO ki eksprime nan Escherichia coli (Fig 1A). Analiz distribisyon tisi FOXO nan nivo mRNA ak pwoteyin te revele ke li te eksprime nan tout tisi yo teste (figi 1B). Kou tan nan ekspresyon FOXO nan emosit yo ak trip nan kribich defye pa V. anguillarum te analize lè l sèvi avèk qPCR ak Western blotting. Rezilta yo te montre ke FOXO te regilasyon nan emosit yo ak trip nan nivo mRNA (figi 1C ak 1D) ak nan nivo pwoteyin (figi 1E ak 1F). Rezilta sa yo sigjere ke FOXO patisipe nan repons pou enfeksyon V. anguillarum ak pouse nou eksplore fonksyon FOXO nan iminite kribich la.
FOXO patisipe nan règleman omeyostaz emolinf ak mikroflor entesten nan kribich ki an sante.
Pou eksplore fonksyon FOXO nan omeyostaz emolinf ak entesten mikroflor nan kribich, yo te fè entèferans RNA epi yo te analize chaj bakteri an. Rezilta yo te montre ke ekspresyon Foxo diminye anpil nan kribich Foxo-RNAi (figi 2A ak 2B). Efè Off-sib Foxo RNAi te analize tou lè yo detekte ekspresyon lòt jèn fanmi Fox (ki gen ladan Foxk2 ak Foxn3). Rezilta yo te montre ke knockdown Foxo pa t diminye nivo ekspresyon Foxk2 oswa Foxn3 (S3A-S3C Fig). Sèvi ak tès Western blotting ak fliyoresan imunositochimik, nou te obsève plis distribisyon subselilè FOXO nan trip yo ak emosit kribich ki defye pa bakteri apre silans Foxo. Rezilta yo te montre ke konpare ak gwoup la dsGfp, nivo FOXO nan nwayo a diminye anpil nan kribich Foxo-RNAi, menm si kribich la te enfekte pa V. anguillarum (S3D–S4E' Figi). Tout rezilta ki anwo yo sigjere ke tès Foxo RNAi nou an te kapab espesyalman silans Foxo nan emosit ak trip (tankou nan sitoplasm la ak nwayo). Apre sa, nou analize chaj bakteri an nan emolinf ak trip apre knockdown Foxo nan kribich nan kondisyon nòmal (san defi bakteri). Rezilta yo te montre ke kantite bakteri nan emolinf ak trip yo te ogmante anpil apre ekspresyon Foxo te kraze avèk siksè (figi 2C ak 2D). Nou analize plis pousantaj siviv Foxo-RNAi kribich san defi bakteri, ak rezilta yo te montre ke pousantaj siviv Foxo-knockdown kribich diminye anpil konpare ak kontwòl la (Fig 2E). Pou plis verifye rezilta sa yo, nou analize pousantaj siviv kribich Foxo-RNAi trete ak antibyotik ak rezilta yo te montre ke konpare ak gwoup dsGfp, to siviv kribich la san jèm pa te siyifikativman diminye (Fig 2F). Tout rezilta yo sigjere ke FOXO jwe yon wòl nan omeyostazi mikrobyota in vivo (ki gen ladan emolinf ak mikrobyota enterik) nan kribich nan kondisyon nòmal.
benefis sipleman cistanche-ogmante iminite
FOXO patisipe nan règleman omeyostaz emolinf ak mikwoflor entesten nan fè pwomosyon ekspresyon Relish ak Amp nan kribich ki an sante.
Etid anvan yo demontre ke kribich ki an sante gen yon kantite bakteri ki ba men ki estab nan emolinf sikile a, ak yon gwo kantite bakteri nan aparèy gastwoentestinal, ak efè iminitè yo, tankou peptides antimikwòb (AMP) ki reglemante pa faktè nikleyè kappa B (NF). -κB) chemen ak espès oksijèn reyaktif (ROS) reglemante pa chemen an doub oksidaz (DUOX), jwe yon wòl esansyèl nan emolinf omeyostaz ak mikrobyota entesten [32-34]. Pou eksplore mekanis nan patisipasyon FOXO nan règleman an nan omeyostazi emolinf ak entesten mikroflor nan kondisyon nòmal, nou premye detekte distribisyon an subselilè nan FOXO nan emosit ak trip nan kondisyon nòmal. Rezilta yo te montre yon siyal fèb nan FOXO nan nwayo emosit kribich yo ak selil trip yo nan kondisyon nòmal (figi 3A ak 3B), sijere ke yon ti kras FOXO te aktive pa mikrobiota in vivo nan kribich la nan kondisyon nòmal. Se ekspresyon AMP reglemante pa chemen IMD nan trip Drosophila [35]. Se poutèt sa, nou sipoze ke faktè transcription Relish ta ka yon jèn sib nan FOXO. Nou te detekte ekspresyon mRNA Relish, faktè transkripsyon chemen IMD la, nan emosit kribich ak trip apre kraze Foxo. Rezilta yo te montre ke ekspresyon Relish diminye anpil nan kribich Foxo-knockdown (Fig 3C ak 3D), ak rezilta menm jan yo te jwenn nan nivo pwoteyin (Fig 3E ak 3E '). Rezilta yo sijere ke FOXO ta ka ankouraje ekspresyon Relish ak aktive chemen IMD la. Pou konfime ke FOXO patisipe nan omeyostazi emo lenfatik ak aparèy gastwoentestinal atravè siyal IMD, yo te jwenn kribich san jèm (Fig 3F) epi yo te detekte deklanchman RELISH ak ekspresyon AMP. Konpare ak sa ki nan kontwòl la, kantite FOXO ak RELISH nan nwayo selil entesten yo ak emosit diminye anpil (figi 3G ak 3H). Pandan se tan, ekspresyon an nan AMP, ki gen ladan Crustins (CrusI-2 a 5) ak faktè Anti-lipopolysaccharide (Alf A1, B1, C1, D1 ak E1), pètèt reglemante pa FOXO ak / oswa RELISH te tès depistaj nan jèm la. -gratis kribich, ak rezilta yo te montre ke ekspresyon de CrusI -3, Alf-B1 ak Alf-C1 diminye anpil nan hemo sit ak trip nan kribich la (figi 3I ak 3J). Etandone ke ekspresyon Alf-B1 ak Alf C1 te reglemante pa chemen IMD [36], rezilta sa yo sijere ke FOXO patisipe nan règleman omeyostazi emolinf ak aparèy gastwoentestinal nan kondisyon nòmal atravè chemen IMD pou ankouraje ekspresyon de. AMP yo.
