Glikoz egzèse yon efè anti-melanogenic pa endirèk inaktivasyon nan tirozinaz nan melanosit ak yon ekivalan po imen.
Mar 22, 2023
Résumé:
Sik yo omniprésente nan òganis yo epi yo byen koni engredyan kosmetik pou idrate po ak efè segondè minim. Glikoz, yon sik senp ki itilize kòm yon sous enèji pa selil vivan, yo souvan itilize nan pwodwi swen pou po. Plizyè rapò te demontre ke sik ak konpoze ki gen rapò ak sik gen efè anti-melanogenic sou melanosit. Sepandan, mekanis molekilè ki kache nan ki glikoz inibit sentèz melanin se enkoni, menm si glikoz yo itilize kòm yon blanchiman kòm byen ke yon engredyan idratan nan pwodui kosmetik. Isit la, nou te jwenn ke glikoz siyifikativman redwi kontni an melanin nan -melanocyte-stimulating hormone (MSH)-stimulé selil B16 ak fè nwa pigman melanosit nòmal imen ki pa gen okenn siy sitotoksisite.
Anplis de sa, tretman aktualite nan glikoz demontre efikasite blanchiman li yo atravè fotografi, Fontana-Masson (F & M) tach, ak mikwoskòp milti-foton nan yon modèl pigman 3D po moun, MelanoDerm. Sepandan, glikoz pa t chanje ekspresyon jèn oswa nivo pwoteyin pi gwo pwoteyin melanojèn nan melanosit. Pandan ke glikoz pisan diminye aktivite tirozinaz entraselilè nan melanosit, li pa t 'diminye aktivite tirozinaz djondjon nan yon sistèm eksperimantal san selil. Sepandan, glikoz te metabolize nan asid laktik, ki ka siprime aktivite tirozinaz. Se konsa, nou konkli ke glikoz endirèkteman inibit aktivite tirozinaz nan konvèsyon nan asid laktik, eksplike efè anti-melanogenic li yo nan melanosit.
Tirozinaz se yon anzim ki ka dekonpoze tirozin nan pwoteyin epi konvèti li nan pwodwi oksidasyon tirozin, tankou fenol tirozin ak lòt sibstans. Anzim sa a egziste lajman nan kò imen an, espesyalman nan aparèy la entesten, kote li patisipe nan dijesyon an ak absòpsyon nan manje. An menm tan an, li te jwenn nan rechèch la ke cistanche ka diminye aktivite a nan tirozinaz e konsa blanchi po a.
Mo kle:
melanogenesis; sik; glikoz; tirozinaz; ekivalan po moun
1. Entwodiksyon
Melanogenesis se pwosesis pwodiksyon melanin epi li esansyèl pou pwoteksyon po. Melanin absòbe limyè iltravyolèt (UV) epi pwoteje po a kont efè domaj limyè UV ak radikal gratis [1]. Sepandan, paske twòp pwodiksyon melanin lakòz ipèpigmantasyon tankou freckles ak lentigo, ki ka konsidere kòm san estetik, anpil rechèch te dedye a jwenn engredyan efikas de-pigmantè pou pwodui kosmetik oswa medikaman [2-4].
Sik se yon humectant pwisan pou idrate po epi li itilize kòm yon engredyan kosmetik pou idrate po ak efè segondè minim. Anplis de sa, sik ak ajan ki gen rapò ak sik afekte melanogenesis [5,6]. Glycosylation nan tirozinaz, yon anzim kle ki enplike nan sentèz melanin, ka chanje, anpeche aktivite katalitik li yo ak akselere degradasyon li yo [7]. Wòl sik nan melanogenesis te make pa etid ki mennen ankèt sou efè glycosylation sou fenotip pigmantasyon melanosit ak wòl résidus sik sou aktivite katalitik tirozinaz [5-7]. Gen kèk etid ki rapòte ke dérivés sik ka anpeche spirasyon tirozinaz, ki afekte glikozyasyon li yo. Pou egzanp, N-acetylglucosamine (NAG), yon hexose amine ki pwodui fizyolojik pa adisyon nan yon gwoup amine nan glikoz, deranje glikozilasyon tirosinaz, sa ki lakòz efè depigman nan po kochon Gine ak po moun [8].
