Aktivite imunostimulatwa nan polisakarid dlo ekstrè soti nan Cistanche Deserticola kòm yon plant adjuvant in vitro.

Pou plis enfòmasyon:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Xinjiang Kle Laboratwa Resous Byolojik ak Jenetik Jeni, Kolèj Syans Lavi ak Teknoloji, Inivèsite Xinjiang, Urumqi, Xinjiang, Lachin,

2 Kle Laboratwa nan Viroloji Medikal Molekilè, Lekòl Syans Medikal Debaz, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, Lachin,

3 College of LifeScience and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xian, Shanxi, Lachin

Résumé

Yon adjuvant vaksen ki an sekirite epi ki efikas enpòtan nan vaksen modèn yo. Divès Chinwapolisakarid èrbalka aktive sistèm iminitè a.Cistanche deserticola(CD) se yon zèb tradisyonèl Chinwa ak yon kandida adjuvant. Isit la, nou konfime sapolisakarid dlo ekstrènan CD (WPCD) te kapab modile repons iminitè an vitro ak nan vivo.Nan yon fason ki depann de dòz, WPCD siyifikativman ankouraje spirasyon ak fonksyon selil dendritik murin ki sòti nan mwèl yo (BM-DCs) atravè reglemante nivo ekspresyon MHC yo. -II, CD86, CD80, ak CD40, alojenik pwopagasyon selil T, ak pwodiksyon IL-12ak TNF- atravè toll-like receptor4 (TLR4), jan sa endike nan eksperyans in vitro. Anplis de sa, aktivite imunomodulateur li yo te obsève tou nan sourit yo. WPCD efektivman amelyore tit yo nan IgG, IgG1, ak IgG2a epi li amelyore anpil pwopagasyon selil T ak B, pwodiksyon IFN- ak IL-4 nan selil CD4 plis T, ak nivo ekspresyon IFN- nan CD8. plis selil T pi bon pase Alum. Anplis de sa, WPCD te kapab byen kontwole nivo ekspresyon CD40 ak CD80 sou DCs nan larat la epi desann frekans Treg la. Etid la sijere ke polisakarid Cistanche deserticola se yon adjuvant vaksen ki san danje epi ki efikas pou pwovoke iminite imè ak iminite selilè lè yo aktive DC atravè chemen siyal TLR4 la.

Klike sou pwodwi tij Cistanche

Entwodiksyon

Vaksen yo enpòtan pou kontwole oswa anpeche maladi. Vaksen ki fèk pwodwi ak aktyèl devlope yo trè pirifye recombinantantijènak pi wo sekirite, men pirifye antijèn pa ka ankouraje yon satisfezanrepons iminitèkonpare ak preparasyon patojèn atenue oswa inaktive. Avèk èd nan adjuvant, vaksen ka pwovoke pèsistanrepons iminitè yo[1,2]. Nouvo adjuvant pwisan yo lajman konsène nan tou de devlopman vaksen ak sante moun. Pou dat, divès kalite adjuvant yo te idantifye ak anpil etidye. Adjuvant sa yo bay vaksen yo plizyè avantaj, tankou diminye kantite antijèn ki nesesè yo, minimize kantite vaksen ki nesesè pou repons iminitè nòmal yo, epi pwovoke pi rapid, pi laj, ak pi fò.repons iminitè yo[3–5]. Malgre ke anpil adjuvant ki pisan yo te devlope, tankou lipopolysaccharide (LPS) ak adjuvant konplè Freund a (FCA), yo pa lajman aplike akòz toksisite yo. Pakonsekan, sèlman kèk adjuvant, tankou Alum, gen lisans pou itilizasyon klinik [6]. An jeneral, yo ta dwe devlope adjuvant ki pi efikas ak pi an sekirite pou ankouraje pi bon vaksen prophylactiques ak terapetik kont maladi enfektye ak maladi ki pa enfektye.