Fig 1. FOXO te upregulated nan kribich defye pa V. anguillarum. (A) Ekspresyon recombinant nan domèn FH nan FOXO nan E. coli ak Western blotting pou detekte FOXO lè l sèvi avèk antikò poliklonal kont FOXO prepare nan lapen. Liy 1, pwoteyin total E. coli ak Foxo-pGEX4T-1. Lane 2, pwoteyin total bakteri yo apre endiksyon IPTG. Lane 3, pirifye recombinant FOXO. Lane 4, FOXO nan trip yo nan kribich ki pa trete yo te detekte lè l sèvi avèk Western blotting. M, Pwoteyin makè mas molekilè. (B) Distribisyon tisi Foxo nan nivo mRNA (panèl anwo) ak pwoteyin (panèl ki pi ba) te detekte pa RT-PCR ak Western blotting, respektivman. ACTB la vle di -actin. (C, D) Modèl ekspresyon mRNA Foxo nan emosit (C) ak trip (D) yo te analize pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon jeyometrik vle di nan -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn. (E, F) Modèl ekspresyon pwoteyin FOXO nan emosit (E) ak trip (F) yo te detekte pa Western blotting. Rezilta analiz estatistik twa kopi yo te montre nan panno ki pi ba yo. Gwoup yo sou Western blot la te dijitalize lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ pa eskane gwoup yo soti nan twa repete endepandan. Nivo ekspresyon relatif FOXO/-aktin yo te eksprime kòm mwayen ± SD, ak valè kribich kontwòl la te mete kòm youn. Ba erè nan figi a endike SD (twa replike).
FOXO aktive nan kribich pa defi V. anguillarum epi li patisipe nan clearance patojèn nan emolinf ak trip.
Yo rapòte ke FOXO ka aktive pa eksitasyon bakteri oswa sitokin epi li transloke nan nwayo a pou kontwole ekspresyon sèten jèn sib nan mamifè [17]. Pou detekte si FOXO te aktive nan kribich defye pa bakteri, yo te analize distribisyon subselilè FOXO nan trip kribich la lè l sèvi avèk Western blotting. Rezilta yo te montre ke kantite FOXO nan sitoplasm nan selil entesten diminye piti piti soti nan 2 a 4 èdtan apre V. anguillarum defi (Fig 4A). Kontrèman, kantite FOXO nan nwayo selil entesten yo te ogmante anpil apre enfeksyon ak V. anguillarum (figi 4B). Pou analize wòl FOXO nan iminite sistemik, yo te itilize yon tès imunositochimik fliyoresan pou obsève translokasyon nikleyè FOXO nan emosit kribich 2 h apre V. eksitasyon anyèl larum. Nou te jwenn ke translokasyon FOXO bakteri defi-induit nan nwayo a te ogmante siyifikativman men pa te gen okenn chanjman evidan nan PBS-defi kribich (figi 4C ak 4C '). Pou eksplore si FOXO translokasyon nikleyè a enplike nan clearance patojèn, nou analize chaj bakteri nan emolinf ak trip nan kribich Foxo-knockdown nan 6 èdtan apre defi bakteri. Nou te jwenn ke apre knockdown nan Foxo, chaj la bakteri nan emolinf ak trip yo te ogmante anpil konpare ak sa ki nan gwoup kontwòl yo (Fig 4D). Anplis, pousantaj siviv Foxo-knockdown kribich ki enfekte ak V. anguillarum diminye siyifikativman konpare ak kontwòl la (Fig 4E). Rezilta sa yo endike ke FOXO te aktive nan selil enterik ak emosit, epi sijere ke FOXO patisipe nan repons iminitè lokal ak sistemik kont enfeksyon bakteri.
Fig 2. FOXO patisipe nan repons iminitè entesten (lokal) ak sistemik anti-bakteri yo. (A, B) Efikasite Foxo-RNAi nan emosit (A) ak trip (B) nan kribich, jan yo detèmine lè l sèvi avèk qPCR (A) ak Western blotting (B). Analiz dat qPCR la lè l sèvi avèk ekspresyon mwayen jeyometrik -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn. Ba erè yo montre SD yo. (C) Deteksyon bakteri emolinf nan kribich Foxo-knockdown pa kilti solid LB (twa repete); Piki dsGfp te itilize kòm kontwòl la. Rapò a dilution te 1:10. (D). Nimewo a nan bakteri nan emolinf ak trip nan kribich knockdown Foxo ak kribich dsGfp-piki san defi bakteri. (E). Pousantaj siviv Foxo-RNAi kribich san defi bakteri. Piki dsGfp te itilize kòm kontwòl la. (F). Pousantaj siviv Foxo-RNAi kribich trete ak antibyotik. Piki dsGfp te itilize kòm kontwòl. Nòmal: kribich kalite sovaj pa trete ak antibyotik.
Fig 3. Yon kantite fondamantal FOXO transloke nan nwayo emosit ak selil entesten ankouraje ekspresyon Relish epi imedyatman aktive chemen IMD pou kontwole omeyostazi emolinf ak entesten mikrobyota nan kondisyon nòmal. (A) Yo te itilize imunositochimik pou detekte distribisyon subselilè FOXO nan emosit kribich nòmal yo. Ba echèl=20 μm. Cy: Sitoplasm; Nu: nwayo. (B) Western blotting te itilize pou detekte distribisyon subselilè FOXO nan selil entesten ki soti nan kribich nòmal ak kribich ki enfekte ak V. anguillarum. (C) Te ekspresyon Relish nan nivo mRNA detekte nan emosit kribich apre knockdown Foxo pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon jeyometrik vle di nan -aktin ak Ef -1 kòm jèn kontwòl andojèn. (D) QPCR te detekte ekspresyon Relish nan nivo mRNA nan trip kribich yo apre knockdown Foxo lè l sèvi avèk ekspresyon mwayen jeyometrik -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn. (E) Nivo RELISH la te detekte lè l sèvi avèk Western blotting nan kribich apre kraze Foxo. (E') Twa kopi panèl E yo te dijitalize lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ. (F) Chaj bakteri emolinf ak trip nan kribich 24 èdtan apre tretman antibyotik. (G) FOXO nan nwayo a te detekte lè l sèvi avèk Western blotting nan emosit ak trip nan kribich 24 èdtan apre tretman ak antibyotik. (H) Yo te detekte RELISH nan nwayo a lè l sèvi avèk Western blotting nan emosit kribich ak trip nan 24 èdtan apre tretman ak antibyotik. (I, J) Ekspresyon Amps nan emosit (I) ak trip (J) kribich san jèm yo te detèmine pa qPCR lè l sèvi avèk -aktin ak Ef-1 kòm yon jèn referans entèn yo. Yo te itilize kribich nòmal (piki H2O) kòm kontwòl.