Anplis de sa, etid resan yo te montre ke konpoze ki gen rapò ak sik anpeche ekspresyon tirozinaz oswa aktivasyon kòm byen ke chanje glikozyasyon li yo. Pou egzanp, nou evalye efikasite blanchiman nan asid galakturonik (GA), yon asid sik ki se yon fòm oksidize nan galaktoz ak eleman prensipal la nan pèktin. Asid galacturonic egzèse yon efè blanchiman atravè règleman an nan aktivite tirozinaz ak ekspresyon nan selil B16 melanom murin ak yon ekivalan po moun [9]. Nan yon lòt rapò, yon nouvo kalite oligosakarid siklik, ke yo rekonèt kòm siklik nitrosyl nigerose (CNN), te montre yon efè inhibition dirèk ki fèb men enpòtan sou aktivite anzimatik tirozinaz, sijere yon mekanis posib nan ipopigmantasyon [10]. Menm jan ak spirasyon tirozinaz pa glikozilasyon apwopriye, ekspresyon oswa aktivite CNN ta ka yon sib ajan anti-melanogenic [11]. Sepandan, anpil ajan anti-melanogenic gen efè segondè grav, tankou vitiligo [12,13]. Se poutèt sa, gen gwo enterè nan pi an sekirite konpoze de-pigmantè.
Isit la, nou envestige efè anti-melanogenic nan glikoz sou selil B16 melanom murin ak melanosit nòmal imen. Anplis de sa, nou egzamine koulè tisi ak estati epidèm lè l sèvi avèk tach seksyon tisi nan yon ekivalan po moun. Dapre rezilta nou yo, nou pwopoze ke efè a blanchiman nan glikoz depann sou pwodiksyon asid laktik, sa ki lakòz inaktivasyon tirozinaz.
2. Rezilta
2.1. Efikasite Anti-Melanogenic nan glikoz nan B16 ak NHMs
Pou mennen ankèt sou efè anti-melanogenic glikoz, nou te itilize de kalite melanosit, selil melanom B16 (yon selil melanom murin) ak melanosit nòmal imen (NHMs). Premyèman, nou detèmine si glikoz te toksik pou selil B16 yo. Glikoz pa t montre okenn sitotoksisite nan konsantrasyon jiska 100 mM nan selil B16, jan yo montre nan Figi 1A. Dapre done sitotoksisite yo, selil B16 yo te trete ak divès konsantrasyon glikoz pou 72 èdtan nan prezans -melanocyte-stimulating hormone (MSH), yon pwodiktè nan melanogenesis. Jan yo montre nan Figi 1B, glikoz klèman ak siyifikativman desann-reglemante kontni an melanin entraselilè nan yon fason ki depann de dòz la. Kojic asid (KA) te itilize kòm yon konpoze referans pou anti-melanogenesis paske li se souvan itilize kòm yon engredyan kosmetik po-eklèjman [1,3,4]. Koulè lysates nan selil ki trete glikoz te pi lejè pase koulè selil kontwòl yo (Figi 1C).
Anplis de sa, nou konfime ke kantite melanin sekrete nan medya kilti yo diminye ak koulè medya yo klere (Figi 1D). Apre sa, nou te envestige efè anti-melanogenic nan glikoz sou NHMs pigman fè nwa. Glikoz nan konsantrasyon jiska 100 mM pa t 'sitotoksik pou jiska kat 4 jou (Figi 1E). Lè kontni melanin te detèmine apre tretman glikoz nan NHMs pou 4 jou, nou te jwenn ke kontni melanin diminye nan yon fason ki depann de dòz (Figi 1F). Ansanm, rezilta sa yo endike ke glikoz siprime sentèz melanin nan melanosit.
2.2. Efè blanchiman glikoz sou yon ekivalan po moun 3D
Pou plis defini kapasite anti-melanogenic nan glikoz, nou te itilize yon modèl pigman po moun 3D, MelanoDerm. Jan sa dekri nan seksyon Materyèl ak Metòd yo, yo te aplike glikoz nan MelanoDerm pandan 18 jou, epi yo te detèmine viabilite selil yo pa yon tès CCK-8. Jan yo montre nan Figi 2A, pa gen okenn sitotoksisite tisi yo te obsève apre tretman glikoz pou 18 jou. Chanjman koulè tisi yo te evalye pa fotografi. Jan yo montre nan Figi 2B, tisi ki trete glikoz te pi lejè nan koulè pase tisi ki trete saline ki gen tanpon fosfat (PBS). Anplis de sa, tach ematoksilin ak eozin (H & E) revele ke glikoz pa t 'pwovoke efondreman tisi, pandan y ap fontana-masson (F & M) tach te montre ke glikoz diminye kantite melanosit ipèpigmantè (jan flèch yo endike) nan kouch fondamantal la (Figi 2C) .