Sekirite se yon faktè konsiderasyon enpòtan nan devlopman adjuvant. Konstitiyan èrbeuz Chinwa yo enkli eleman nitritif ak konpoze aktif enpòtan, tankou konpoze fenolik ak polisakarid, ki ka aji kòm imunostimulan pwisan [7-9]. Pami yo, polisakarid ki soti nan remèd fèy tradisyonèl Chinwa yo te lajman eksplore akòz aktivite imunostimulatwa yo ak toksisite ki ba. Pou egzanp, inulin se yon adjuvant iminitè san toksisite nan lòt adjuvant tankou FCA. AdvaxTM delta inulin adjuvant tou te avèk siksè amelyore iminojenisite vaksen yo [10,11]. Astragalus, ke yo rele tou Huangqi nan Chinwa ak Radix Astragali nan Latin, lajman distribye nan tout mond lan. Polisakarid se youn nan pi gwo engredyan aktif li yo ki responsab pou aktivite imunomodulateur la. Etid eksperimantal yo te demontre ke Astragalus polisakarid posede efè imunomodulatwa fò tou de nan vitro ak nan vivo [12, 13]. Lycium barbarum polisakarid kòm adjuvant vaksen tou te montre bon amelyorasyon ak efè enteresan [14, 15]. Etid sa yo sijere ke polisakarid èrbal Chinwa yo te kandida ideyal pou devlopman adjuvant.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, "Rou Cong Rong" nan Chinwa) se yon bonjan zèb tradisyonèl Chinwa ak souvan konsidere kòm "Ginseng nan dezè yo" paske nan efè siperyè tonik li yo. Li distribye nan rejyon arid oswa semi-arid nan Xinjiang. Nan Lachin, yo te itilize tij chèch li kòm yon manje tonik pou plizyè santèn ane [16, 17]. Pandan plizyè ane, CD bouyi yo te itilize kòm yon manje tonik pou trete andikap ki lakòz twòp fatig, ki sijere ke li an sekirite pou administrasyon oral. Plant sa a lajman konsène akòz gwo fonksyon medsin li yo. Dènye etid fitochimik ak famasi te demontre ke polisakarid yo te prensipal eleman biyolojik aktif e li te gen divès efè byolojik, ki gen ladan aktivite imunomodulateur, efè antioksidan, ak efè anti-enflamatwa [18-21]. Sepandan, aktivite amelyorasyon iminitè polisakarid dlo-extractable nan C. deserticola nan Xinjiang te raman rapòte.

Li se byen li te ye ke DC yo se selil enpòtan ki prezante antijèn (APCs) ki bay siyal ki nesesè pou kòmanse repons iminitè ak modulation selil natirèl ak adaptasyon. Gen kèk adjuvant ki amelyore absòpsyon antijèn pa DC yo ka ogmante molekil ko-stimulatwa oswa MHC ak amelyore iminite. Lè DCs spirasyon kòmanse, plis molekil ko-stimulatwa ak sitokin yo pwodui ak DC yo montre fenotip diferan [22, 23].

Nan etid sa a, nou premye eksplwate si WPCD ta ka ankouraje deklanchman DCs viaTLR4 siyal chemen an vivo. Depi DC yo te lyen ki genyen ant repons iminitè natirèl ak adaptasyon, nou te sipoze ke deklanchman DCs ankouraje pa WPCD ta enfliyanse rezilta iminite adaptasyon. Nou egzamine repons iminitè espesifik nan ovalbumin (OVA) nan sourit ki trete ak WPCD, ki gen ladan tit IgG, IgG1, ak IgG2a sou klas, T- ak B- pwopagasyon, ak pwodiksyon cytokine. Nou te envestige si tretman WPCD ta ogmante aktivite DCs ak selil Treg nan larat sourit sa yo. Konklizyon nou yo te pwouve potansyèl aktivite iminomodulatwa polisakarid natirèl ki soti nan C. deserticola ak elaji sijè ki abòde aplikasyon li yo.

Materyèl ak metòd

Bèt

Uit a dis semèn C57BL/6, BALB/c, oswa ICR sourit fi yo te achte nan men FirstHospital nan Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Lachin). Sourit yo te loje nan kondisyon san patojèn dapre direktiv Komite Swen ak Itilizasyon Animal (ACUC) nan Inivèsite Xinjiang pou Sante Animal ak Byennèt. Pwosedi eksperyans bèt yo te apwouve pa AUCC nan Xinjiang University.