Etid anvan yo te endike ke aktivite transkripsyon FOXO reglemante pa modifikasyon fosforilasyon e ke serin/threonine kinase AKT kontwole aktivite faktè transkripsyon Forkhead pa fosforilasyon yo epi anpeche translokasyon ki pa klè [9,37]. Pou mennen ankèt sou si ogmantasyon FOXO nan nwayo a apre enfeksyon bakteri patojèn afekte pa AKT, nou premye detekte kontni FOXO nan sitoplasm la ak nwayo pa lwès blotting apre knockdown Akt nan kribich la. Rezilta yo te montre ke kantite FOXO nan nwayo a nan emosit ak selil entesten ogmante siyifikativman apre knockdown nan ekspresyon Akt (Fig 5A ak 5B) nan kribich 2 h apre enfeksyon ak V. anguillarum (Fig 5C ak 5C '). Pou verifye rezilta eksperimantal yo, nou te itilize tou yon tès imunositochimik pou obsève distribisyon subselilè FOXO nan emosit kribich yo apre kraze Akt. Rezilta yo te montre ke FOXO te siyifikativman ogmante nan nwayo a nan emosit lè Akt te frape desann 2 èdtan apre enfeksyon ak V. anguillarum (Fig 5D ak 5D '). Pou eksplore si enfeksyon patojèn nan afekte aktivite AKT, nou detekte chanjman fosforilasyon AKT apre enfeksyon patojèn lè l sèvi avèk yon antikò imen p-AKT (Ser473) (sit fosforilasyon AKT kribich la se Ser486) epi nou jwenn ke nivo fosforilasyon AKT diminye anpil nan emosit ak trip nan kribich apre 30 min nan enfeksyon V. anguillarum (figi 5E ak 5F). Rezilta sa yo sigjere ke enfeksyon patojèn ka diminye nivo fosforilasyon AKT la, ki anpeche aktivite anzim la epi diminye kapasite AKT pou fosforil FOXO. FOXO ki pa fosfò a antre nan nwayo a epi li pwovoke ekspresyon jèn sib li yo. figi a endike SD yo.
extrait cistanche
Enfeksyon patojèn diminye aktivite AKT ak pwovoke translokasyon nikleyè FOXO
FOXO egzèse defans iminitè kont bakteri anvayi lè li kontwole ekspresyon peptides antimikwòb nan kribich ki enfekte pa bakteri.
Pou eksplore mekanis ki FOXO afekte repons kont enfeksyon bakteri nan kribich la, nou premye idantifye jèn efè iminitè yo reglemante pa FOXO. Apre kraze siksè Foxo nan emosit ak trip nan kribich avèk oswa san defi V. anguillarum, nivo ekspresyon CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1, ak Alf-E1 diminye anpil nan kribich la silans konpare. ak moun ki nan gwoup kontwòl la (figi 6A ak 6B). Pou plis verifye rezilta yo, nou menm tou nou detekte ekspresyon kat AMP apre kraze Akt. Rezilta yo te montre ke ekspresyon kat AMP yo ogmante siyifikativman 6 èdtan apre enfeksyon V. anguil larum konpare ak sa ki nan gwoup kontwòl la (figi 6C ak 6D). Konpare ak AMP regilasyon (ki gen ladan Alf-B1, ak Alf-C1) nan kondisyon nòmal (figi 3I ak 3J), jèn adisyonèl nan AMPs (CrusI -3, Alf-E1) te ogmante tou nan kribich la ki enfekte pa V. anguillarum (figi 6A ak 6B). Etid anvan nou an te endike ke RELISH te ankouraje ekspresyon Alf-B1 ak Alf-C1 nan kribich la [36]. Rezilta sa yo endike ke FOXO ta ka dirèkteman kontwole ekspresyon AMP, tankou CrusI-3 ak Alf-E1, endepandan de chemen siyal IMD. Pou konfime ipotèz la, yo te fè yon tès ChIP pou detekte si FOXO ta ka mare ak pwomotè Alf-E1. Yo te jwenn sekans pwomotè Alf-E1 (S4 Fig) ak sit obligatwa FOXO te prevwa (Fig 6E). Rezilta ChIP a te montre ke FOXO te kapab mare ak pwomotè Alf-E1 (figi 6F). Rezilta sa yo sijere ke FOXO tou patisipe nan iminite anti-bakteri pa dirèkteman reglemante ekspresyon an nan AMP nan kribich.
Fig 4. FOXO transloke nan nwayo a nan kribich defye pa V. anguillarum. (A, B) Modèl distribisyon FOXO nan sitoplasm (A) ak nwayo (B) selil entesten kribich yo defye pa bakteri, jan yo analize lè l sèvi avèk Western blotting (panno ki pi ba nan A ak B). Bann blotting lwès yo te dijitalize lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ pa eskane gwoup yo soti nan twa repete. Nivo ekspresyon relatif FOXO/-actin oswa FOXO/Histone 3 yo te eksprime kòm mwayen ± SD, epi yo te mete valè kribich kontwòl la kòm youn. (C) Translokasyon nikleyè FOXO nan emosit kribich 2 h apre V. anguillarum defi te detekte lè l sèvi avèk fliyoresan esè imunositochimik. Piki PBS te itilize kòm yon kontwòl. Ba echèl=20 μm. (C') Analiz estatistik panèl C Kokalizasyon FOXO ak nwayo tache DAPI nan emosit yo te analize pa lojisyèl WCIF ImageJ. (D) Nimewo bakteri nan emolinf ak trip kribich knockdown Foxo te swiv piki V. anguillarum; dsGfp-piki nan kribich apre piki bakteri te itilize kòm kontwòl. (E) Pousantaj siviv kribich Foxo-RNAi ki enfekte pa V. anguillarum. Piki dsGfp te itilize kòm kontwòl la.
FOXO fè pwomosyon fagositoz nan emosit kont bakteri pa ankouraje ekspresyon SRC
Etid anvan yo te rapòte ke FOXO reyaji dirèkteman ak rejyon pwomotè CXCR2 ak CD11b pou kontwole fagositoz netrofil nan mamifè [26]. Pou teste si FOXO asosye ak fagositoz emosit nan iminite anti-bakteri kribich la, nou egzamine to fagositik la apre entèferans ak Foxo lè l sèvi avèk diferan metòd. Apre knockdown Foxo, pousantaj fagositik ak endèks fagositik gwoup Foxo-knockdown yo te siyifikativman pi ba pase gwoup kontwòl la (dsGfp) (Fig 7A ak 7A '). Nou te itilize tou sitometri koule pou quantifier to fagositik emosit apre silans Foxo. Rezilta yo te montre ke pousantaj phage cytosis gwoup Foxo-RNAi tou diminye anpil konpare ak gwoup dsGfp (figi 7B ak 7B'). Pou plis valide rezilta sa yo, nou menm tou nou egzamine to fagositik la apre kraze Akt. Rezilta yo te montre ke konpare ak gwoup kontwòl la, pousantaj fagositik ak endèks fagositik ogmante anpil (figi 7C ak 7C '). Rezilta sa yo sijere ke FOXO fè pwomosyon fagositoz nan emosit nan kribich. Pou eksplore ki jan FOXO amelyore fagositoz emosit nan kribich la, nou te detekte ekspresyon jèn yo te rapòte deja ki enplike nan fagositoz kribich la. Klas reseptè Scavenger B (SRB) ak klas C (SRC) yo rapòte yo patisipe nan fagositoz emosit [38,39]. Nou te jwenn ke nivo ekspresyon mRNA Src, olye ke Srb, diminye anpil apre silans Foxo nan emosit yo ak trip (figi 7D ak 7E), tandiske ekspresyon Src ogmante siyifikativman apre kraze Akt nan kribich (figi 7F). Rezilta menm jan an te jwenn nan nivo pwoteyin (figi 7G ak 7G'). Rezilta sa yo sijere ke FOXO fè pwomosyon fagositoz emosit nan patojèn nan kribich pa ankouraje ekspresyon SRC.