Pou plis mennen ankèt sou chanjman ki fèt nan kontni melanin, nou konpare siyal oto-fluoresans melanin nan kouch melanosit nan tisi ki trete PBS ak glikoz lè l sèvi avèk mikwoskòp fluoresans eksitasyon de foton (TPEF), jan yo montre nan Figi 2D. Yon analiz de imaj sa yo te montre ke volim nan melanin te diminye pa apeprè 36 pousan ak entansite siyal TPEF pou melanin nan zòn nan melanosit ki rich te diminye pa apeprè 38 pousan nan tisi ki trete glikoz konpare ak tisi ki trete PBS.
Figi 2. Efè glikoz sou ekivalan po moun, MelanoDerm. (A) Viabilite ekivalan po moun trete ak glikoz. (B) Ekivalan po moun (MelanoDerm; n=3) yo te trete ak glikoz pou 18 d, epi apre yo te pran foto. Valè ∆L a endike degre légèreté konpare ak tisi trete PBS. (C) H&E ak F&M tach nan seksyon tisi yo. Glisad yo te fikse nan yon solisyon fòmaldeyid ak entegre nan sir parafin pou tach (ba echèl, 5{{10}} µm). Flèch nwa yo endike melanosit pigman. (D) Melanin D (200 × 200 × 60 µm3) nan ekivalan po moun te fèt lè l sèvi avèk TPEF mikwoskòp. Pseudocolored (wouj) siyal yo endike melanin (ba echèl, 50 µm). Grafik yo endike kantite volim melanin ak siyal TPEF yo. Done yo eksprime kòm mwayen ± SD nan omwen twa mezi endepandan (*p <0.05, ***p <0.001).
2.3. Efè glikoz sou ekspresyon de pwoteyin Melanogenic nan Melanocytes
Apre sa, pou nou elicide mekanis depigmantasyon glikoz nan melanosit, nou evalye efè li sou ekspresyon anzim melanojèn tankou tirozinaz ak Tyrp -1 nan selil B16 ak NHM yo. Selil B16 yo te trete ak glikoz pou fwa yo endike nan prezans -MSH. Lè sa a, nivo pwoteyin nan tirozinaz ak Tyrp -1 yo te detèmine pa tès Western blot (Figi 3A). Nivo ekspresyon tirozinaz ak Tyrp-1 pa t diminye pa glikoz nan nenpòt moman. Anplis de sa, nivo transkripsyon nan tirozinaz pa te afekte pa glikoz nan -MSH-stimile selil B16 (Figi 3B). Menm jan ak selil B16, nivo pwoteyin tirozinaz, Tyrp-1, ak MITF pa te anpeche pa glikoz (Figi 3C) nan selil NHM trete ak glikoz, ak nivo mRNA nan tirozinaz ak Tyrp-1 pa t tou. diminye, men pito yon ti kras ogmante pa glikoz (Figi 3D).
Figi 3. Efè glikoz sou ekspresyon pwoteyin melanojèn nan selil B16 ak NHM yo. (A, B) selil B16 yo te trete ak -MSH pou tan ki endike a nan prezans oswa absans 20 mM glikoz. Lè sa a, yo te fè tès Western blot (A) ak qRT-PCR (B). (C) NHM yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan glikoz pou 48 èdtan. Lè sa a, yo te fè tès Western blot la. (D) NHM yo te trete ak tan ki endike a nan prezans 50 mM glikoz. Lè sa a, yo te fè tès qRT-PCR. Done yo eksprime kòm mwayen ± SD nan omwen twa mezi endepandan.
2.4. Efè glikoz sou aktivite tirozinaz
Pou plis defini mekanis nan aksyon nan glikoz, nou teste si li te gen yon efè inhibition sou aktivite tirozinaz djondjon. Jan yo montre nan Figi 4A, nou te jwenn ke glikoz pa te gen okenn efè inhibition sou aktivite tirozinaz djondjon, ki endike ke glikoz pa afekte dirèkteman aktivite tirozinaz. Apre sa, nou te fè yon tès aktivite total tirozinaz intraselilè lè l sèvi avèk lisat selil ki trete glikoz ki soti nan tou de selil B16 ak NHM yo. Enteresan, aktivite tirozinaz intraselilè te anpeche nan yon fason ki depann de dòz nan selil B16 ki trete glikoz nan prezans -MSH (Figi 4B). Nan NHMs, glikoz tou inibit aktivite tirozinaz entraselilè (Figi 4C). Done sa yo sipòte posiblite pou glikoz endirèkteman inaktive tirozinaz nan melanosit.
Figi 4. Efè glikoz sou aktivite tirozinaz la. (A) Efè glikoz sou aktivite tirozinaz djondjon nan yon sistèm san selil. (B, C) tès aktivite selilè tirozinaz. (B) Selil B16 yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan glikoz pou 24 èdtan. Lè sa a, yo te fè tès aktivite tirozinaz selilè a, jan sa dekri nan seksyon metòd la. (C) NHM yo te trete ak 50 mM glikoz pou tan ki endike a. Lè sa a, yo te fè tès aktivite tirozinaz selilè a, jan sa dekri nan seksyon metòd la. Aktivite tirozinaz selilè a te nòmalize pa kontni total pwoteyin yo. Done yo eksprime kòm mwayen ± SD omwen twa mezi endepandan (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
2.5. Inaktivasyon tirozinaz pa pwodiksyon asid laktik nan melanosit ki trete glikoz
Glikoz konvèti nan laktat metabolit selilè, ki se asid laktik nan solisyon e ki te rapòte yo efikas nan trete blesi pigmantè [14,15]. Se poutèt sa, nou te sipoze ke glikoz konvèti nan asid laktik nan melanosit e ke nivo ogmante nan asid laktik anpeche melanogenesis nan inaktivasyon tirozinaz. Pou evalye ipotèz sa a, nou te premye evalye pwodiksyon asid laktik nan medya ki soti nan melanosit ki trete glikoz. Kòm espere, glikoz siyifikativman kontwole kontni asid laktik nan medya selil B16 kiltive (Figi 5A). Anplis de sa, paske asid laktik li te ye dirèkteman anpeche aktivite tirozinaz [15], nou evalye si asid laktik siprime aktivite tirozinaz djondjon. Jan yo montre nan Figi 5B, asid laktik dramatikman anpeche aktivite tirozinaz djondjon, kontrèman ak glikoz. Rezilta sa yo sijere ke konvèsyon nan glikoz nan asid laktik gen yon efè anti-melanogenic atravè inaktivasyon tirozinaz pa asid laktik la.
Figi 5. Pwodiksyon laktat pa glikoz ak efè asid laktik sou aktivite tirozinaz la. (A) Pwodiksyon laktat nan selil B16 trete ak glikoz. (A) Selil B16 yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan glikoz pou 3 d. Lè sa a, yo te fè yon tès laktat lè l sèvi avèk medya kiltive yo, jan sa dekri nan seksyon an metòd. (B) Efè asid laktik sou aktivite tirozinaz djondjon nan yon sistèm san selil. Done yo eksprime kòm mwayèn ± SD omwen twa mezi endepandan (*p < 0.05, **p <0.01, ***p < 0.001) .
3. Diskisyon
Sik oswa materyèl ki sòti sik yo souvan itilize kòm engredyan kosmetik pou pwoteksyon po ak kontwòl fizyolojik. Pou egzanp, rafinoz ogmante otofaji mTOR-endepandan ak diminye lanmò selil nan keratinosit UVB-iradyasyon, ki endike ke ajan natirèl la rafinoz gen valè potansyèl nan limite fotodamaj [16]. Trehalose ak sikwoz se nouvo aktivatè otofaji nan keratinosit imen atravè yon chemen mTOR-endepandan [17]. Konklizyon sa yo bay nouvo insight sou règleman sik nan otofaji nan keratinosit. Nan ka glikoz, yo te montre glikoz aktualite pwovoke claudin -1 ak ekspresyon filaggrin nan yon modèl sourit nan dèrmatit atopik ak kilti keratinosit, ki endike ke li gen yon efè anti-enflamatwa pa repare fonksyon baryè po [18]. Anplis de sa, glikoz inibit pwopagasyon ak amelyore diferansyasyon nan keratinosit po [19]. Se poutèt sa, glikoz kontwole divès aspè nan fizyoloji epidèm, tankou fonksyon baryè po ak nivo idratasyon keratinosit.
Sik yo ka aji kòm ajan depigmantè atravè plizyè mekanis diferan ki enplike tirozinaz. Pou egzanp, kèk ajan anpeche spirasyon tirozinaz, pandan ke lòt ajan pwovoke anpèchman ekspresyon jèn tirozinaz oswa aktivite [5,8-10]. Sepandan, kèk etid te envestige mekanis ki kache efè depigmantasyon glikoz.