FOXO ankouraje ekspresyon RAB5 ak RAB7 pandan fagositoz nan kribich
Etid anvan yo te montre ke ti GTPases yo, RAB5 ak RAB7, se regilatè kle nan transpò a nan vesik ki fèk endocytosed nan endosomes bonè ak an reta [40]. RAB5 se yon regilatè kle nan evènman fizyon inisyal yo epi li se yon makè nan endosome bonè [41,42]. RAB7 nesesè pou fizyon an reta phagosome-lyzosome epi li se yon makè nan endosomes an reta [43]. Pou eksplore si RAB5 ak RAB7 yo patisipe nan clearance patojèn nan kribich, nou premye analize modèl ekspresyon Rab5 ak Rab7 epi nou jwenn ke de ti GTPases yo te upregulated nan kribich defye ak bakteri (S5A-S5D Fig). Nou te analize plis pousantaj siviv Rab5-RNAi ak Rab7-RNAi kribich apre defi bakteri, e rezilta yo te montre ke pousantaj siviv Rab5 ak Rab7 knockdown kribich diminye anpil konpare ak kontwòl la ( S5E ak S5F Fig). Rezilta sa yo sijere ke RAB5 ak RAB7 jwe fonksyon enpòtan nan rezistans kont patojèn bakteri. Pou eksplore si RAB5 ak RAB7 patisipe nan fagositoz FOXO-medyatè, nou egzamine nivo ekspresyon mRNA Rab5 ak Rab7 apre entèferans ak ekspresyon Foxo nan kribich. Rezilta yo te montre ke nivo ekspresyon Rab5 ak Rab7 diminye anpil nan emosit yo ak trip (figi 8A ak S6A). Lè nou konsidere ke ekspresyon Rab5 ak Rab7 ogmante siyifikativman apre kraze Akt nan kribich (figi 8B). Pou plis konfime rezilta ki anwo yo, yo te detekte nivo pwoteyin RAB5 ak RAB7 nan kribich knockdown Foxo oswa Akt. Konpare ak gwoup piki dsGfp la, nivo RAB5 ak RAB7 tou diminye anpil nan emosit yo ak trip yo nan kribich Foxo-knockdown men ogmante siyifikativman nan kribich Akt-knockdown nan 2 èdtan apre eksitasyon pa V. anguillarum (figi 8C-8D'; S6B). ak S6B'). Rezilta sa yo sigjere ke RAB5 ak RAB7 patisipe nan sitoz faj FOXO-medyatè nan emosit nan kribich. Nou te detekte plis ke RAB5 ak RAB7 te ko-lokalize ak V. anguillarum nan emosit kribich (figi 9). Ansanm, rezilta yo sijere ke RAB5 ak RAB7 yo patisipe nan fagositoz FOXO-medyatè nan kribich.
Fig 5. Enfeksyon patojèn diminye aktivite AKT, ki ankouraje translokasyon nikleyè FOXO nan emosit ak selil enterik nan kribich. (A, B) Efikasite Akt-RNAi nan emosit yo ak trip yo nan kribich, jan yo detèmine pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon jeyometrik vle di nan -aktin ak Ef -1 kòm jèn kontwòl andojèn (A) ak Western blotting (B). (C) Kantite FOXO nan sitoplasm ak nwayo trip ki soti nan kribich Akt-knockdown te analize pa Western blotting. dsGfp te itilize kòm yon kontwòl. (C') Analiz estatistik panèl (C). Lojisyèl ImageJ te itilize pou dijitalize bann yo nan eskanè twa-repete foto. (D) Translokasyon nikleyè FOXO nan emosit kribich Akt-knockdown te detekte 2 èdtan apre V. anguillarum defi lè l sèvi avèk yon tès iminositochimik fliyoresan. dsGfp te itilize kòm yon kontwòl. Ba echèl=20 μm. (D') Analiz estatistik (D). Lojisyèl WCIF ImageJ te itilize pou analize ko-lokalizasyon an pa rapò entansite fliyoresan anti-FOXO (vèt) ak nwayo DAPI-tache (ble) nan emosit apre yo fin fikse valè ekspoze a. (E, F) Chanjman kontni nan fosforil AKT (p-AKT) nan emosit (E) ak trip (F) nan kribich defye pa V. anguillarum. Panno ki pi ba yo se figi dijitalize (E) ak (F) ki baze sou gwoup Western blotting ak analiz estatistik, respektivman.