Pou detèmine efè glikoz sou melanogenesis, nou te deja konsantre sou fwa X reseptè (LXRs), ki se ligand-aktive reseptè nikleyè ki jwe wòl esansyèl nan metabolis lipid ak omeyostazi kolestewòl [20]. Nou te jwenn ke fwa X deklanchman reseptè inibit melanogenesis nan akselerasyon an nan siyal kinaz reglemante ekstraselilè (ERK)-medyatè mikroftalmi ki asosye ak transkripsyon faktè (MITF) degradasyon [21]. Anplis de sa, glikoz se yon ligand LXR andojèn [22]. Kidonk, nou te ipotèz ke glikoz gen efè anti-melanogenic akòz aktivasyon an nan yon chemen LXR-depandan. Sepandan, jan yo montre nan Figi 3C, glikoz pa t chanje nivo ekspresyon tirozinaz oswa MITF, byenke aktivasyon LXR redwi nivo ekspresyon pwoteyin sa yo nan melanosit.
Se poutèt sa, nou konkli ke glikoz te gen efè depigmantasyon sou melanosit endepandan de aktivasyon LXR.
Glikoz se prensipal substrate pou pwodiksyon enèji, epi li idrolize atravè reyaksyon seri plizyè anzim, ke yo rekonèt kòm glikoliz. Anpil etid yo montre ke glikoliz gen yon sèl pwodwi final, asid laktik, si wi ou non nan kondisyon aerobic oswa anaerobik. Anba kondisyon aerobic (O2), laktat itilize kòm substra mitokondriyo laktat dehydrogenase (MLD). LDH yo konvèti li an piruvat ki antre nan sik asid trikarboksilik (TCA). Anba kondisyon anaerobik (N2), laktat akimile nan sitosol la. Se poutèt sa, chemen glikoliz la kòmanse ak glikoz kòm substra li epi li fini ak pwodiksyon laktat kòm pwodui prensipal fen li [23]. Anplis de sa, David et al. mezire fraksyon nan glikoz ki te konvèti nan asid laktik oswa piruvat nan melanosit nòmal imen an [24]. Pifò nan metabolit glikoz yo te asid laktik olye ke piruvat.
Asid laktik se yon asid alfa idroksi (AHA); asid sa yo yo itilize anpil nan fòmilasyon kosmetik kòm ajan dekale supèrfisyèl [25]. Anplis de sa, asid laktik siprime fòmasyon melanin pa dirèkteman anpeche aktivite tirozinaz, yon efè endepandan de nati asid li yo, ki vle di ke efè asid laktik sou blesi pigmantè yo se akòz pa sèlman akselerasyon woulman selil epidèm, men tou anpèchman dirèk nan fòmasyon melanin nan. melanosit [15]. Kidonk, nou te rezone ke glikoz ka egzèse efè anti-melanogenic li atravè pwodiksyon asid laktik paske glikoz ka konvèti nan asid laktik. Kòm espere, nou te jwenn ke tretman glikoz te lakòz pwodiksyon asid laktik nan melanosit (Figi 5A).
Anplis de sa, nou konfime ke asid laktik pwisan ak dirèkteman inibit aktivite tirozinaz (Figi 5B). Usuki et al. tou te dekouvri ke asid laktik diminye aktivite tirozinaz entraselilè nan selil B16 ak selil HM3KO imen [15]. Nan rapò a, mRNA ak nivo pwoteyin nan tirozinaz ak Tyrp-1 pa te afekte pa asid laktik. Ansanm, done sa yo endike ke glikoz ogmante pwodiksyon asid laktik e ke asid laktik sa a dirèkteman inibit aktivite tirozinaz san yo pa afekte nivo ekspresyon jèn, ki endike ke glikoz gen yon efè anti-melanogenic nan melanosit atravè inaktivasyon endirèk tirozinaz depann sou pwodiksyon asid laktik. Sepandan, plis eksperyans yo nesesè pou valide wòl asid laktik ak glikoz nan depigmantasyon.
Done kolektif ki soti nan etid sa a bay prèv preliminè sipòte sèvis piblik la nan glikoz aktualite kòm yon blanchi efikas kòm byen ke yon reyaktif idratan ki ka san danje itilize nan pwodui kosmetik ak fòmilasyon medsin.
4. Materyèl ak Metòd
4.1. Materyèl
D-glikoz, -MSH, asid kojik (KA), L-tirozin, L-DOPA, ak asid laktik yo te achte nan men Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Antikò kont tirozinaz ak aktin yo te achte nan men Abcam (Cambridge, UK). Antikò kont Tyrp-1 te achte nan men Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Antikò kont MITF te achte nan Proteintech (vil, IL, USA).