Cistanche te
Diskisyon
FOXO, kòm yon faktè transcription trè enpòtan, patisipe nan anpil fonksyon fizyolojik ak metabolik [44,45]. Nan etid la prezan, nou idantifye yon FOXO ki soti nan kribich (M. japonicus) epi li te jwenn ke li patisipe nan règleman omeyostazi nan hemolinf ak mikrobiota enterik pa reglemante ekspresyon AMP nan kondisyon nòmal. FOXO ka aktive pa enfeksyon bakteri nan kribich ak transloke nan nwayo a, kote li kontwole dirèkteman ak endirèkteman (pa chemen IMD) ekspresyon an nan AMP. FOXO upregulated ekspresyon jèn ki gen rapò ak fagositoz, tankou SRC ak ti GTPases, RAB5 ak RAB7, ankouraje fagositoz emosit kont patojèn. Se poutèt sa, kribich FOXO jwe wòl diferan nan repons iminitè sistemik ak lokal (enterik) kont patojèn (figi 10). Konpare ak FOXO imen, kribich FOXO gen yon sekans asid amine relativman konsève ak sit fosforilasyon AKT; sepandan, dezyèm sit fosforilasyon AKT nan kribich FOXO se threonine olye pou yo serin. Fosforilasyon AKT nan FOXO kontwole transpò nikleyè ak sitoplasmik nan FOXO [9]. Nan etid sa a, nou te jwenn ke AKT gen rapò ak kontwòl nan antre nikleyè FOXO a. Apre enfeksyon V. anguillarum, nivo fosforilasyon AKT te siyifikativman redwi, sa ki endike ke aktivite AKT te diminye nan kribich ki enfekte ak pathogen, konsa ogmante retansyon nikleyè oswa translokasyon nikleyè FOXO, epi imedyatman pwovoke ekspresyon jèn sib yo, tankou Relish ak Amp, pou reziste kont enfeksyon patojèn. Etid anvan yo te jwenn ke FOXO patisipe nan omeyostaz la nan Drosophila entesten nal mikroflor pa reprime ekspresyon an nan pwoteyin rekonesans peptidoglycan SC2 (regilatè negatif nan chemen IMD) aktif chemen an pou ekspresyon AMP [14]. RELISH te rapòte kòm yon jèn sib kle nan FOXO nan kontwòl tolerans ipoksi nan Drosophila [46]. Menm jan ak lòt bèt, aparèy gastwoentestinal kribich la gen mikrobyota relativman wo ak konstan. Ogmante prèv tou revele ke emolinf nan kèk envètebre akwatik ki an sante, ki gen ladan kribich tou pòte kantite ki estab nan bakteri [47]. Etid anvan nou an te jwenn ke yon lectin C-tip patisipe nan règleman omeyostaz nan mikrobiota emolinfa pa kenbe ekspresyon an nan AMPs [34], men nou pa konnen ki chemen siyal ki enplike nan règleman an nan ekspresyon AMP. Isit la, rezilta nou yo sigjere ke FOXO patisipe nan règleman omeyostazi emolinf ak mikroflor enterik atravè siyal IMD nan kondisyon nòmal. Nan kribich ki pa enfekte, knockdown Foxo te lakòz ekspresyon Relish siyifikativman redwi, ak pousantaj siviv kribich la diminye anpil, menm san enfeksyon bakteri. Nou jwenn tou yon ti kantite FOXO nan nwayo selil kribich nòmal yo. Se poutèt sa, nou panse ke FOXO patisipe nan règleman omeyostaz emolinf ak flora enterik nan kondisyon nòmal lè li ankouraje ekspresyon Relish epi apre sa amelyore ekspresyon AMP pa chemen IMD la. Rezilta sa yo sijere ke FOXO patisipe nan iminite lokal ak sistemik pou ankouraje omeyostaz mikrobyota nan emolinf ak aparèy gastwoentestinal nan kribich. Iminite umoral jwe yon wòl enpòtan nan rezistans nan enfeksyon patojèn nan pousantaj envès atravè pwodiksyon an nan yon batri nan AMPs [21,48]. Repons umoral la gen ladan sentèz ak sekresyon AMP ki endivizib, ki lage nan emolinf la kòm yon repons sistèm, oswa lage sou sifas epidèm oswa kavite aparèy gastwoentestinal la kòm yon repons lokal [19]. Ekspresyon AMP se sitou reglemante pa chemen siyal Toll / Dif ak IMD / Relish nan mouch fwi [49]. Kounye a, plizyè fanmi AMP yo te idantifye nan kribich, tankou crustins, faktè anti-lipopolysaccharide (Alfs), ak penaeidins [50]. Etid la te montre ke FOXO ka dirèkteman oswa endirèkteman (atravè siyal IMD / Relish) kontwole ekspresyon AMP yo, ki gen ladan CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1, ak Alf-E1. Nou te panse ke deklanchman ki ba nan FOXO nan emosit yo ak trip nan kribich nan kondisyon nòmal yo ta ka kontwole jèn nan sib kle nan Foxo, sa vle di, Relish, kenbe omeyostazi nan mikrobiota nan vivo. Pandan enfeksyon, patojèn anvayi yo aktive FOXO, pifò ladan yo transloke nan nwayo a, kote li kontwole plis jèn sib, ki gen ladan kèk AMP, tankou Alf-E1 ak CrusI-3, anplis Relish. Ansanm, FOXO patisipe nan règleman omeyostaz emolinf ak mikrobiota entesten nan kribich ki an sante atravè deklanchman nivo fondamantal nan siyal IMD nan emolinf ak aparèy gastwoentestinal. Enfeksyon patojèn aktive FOXO lè li diminye aktivite AKT epi li ankouraje ekspresyon AMP yo dirèkteman ak endirèkteman nan iminite sistemik ak iminite lokal (entesten). Fagositoz se yon fenomèn ki baze sou reseptè, aktin ak ATP-depandan, ki deklanche pa obligatwa patikil oswa patojèn nan reseptè cytomembrane espesifik, epi li reprezante yon pwosesis iminitè enpòtan kote lame a ka pwoteje tèt li kont patojèn [24]. Ti GTPases, tankou RAB5 ak RAB7, yo patisipe nan remodèl manbràn kontinye ak trafik vesik nan fagositoz. Etid anvan nou an te rapòte ke reseptè scavenger SRB ak SRC yo patisipe nan fagositoz emosit kòm reseptè nan kribich [38,39]. Nan etid la prezan, nou te jwenn ke apre debat Foxo, ekspresyon Src diminye ansibleman, ak pousantaj fagositoz emosit la diminye anpil, sijere ke Src se yon jèn sib nan FOXO e ke FOXO patisipe nan fagositoz SRC-medyatè nan bakteri patojèn. FOXO te kapab tou ankouraje ekspresyon de ti GTPases, RAB5 ak RAB7. Ti GTPases sa yo patisipe nan transpò sekansyal epi yo se detèminan kle yo nan fagosòm bonè ak an reta [51]. Phagosomes imigre soti nan periferik selil la nan rejyon entraselilè a, ak RAB5 yo te ranplase pa RAB7 pandan transpò, ak machandiz final yo transpòte nan lizozom nan pou degradasyon [52,53]. Nou menm tou nou te jwenn ke RAB5 ak RAB7 te kapab ko-lokalize ak patojèn yo nan emosit, ki endike ke patojèn yo te fagositize pa emosit nan kribich lè yo pase nan fagosòm bonè ak an reta anvan finalman yo te degrade nan lizozòm. Se poutèt sa, FOXO patisipe nan repons iminitè selilè a pa ankouraje fagositoz nan emosit. An konklizyon, rezilta nou yo endike ke FOXO pa sèlman patisipe nan règleman omeyostaz mikrobyota nan kondisyon nòmal, men tou nan clearance nan bakteri patojèn nan kribich ki enfekte pa ankouraje ekspresyon an nan AMP ak fagositoz nan emosit.
Fig 6. FOXO fè wòl anti-bakteri li yo nan kribich pa reglemante ekspresyon AMP yo. (A, B) Ekspresyon an nan Amps nan emosit (A) ak trip (B) nan kribich Foxo-knockdown, jan yo detèmine pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon jeyometrik vle di nan -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn; Piki dsGfp nan kribich te itilize kòm kontwòl la. Done yo te analize estatistik lè l sèvi avèk tès la Mann-Whiteny U. (C, D) Ekspresyon an nan Amps nan emosit (C) ak trip (D) nan kribich knockdown Akt te analize pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon jeyometrik vle di nan -aktin ak Ef -1 kòm jèn kontwòl andojèn; Piki dsGfp nan kribich te itilize kòm kontwòl la. Diferans enpòtan yo te analize lè l sèvi avèk yon sèl-fason ANOVA. (E) Dyagram chema nan sit obligatwa yo prevwa nan FOXO sou pwomotè Alf-E1 la. (F) ChIP ak RT-PCR yo te itilize pou detekte FOXO obligatwa nan sekans pwomotè Alf-E1 lè l sèvi avèk primè (Alf-E1-F ak Alf-E1-R, Tablo 1). RT-PCR te itilize tou pou anplifye rejyon kode Alf-E1 ak RT-PCR primè (Alf-E1-RT-F ak Alf-E{1-RT-R. Tablo 1) lè l sèvi avèk ChIP la. jwenn ADN kòm modèl. Yo te itilize antikò IgG kòm kontwòl, epi yo te itilize fragman anplifye ADN genomik nòmal pou konfime gwoup sib la.