4.2. Kilti Selil ak Vitabilite Assay
Nou te achte selil B16 melanom murin yo, Dulbecco a modifye Eagle's medium (DMEM), ak serom fetal bovine (FBS) nan American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Selil B16 yo te kiltive nan DMEM ki gen 4500 mg/L glikoz segondè (ATCC 30-2002) jan manifakti a te rekòmande (ATCC) ak 5 pousan FBS, epi yo te enkubate a 37 ◦C nan yon atmosfè imidite ki gen 95 pousan lè ak 10 pousan CO2. Yo te achte NHM prensipal ki gen pigman nwa nan Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, USA). Selil yo te kiltive nan Mwayen 254 (#M254500) siplemantè ak Sipleman Kwasans Melanosit Imèn (#S0025) ak enkubasyon nan 37 ◦C anba yon atmosfè 5 pousan CO2. Pou eksperyans, yo te itilize NHM prensipal ant pasaj 4 ak 7. Yo te evalye viabilite selil kiltive yo lè l sèvi avèk yon Twous Konte Selil-8 (CCK{-8) jan manifakti a dekri (DOJINDO, Tokyo, Japon).
4.3. Mezi nan kontni Melanin
Kontni Melanin te detèmine jan sa dekri nan rapò anvan yo [2-4]. Yon ti tan, selil B16 yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan glikoz nan prezans -MSH (200 nM) pou 72 èdtan. NHM yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan glikoz pou 4 d. Apre sa, tout selil yo te lave ak saline tampon fosfat (PBS) epi yo fonn nan 1 N NaOH nan 60 ◦C pou 1 èdtan. Lisat selil yo te transfere nan yon plak 96-byen, epi yo te mezire absorbans nan 405 nm. Valè yo te nòmalize dapre konsantrasyon pwoteyin yo nan chak echantiyon byen.
4.4. Djondjon Tyrosinase Aktivite essai
Nou te envestige efè dirèk konsantrasyon ki endike nan glikoz sou aktivite tirozinaz djondjon. Yon ti tan, 100 µL tanpon fosfat ki gen glikoz te melanje ak tirozinaz djondjon (10 inite/byen) epi konbine avèk 50 µL 0.03 pousan L-tirosin oswa L-DOPA nan dlo distile. Lè sa a, melanj lan te enkube ansanm nan 37 ◦C pou 10 min, epi absòbe yo te mezire nan 405 nm. Kojik asid (KA), yon ajan anti-tirozinaz ki byen koni, yo te itilize kòm yon konpoze referans.
4.5. Esè aktivite Tirozinaz Entraselilè
Yon ti tan, selil B16 oswa NHM yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan glikoz pou fwa yo endike yo. Lè sa a, selil yo te lave ak PBS ak lysed pa enkubasyon nan 5 0 mM tanpon fosfat (pH 6.8) ki gen 1 pousan Triton X -100 ak 0.1 mM phenylmethyl-sulfonyl fliyò. Lè sa a, lisat selilè yo te santrifuje nan 12, 000 rpm nan 4 ◦C pou 20 min. Yo te kolekte supernatant ki gen tirozinaz selilè epi yo te detèmine kontni pwoteyin pou nòmalizasyon. Ekstrè selilè a te enkube ak L-DOPA nan tanpon fosfat epi yo te kontwole fòmasyon dopachrome pa mezire absorpsyon nan 405 nm nan 30 min.
4.6. Izolasyon RNA ak reyaksyon an tan reyèl transkripsyon ranvèse-polymerase (qRT-PCR)
Pou detèmine ekspresyon relatif mRNA nan jèn chwazi yo, yo te izole RNA total ak TRIzol (Invitrogen, CA, USA), dapre enstriksyon manifakti a, epi yo te transkri 4 µg RNA nan cDNA lè l sèvi avèk RT-premix (Bioneer, Seoul, Sid). Kore). Yo te fè PCR quantitative lè l sèvi avèk yon ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ansanm Jadendanfan qRT-PCR yo pou tirozinaz ak Tyrp-1 yo te achte nan men Applied Biosystems, epi yo te itilize twous TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) pou anplifikasyon. Ekspresyon jèn sib yo te nòmalize ak sa ki nan jèn nan menaj ki kode pwoteyin ribosomal tij lateral subunit P0 (RPLP0). Yo te fè quantization relatif lè l sèvi avèk metòd konparatif ∆∆Ct selon enstriksyon manifakti a.