Fig 7. FOXO amelyore fagositoz emosit nan patojèn nan kribich pa ankouraje ekspresyon SRC. (A) Hemocyte phagocytosis nan V. anguillarum obsève lè l sèvi avèk yon tès imunositochimik fliyoresan anba yon mikwoskòp fliyoresan. V. anguillarum te make ak FITC (vèt) ak nwayo selil yo te tache ak DAPI (ble). Flèch wouj la endike emosit fagositik yo. Ba echèl=20 μm. (A') Analiz estatistik pousantaj fagositik ak endèks fagositik nan kribich Foxo-knockdown. Gwoup piki dsGfp te itilize kòm kontwòl la. Yo te konte senksan emosit anba mikwoskòp fliyoresan nan chak eksperyans. Done yo te analize estatistik lè l sèvi avèk T-tès Elèv la. (B) fagositoz bakteri pa emosit analize lè l sèvi avèk sitometri koule. Emosit phagocytosed ki gen bakteri (R2) yo te separe ak emosit ki pa phagocytosed (R3) ki baze sou siyal fliyoresan nan bakteri ki make nan emosit yo lè l sèvi avèk IDEAS aplikasyon v6.0 lojisyèl. (B') Pousantaj fagositik emosit ki baze sou done sitometri koule yo. Twa mil emosit yo te konte pou chak analiz ak twa repetisyon yo te pote soti. Gwoup dsGfp te itilize kòm kontwòl. (C) Emosit fagositoz nan V. anguillarum nan kribich knockdown Akt obsève anba mikwoskòp fliyoresan. Ba echèl=10 μm. (C') Analiz estatistik pousantaj fagositik ak endèks fagositik ki baze sou done ki nan panèl (C). (D) Nivo ekspresyon mRNA Srb ak Src nan emosit ki soti nan kribich knockdown Foxo analize pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon mwayen jeyometrik nan -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn. Piki dsGfp te itilize kòm kontwòl la. (E) Ekspresyon mRNA Srb ak Src nan trip kribich Foxo-RNAi analize pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon mwayen jeyometrik -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn. (F) Ekspresyon mRNA Src nan emosit kribich Akt-RNAi analize pa qPCR lè l sèvi avèk ekspresyon mwayen jeyometrik nan -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn. (G) Nivo pwoteyin SRC nan emosit Foxo-RNAi oswa Akt-RNAi kribich, jan yo analize lè l sèvi avèk Western blotting. dsGfp piki itilize kòm kontwòl. (G') Analiz estatistik ki baze sou done twa kopi panèl (G).
Materyèl ak metòd
Deklarasyon etik
Tout eksperyans bèt yo te fèt an konfòmite ak Direktiv Nasyonal Lachin (GB 14922.2-2011 ak GB 14925-2010). Eksperyans lapen yo pou preparasyon antikò nan etid la te fèt an akò ak pwotokòl ki apwouve pa Animal Care & Welfare Commit tee nan Shandong University School of Life Sciences (SYDWLL -2021-54). Apwobasyon an dapre règleman yo sou itilizasyon kribich nan etid nou an pa t nesesè paske rechèch nou an te itilize yon kantite limite nan kribich komen souvan konsome pa pi laj kominote a.
Bèt
Yo te jwenn kribich ki an sante (Marsupenaeus japonicus), ki peze apeprè 6-10 g chak, nan mache pwodwi akwatik nan Qingdao, pwovens Shandong, Lachin. Anvan eksperyans lan, yo te kiltive kribich pou omwen 1 jou nan sistèm kilti kribich la ak dlo lanmè aere nan 23-25˚C pou aklimatasyon nan nouvo anviwònman an.
Fig 8. RAB5 ak RAB7 yo patisipe nan fagositoz FOXO-medyatè nan emosit nan kribich. (A, B) qPCR te itilize pou analize nivo ekspresyon mRNA Rab5 ak Rab7 nan emosit kribich Foxo-knockdown (A) ak Akt-knockdown kribich (B) ak ak san enfeksyon bakteri. qPCR te itilize ekspresyon mwayen jeyometrik -aktin ak Ef-1 kòm jèn kontwòl andojèn. (C) Nivo pwoteyin RAB5 ak RAB7 nan emosit kribich Foxo-knockdown nan 2 èdtan apre defi V. anguillarum detèmine lè l sèvi avèk Western blotting. (C') Analiz estatistik ki baze sou done twa kopi panèl (C). (D) Nivo pwoteyin RAB5 ak RAB7 nan emosit nan kribich Akt-knockdown nan 2 èdtan apre V. anguillarum defi detèmine lè l sèvi avèk Western blotting. (D') Analiz estatistik ki baze sou done twa kopi panèl (D).
Analiz byoenfòmatik
Tout longè sekans cDNA Foxo te jwenn nan emosit ak sekans transkripsyon entesten M. japonicus (BGI, Shenzhen, Lachin). Ankadreman lekti ouvè (ORF) Foxo te anplifye lè l sèvi avèk yon pè primè (Foxo-EX-F ak Foxo-EX-R; Tablo 1) pou konfimasyon sekans. Te cDNA ki koresponn lan tradui konseptyèlman pou jwenn sekans pwoteyin dedwi lè l sèvi avèk zouti ExPASy-Tradiksyon (http://cn.expasy.org/). Analiz resanblans yo te fèt lè l sèvi avèk BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), epi yo te fè prediksyon achitekti domèn lè l sèvi avèk SMART (http://smart.emblheidelberg.de). Yo te konstwi yon pye bwa filojenetik FOXO ki soti nan diferan espès avèk pwogram MEGA 6.0 [54].
Fig 9. RAB5 ak RAB7 ko-lokalize ak V. anguillarum. Ko-lokalizasyon RAB5 ak RAB7 ak FITC ki make-V. anguillarum nan emosit kribich, jan yo analize lè l sèvi avèk yon tès imunositochimik fliyoresan. Bakteri yo te make ak FITC (vèt) ak sou fòm piki nan kribich la. Emosit yo te kolekte nan senk kribich nan 30 min ak 1 èdtan apre piki bakteri ak enkubasyon ak anti-RAB5 oswa anti RAB7 antikò. Antikò segondè a te antilapen IgG Alexa-546 (wouj). Nwayo yo te tache ak DAPI (ble). Ko-lokalizasyon nan emosit yo endike pa flèch blan. Ba echèl=10 μm.