4.7. Western Blotting
Selil yo te lave de fwa ak PBS frèt ak Lè sa a, lysed nan glas-frèt modifye tanpon RIPA (Cell Signaling Technology, MA, USA) ki gen inibitè proteaz (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). Konsantrasyon total pwoteyin yo te detèmine, epi SDS-PAGE te rezoud pwoteyin yo sou 4-12 pousan gradyan Bis-Tris jèl (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), transfere nan manbràn nitrocellulose (Thermo Fisher Scientific). Apre transfè, manbràn yo te bloke nan yon solisyon bloke 5 pousan. Manbràn yo te enkube ak antikò prensipal yo nan 4 ◦C pou 24 èdtan, yo te lave ak saline Tris-tampon ki gen 0.1 pousan Tween-20 (TBST), epi yo te ekspoze a antikò segondè ki konjige peroksidaz pou 1 èdtan. nan tanperati chanm. Manbràn yo te rense twa fwa ak TBST. Yo te devlope yon siyal chemiluminesan lè l sèvi avèk reyaktif Western blotting ECL (GE Healthcare, Hatfield, UK).
4.8. Twa dimansyon (3D) ekivalan po moun
Nou te itilize MelanoDerm (MEL{0}}B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA) kòm yon modèl tisi po moun. Sa a solid, rekonstitye, ekivalan po moun 3D te sòti nan donatè nwa epi li gen melanosit nòmal ak keratinosit. MelanoDerm te grandi nan koòdone lè-likid nan mwayen EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, USA). Anvan tretman glikoz, tisi yo te lave ak 1 mL PBS pou retire konpoze rezidyèl yo. Glikoz te fonn nan PBS. Konsantrasyon final glikoz la te 2 pousan. Echantiyon kontwòl la te trete sèlman ak PBS. Yo te aplike glikoz nan MelanoDerm nan jou 1, 4, 6, 8, 11, 13, ak 15. Apre 18 jou, tisi MelanoDerm yo te fikse nan fòmaldeyid 4 pousan tanpon, entegre nan parafine, koupe nan yon epesè 3 µm, epi yo te sibi. nan H&E ak tach F&M. Yo te evalye viabilite echantiyon tisi yo lè l sèvi avèk yon Twous konte selil -8 (CCK{-8) jan manifakti a dekri (DOJINDO, Tokyo, Japon). Pigmantasyon MelanoDerm la te evalye lè w konpare chanjman nan valè L*.
4.9. De-Photon eksitasyon Fluorescence (TPEF) Imaging
Pou visualize distribisyon melanin nan ekivalan po imen an 3D, nou te fè imaj TPEF, jan sa dekri nan rapò anvan nou an [3,4]. Yon ti tan, yo te fikse chak preparasyon MelanoDerm nan fòmalin 4 pousan pou 24 èdtan nan 4 ◦C epi lave ak PBS/0.1 pousan BSA (albumin serom bovin, Merck, Branchburg, NJ, USA). Imaj TPEF yo te akeri nan kouch fondamantal la pou mezire melanin entraselilè nan kouch melanosit la. Relatif entansite siyal TPEF pou melanin nan volim mezi a te mezire lè l sèvi avèk lojisyèl Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).
4.10. Esè L-lactate
Selil B16 yo te simen nan 1.0 × 105 selil pou chak pi nan yon plak 12-pou. Apre tretman ak glikoz pou 3 jou, nivo laktat ekstraselilè yo te mezire lè l sèvi avèk yon twous tès kolorimetri L-laktat (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) dapre pwotokòl manifakti a.
4.11. Analiz estatistik
Done yo eksprime kòm mwayen ± SDs (devyasyon estanda), epi yo te detèmine siyifikasyon estatistik pa Tès Elèv la. Yon p-valè < 0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan.
Kontribisyon otè:
Konsepyalizasyon, H.-JK, JL, ak CSL; Done curation, SHL; Envestigasyon, SHL; Metodoloji, SHL, I.-HB, ak E.-SL; Sipèvizyon, JL, ak CSL; Redaksyon—Bouyon orijinal, SHL, ak CSL; Redaksyon—revizyon ak koreksyon, JL Tout otè yo te li epi dakò ak vèsyon maniskri a ki te pibliye a.
Finansman:
Rechèch sa a te finanse pa Pwogram Rechèch Syans Debaz atravè Fondasyon Nasyonal Rechèch Kore di (NRF) ki te finanse pa Ministè Edikasyon (Nimewo Sibvansyon: 2018R1D1A1B07049402).
Konfli enterè:
Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.