Fig 10. Reprezantasyon eskematik patisipasyon FOXO nan iminite lokal ak sistemik natirèl nan kribich yo. (A) Nan kondisyon ki pa enfekte, FOXO kenbe omeyostazi emolinf la ak mikrobiota entesten an pa ankouraje ekspresyon Relish epi apre sa AMP. (B) Nan kondisyon ki enfekte, fosforilasyon AKT diminye pa enfeksyon patojèn, sa ki lakòz ogmante kontni FOXO nan nwayo a. FOXO dirèkteman ankouraje ekspresyon Relish ak AMP pou elimine patojèn pwogrese; an lòt men an, FOXO ankouraje fagositoz la nan patojèn atravè chemen an fagositoz SRC-medyatè.
Defi bakteri ak koleksyon echantiyon
Vibrio anguillarum (ATCC 43305) jwenn nan Marine College, Shandong University (Wei hai, Lachin) epi kounye a konsève nan laboratwa nou an. V. anguillarum te kiltive lannwit lan nan 37˚C nan mwayen LB epi re-kilti pou 4 èdtan nan 1:100 inokulasyon nan dezyèm jou a. Bakteri yo nan faz kwasans logaritmik yo te kolekte pa santrifujasyon nan 5000 × g pou 5 min nan 4˚C epi lave de fwa ak saline ki gen tanpon fosfat (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, ak 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4). V. anguillarum resuspend nan saline tampon fosfat pou defi kribich. Apeprè 2 × 107 inite ki fòme koloni (CFU) / kribich yo te sou fòm piki nan vant chak kribich lè l sèvi avèk yon microsering. Gwoup kontwòl la te sou fòm piki ak menm volim PBS. Emosit yo, kè, epatopankreyas, branch, lestomak, ak trip yo te kolekte nan omwen twa kribich pou fè ekstraksyon RNA ak pwoteyin. Pou koleksyon emosit, yo te ekstrè emolinf la nan sinis ventral la lè l sèvi avèk yon sereng prechaje ak 0.8 ml tanpon antikoagulan (10% sitrat sodyòm), epi byen vit santrifuje nan 700 × g pou 8 min nan 4˚C pou izolasyon emosit.
RNA ak ekstraksyon pwoteyin, ak sentèz cDNA
Total RNA te extrait nan emosit yo ak ògàn diferan nan kribich lè l sèvi avèk TRIzol la (ET101, Transgen, Beijing, Lachin). Pwoteyin ki soti nan ògàn diferan yo te ekstrè lè l sèvi avèk Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) Lysis Buffer (P0013B, Beyotime, Jiangsu, Lachin). Premye sentèz cDNA te fèt lè l sèvi avèk yon Twous sentèz cDNA (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Byological Materials-abm, Vancouver, Kanada), swiv enstriksyon manifakti a.
Tablo 1. Sekans premye yo itilize nan etid sa a.
MasterMix; Applied Byological Materials-abm, Vancouver, Kanada), swiv enstriksyon manifakti a.
Ekspresyon recombinant ak preparasyon antikò
Sekans cDNA Foxo te anplifye pa reyaksyon chèn polymerase transkripsyon ranvèse (RT-PCR) lè l sèvi avèk primè Foxo-EX-F ak Foxo-EX-R (Tablo 1). Lè sa a, pwodwi PCR pirifye yo te dijere lè l sèvi avèk anzim restriksyon yo epi yo te ligasyon nan plasmid pGEX -4T{-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). ak plasmid konstwi yo te transfòme nan selil Escher ichia coli Rosseta (DE3). Ekspresyon pwoteyin yo te pwovoke lè l sèvi avèk 1 mM isopropyl- - D-thio galactopyranoside nan 37˚C. Pwoteyin recombinant yo te sibi chromatografi afinite lè l sèvi avèk glutatyon (GST) résine (C600031, BBI, Shanghai, Lachin), swiv enstriksyon manifakti a. Antisera lapen kont FOXO te prepare dapre yon metòd ki te dekri deja [55].
Lwès blotting
Pwoteyin yo ekstrè nan ògàn diferan oswa emosit yo te separe lè l sèvi avèk 10% sodyòm dodecyl sulfat poliakrilamid jèl elèktroforèz (SDS-PAGE). Pwoteyin ki nan jèl SDS-PAGE yo te transfere nan yon manbràn nitrat seluloz lè l sèvi avèk tanpon transfè (25 mM Tris-HCl, 20 mM glisin, 0.037% mM SDS, ak 20% etanòl) ak enkubasyon nan 5% lèt ekreme oswa 3% albumin serom bovin (BSA) nan Tris-tampon saline (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8.0) pou 1 èdtan ak souke dou nan tanperati chanm. Lè sa a, manbràn yo te enkube ak antiserum prensipal: Anti-FOXO nan yon dilution 1:100, anti-RAB5 nan 1:25, anti Rab7 nan 1:25, anti-beta aktin (ACTB) nan 1:250 (prepare nan laboratwa nou an). ); Istòn -3 antikò poli klonal (A2348, ABclonal, Wuhan, Lachin, 1:2500); anti-fosforilasyon (p)-AKT poliklonal antikò (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Lachin, 1:500) epi souke dousman lannwit lan nan 4˚C. Apre yo fin lave twa fwa ak TBST (0.1% Tween-20 ajoute nan TBS), mem branes yo te enkube ak antikò segondè (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, Lachin, 1:5,000) oswa ( ZB2301 ZSGB-Bio, Beijing, Lachin, 1:5,000) pou 3 èdtan nan tanperati chanm ak souke dou. Gwoup pwoteyin iminoreaktiv yo te devlope lè l sèvi avèk yon klori ble nitrotetrazolyom (A610379, BBI) ak solisyon sèl P-toluidin (A610072, BBI) nan kondisyon nwa oswa lè l sèvi avèk chemiluminescence améliorée (ECL). -aktin oswa Histone-3 yo te itilize referanss.