Abreviyasyon yo
-MSH -melanocyte-stimulant òmòn
Tyrp-1 pwoteyin ki gen rapò ak tirozinaz 1
MITF faktè transkripsyon ki asosye ak mikroftalmi
NHM yo nòmal melanosit imen
TPEF de-foton eksitasyon fluoresans
LXR fwa X reseptè
AHAs asid alfa idroksi
H&E ematoksilin ak eozin
F&M Fontana-Masson
Referans
1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Envestige wòl melanin nan UVA/UVB ak oksijene idwojèn-Enduit selilè ak mitokondriyo pwodiksyon ROS ak domaj ADN mitokondriyo nan selil melanom imen. Radik gratis. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]
2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Yon nouvo dérivé adamantyl benzylbenzamide, AP736, siprime melanogenesis atravè anpèchman nan cAMP-PKA-CREB-aktive mikroftalmi-Asosye faktè transcription ak ekspresyon tirozinaz. Eksp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]
3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Oh, SG; et al. Efikasite antimelanogenic Melasolv (3,4,5-Trimethoxycinnamate Thymol Ester) nan Melanocytes ak ekivalan po moun twa dimansyon. Po Pharmacol. Fizyol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]
4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Mannosyrythritol lipid anpeche melanogenesis atravè siyal ERK-CREB-MITF-Tyrosinase nan melanosit nòmal imen ak yon ekivalan po moun ki genyen twa dimansyon. Eksp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]
5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Devlopman ajan anti-melanogenic ki baze sou sik. Ent. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]
6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Melanogenesis Inhibitors. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]
7. Ando, H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Odyans, VJ Apwòch yo idantifye inibitè nan biosentèz melanin atravè kontwòl kalite a nan tirozinaz. J. Envesti Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]
8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MWEN; Yoon, TJ Dezòd glikozilasyon tirosinaz pa N-acetylglucosamine ak efè depigmantasyon li yo nan po kochon Gine ak po moun. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]
9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Efikasite depigmantasyon asid galakturonik atravè règleman tirozinaz nan selil B16 melanom murin ak yon ekivalan po moun ki genyen twa dimansyon. Clin. Eksp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]
10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Efè yon idrat kabòn siklik ki pa Cyclodextrin sou selil melanom sourit: Karakterizasyon yon nouvo kalite sik ipopigmante. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]
11. Khan, MT Nouvo inibitè tirozinaz ki soti nan resous natirèl–Etid enfòmatik yo. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]
12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: Yon revizyon mete ajou sou aspè byolojik, chimik ak klinik. Pigman. Selil. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]
13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Diferan efè senk konpoze de-pigmantè, rhododendron, ketonn Franbwaz, monobenzone, rucinol, ak AP736 sou melanogenesis ak viabilite nan melanosit epidèm imen. Eksp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]
14. Mulukutla, BC; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Metabolis glikoz nan kilti selil mamifè: Nouvo lide pou ajiste chemen ansyen yo. Tandans. Biotechnol. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]
15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Efè inhibition asid glikolik ak asid laktik sou sentèz melanin nan selil melanom. Eksp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]
16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Raffinose ogmante otofaji ak diminye lanmò selil nan keratinosit UVB-iradyasyon. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]
17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehalose, sikwoz, ak rafinoz se nouvo aktivatè otofaji nan keratinosit imen atravè yon chemen mTOR-Endepandan. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]
18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Topical Glikoz pwovoke Claudin -1 ak Filaggrin ekspresyon nan yon modèl sourit dèrmatit atopik ak nan kilti Keratinocyte, Egzèsis efè anti-enflamatwa pa repare fonksyon baryè po. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]
19. Spravchikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Efè glikoz sou keratinosit po: Enplikasyon pou konplikasyon po dyabèt. Dyabèt 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]
20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Reseptè nikleyè nan byoloji macrophage: nan kafou metabolis lipid ak enflamasyon. Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]
21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Pitit gason, ED; Park, YH; Lim, KM aktivasyon reseptè Liver X inibit melanogenesis atravè akselerasyon degradasyon ERK-Medyate MITF. J. Envesti. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]
22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. LXR reseptè nikleyè a se yon Capteur glikoz. Lanati 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]
23. Schurr, A. idrat kabòn; IntechOpen: London, UK, 2017; paj 21–35.
24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Comparative metabolik Flux Profiling nan liy selil melanom: Beyond the Warburg effect. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]
25. Tang, SC; Yang, JH Doub efè asid Alpha-Idroksi sou po a. Molecules 2018, 23, 863. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