Distribisyon tisi ak modèl ekspresyon nan kribich defye pa bakteri
Distribisyon tisi Foxo/FOXO nan emosit, kè, branch, krache, lestomak, ak trip yo te analize lè l sèvi avèk RT-PCR ak primè Foxo-F ak Foxo-R (Tablo 1) ak pa Western blotting ak anti-FOXO antikò, respektivman. Pwosedi PCR la konsiste de yon premye enkubasyon nan 94˚C pou 3 min; swiv pa 35 sik 94˚C pou 30 s, 50˚C pou 30 s, ak 72˚C pou 30 s; swiv pa 72˚C pou 10 min. Pwodwi PCR yo te analize lè l sèvi avèk elektwoforèz jèl agarose (1.5% agarose). Jèn nan -actin (-actin-F ak -actin-R; Tablo 1) te itilize kòm kontwòl entèn la. Modèl ekspresyon tan kou Foxo/FOXO nan nivo RNA ak pwoteyin nan kribich ki te defye ak V. anguillarum yo te analize lè l sèvi avèk PCR an tan reyèl (qPCR) nan yon cycler tèmik (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Almay) ak pa lwès ern blotting, respektivman. Pwosedi qPCR la gen ladann: 95˚C pou 10 min; 40 sik nan 95˚C pou 10 s ak 60˚C pou 50 s; epi apre yon peryòd k ap fonn ant 65˚C ak 95˚C. Fichye pwo espresyon Foxo yo te pwodwi lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCT [56] lè l sèvi avèk mwayen jeyometrik de jèn kontwòl entèn -aktin ak Ef-1 pou nòmalizasyon. Yo te analize efikasite pè Jadendanfan nan qPCR apre metòd MIQE [57] ak yon dilution logaritmik 10-pliye yon melanj cDNA pou jenere yon koub estanda lineyè.
Izolasyon nan pwoteyin nikleyè ak sitoplasmik
Tisi trip la te diseke soti nan kribich epi lave nan PBS twa fwa. Pwoteyin ekstraksyon te fèt lè w sèvi ak yon twous ekstraksyon pwoteyin nikleyè ak sitoplasmik (R0050, Solarbio, Beijing, Lachin) swiv enstriksyon manifakti a. Yo te itilize omwen twa kribich pou fè ekstraksyon pwoteyin pou elimine diferans endividyèl yo.
RNA entèferans tès
Pou analize fonksyon jèn, nou te fè tès entèferans RNA (RNAi). Plizyè pè primè ki gen sekans pwomotè T7 (Foxo-RI-F ak Foxo-RI-R; Rab5-RI-F ak Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F ak Rab7 -RI-R; Akt-RI-F ak Akt-RI-R. Tablo 1) yo te fèt pou anplifye modèl yo pou sentèz dsRNA. Sèvi ak T7 RNA polymerase (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ak modèl cDNA, nou sentèz fragman dsRNA yo. Double-strand Green fliyoresan pwoteyin dsGfp RNA te sèvi kòm kontwòl la, ki te anplifye lè l sèvi avèk Gfp-RI-F ak Gfp -RI-R (Tablo 1) kòm primè pou sentèz dsGfp. Lè sa a, yo te enjekte fragman dsRNA yo (50 ug/chak) nan segman nan vant M. japonicus lè l sèvi avèk yon microsyringe ak yon dezyèm piki te pote soti 12 èdtan pita lè l sèvi avèk menm dòz la. Yo te analize efikasite entèferans RNA lè l sèvi avèk PCR ranvèse transcription an tan reyèl (qRT-PCR, ki gen ladan transcription ranvèse nan RNA pou fòme cDNA, ki te Lè sa a, itilize kòm modèl la nan yon tès qPCR) oswa Western blotting 24 h apre dezyèm piki. -aktin te itilize kòm referans entèn la.
Referans
1. Calnan DR, Brunet A. Kòd FoxO a. Onkogene. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.
2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Faktè transkripsyon forkhead FOXO3a nan pwoteyin Gadd45 la ankouraje chemen reparasyon ADN. Syans. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.
3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Viv FOXO: debouche wòl pwoteyin FOXO nan aje ak lonjevite. Selil ki aje. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.
4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Triple kouch kontwòl-fosforilasyon, asetilasyon ak ubiquitination nan pwoteyin FOXO. Sik selilè. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Règleman nan faktè transcription FoxO pa asetilasyon ak entèraksyon pwotein-pwoteyin. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.
6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. Faktè transkripsyon FOXO: siyifikasyon klinik yo ak règleman yo. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.
7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. Jèn ki aji anba DAF-16 pou enfliyanse lavi Caenorhabditis elegans. Lanati. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Ensilin/IGF-1R, SIRT1, ak chemen FOXOs-yon fòm entèraksyon entrigan pou zo ak osteosarcoma. Endocrinol devan (Lausanne). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.
9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt ankouraje siviv selil pa fosforilasyon ak anpeche yon faktè transcription forkhead. Selil. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.
10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 inibit FOX01 nan repwesyon timè atravè degradasyon ubiquitin-medyatè. P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.
11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. Faktè transkripsyon tèt Fork DAF-16 transdui siyal metabolik ak lonjevite ki sanble ak ensilin nan C. elegans. Lanati. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.
12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Siyal FoxO entesten obligatwa pou siviv enfeksyon oral nan Drosophila. Imunol mukozal. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.
13. Spellberg MJ, Marr MT. FOXO kontwole entèferans RNA nan Drosophila epi li pwoteje kont enfeksyon viris RNA. P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.
14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 ankouraje omeyostaz iminitè zantray pou limite kòman sal dysbiosis ak pwolonje lavi. Selil. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.
15. Becker T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. FOXO-depandan règleman omeyostaz iminitè natirèl. Lanati. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.
16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. Faktè transkripsyon FOXO kontwole mekanis iminitè natirèl nan selil epitelyal respiratwa yo. J Immunol. 2013; 190 (4): 1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.
17. Graves DT, Milovanova TN. Iminite mukozal ak faktè transkripsyon FOXO1. Avant Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.
18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Peptides anti-mikwòb: soti nan envètebre rive nan vertebre. Immunol Rev 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.
19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Iminite nan Drosophila melanogaster-soti nan rekonesans mikwòb nan fizyoloji antye-òganis. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.
20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Drosophila iminite natirèl: yon pèspektiv evolisyonè. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.
21. Hultmark D. Drosophila iminite: chemen ak modèl. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.
22. Li FH, Xiang JH. Dènye pwogrè nan rechèch sou iminite natirèl kribich la nan Lachin. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.
23. Solèy JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Liaison domèn bobin bobin C-type lectin a ak reseptè Domeless a dirèkteman aktive chemen JAK/STAT nan repons iminitè kribich la nan enfeksyon bakteri. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.
24. Gordon S. Phagocytosis: yon pwosesis imunobiyolojik. Iminite. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.
25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. FoxO1-otofaji medyatè obligatwa pou devlopman selil NK ak iminite natirèl. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.
26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. FOXO1 kontwole aktivite netrofil bakteri-induit. Avant Immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.
27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. Lektin C-tip mare nan beta-entegrin pou ankouraje fagositoz emositik nan yon envètebre. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.
28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Teaching kribich defans pwòp tèt ou pou konbat enfeksyon. Tandans Biotechnol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.
29. Flegel TW. Aparisyon istorik, enpak ak sitiyasyon aktyèl patojèn kribich nan pwovens Lazi. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.
30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, Li JG. Defans antiviral nan kribich: Soti nan iminite natirèl nan enfeksyon viral. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.
31. Obsil T, Obsilova V. Relasyon estrikti/fonksyon ki kache règleman sou faktè transcription FOXO. Onkogene. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.