Ekstraksyon nan ekstrè akeuz

C. deserticola se yon plant nan pwovens Xinjiang nan peyi Lachin. Polisakarid brit la te jwenn nan ekstraksyon dlo ak presipitasyon etanòl. Yon ti tan, 100 g C. deserticola seche an poud epi answit filtre. Poud lan te refluxed ak etè petwòl nan tanperati chanm repete epi Lè sa a, refluxed ak etanòl anidrid pou 1 èdtan yo retire engredyan ki gen koulè pal ak lipid. Rezid yo te ekstrè ak dlo bouyi twa fwa epi ekstrè yo te pisin ansanm, santrifuje nan 4000 rpm pou 10 min, ak rflu nan 60˚C pou 4 èdtan. Kat fwa nan volim nan 95 pousan etanòl yo te ajoute nan solisyon an nan lòd yo presipite polisakarid brit. Polisakarid brit yo te re-fonn nan dlo distile epi trete ak reyaktif Savage pou retire pwoteyin. Ekstrè yo te fonn nan PBS epi esterilize atravè filtè 0.22-μm. Finalman, kontni an sik total nan WPCD te 59.58 pousan, jan sa endike nan analiz la fenol-sulfurik asid [24].

Jenerasyon DCs

BM-DC yo te pwodwi dapre metòd ki dekri deja ak modifikasyon ti tay [25]. Yo te retire DC mwèl zo ki soti nan sourit C57BL/6 ak mwayen konplè RPMI-1640 (Gibco) ki te konplete ak 10 pousan serom fetis ti towo bèf (Hyclone). Selil yo kolekte yo te re-sispann nan mwayen RPMI-1640 ak 50 μM -mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO) ak 20 ng/mL murin GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) ak enkubasyon nan 37˚ C nan 5 pousan atmosfè CO2. Mwatye mwayen kilti a te ranplase pa yon mwayen fre ki gen GM-CSF chak 1-2 jou. Selil yo te kolekte nan Jou 6, trete ak diferan dòz WPCD, LPS (100 ng / mL) (Sigma, St Louis, MO) pou 24 èdtan, ak Lè sa a, evalye pa sikometri koule.

Deteksyon nan spirasyon nan DCs ak aktivasyon selil T nan vitro

Efè spirasyon in vitro nan WPCD sou BM-DC yo te evalye ki baze sou rezilta analiz fenotipik pa FACs. Jou 7, yo te pwovoke BM-DC ki soti nan C57BL/6 an prezans GM-CSF epi yo te trete yo ak diferan konsantrasyon WPCD (0.01, 0.{{11) }}2, 0.05, 0.1, ak 0.2 mg/mL) pou 12 èdtan an twa fwa. LPS (100 ng/mL) te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Apre BM-DC yo te lave nan PBS ak Fc Block (BD Biosciences, CA) yo te itilize pou anpeche nonspecific antikò-obligatwa, selil yo te tache nan PBS lè l sèvi avèk apwopriye FITC-, PE-, oswa APC-konjige CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80, ak antikò MHC-II (BD) pou 20 min nan 37˚C. Selil tache yo te detekte pa FACs Calibur (BD). Analiz done yo te fèt ak lojisyèl FlowJo (Tree Star).

Nan eksperyans DCS spirasyon an vitro, yo te kolekte supernatant kilti selil yo tou pou analize IL-12 ak TNF- lè l sèvi avèk twous tès cytokine (Boster, Wuhan, Lachin) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te mezire absorbans nan 450 nm ak yon lektè plak ELISA (Bio-Rad, USA). Kantite cytokine nan echantiyon yo te kalkile ak koub estanda nan cytokin recombinant dapre metòd la regression lineyè.

Pou teste aktivite stimulatory allogenic yo, yo te fè eksperyans nan reyaksyon lenfosit melanje (MLR) dapre metòd anvan an [26] pa MTT (Sigma, St Louis, MO). Yon ti tan, BM-DC ki soti nan sourit C57BL/6 yo te itilize kòm selil stimulateur yo te refè nan Jou 7 nan mwayen RPMI-1640 plis GM-CSF epi trete ak divès kalite konsantrasyon nan WPCD pou 12 èdtan nan 37˚C. Selil yo te lave epi re-sispann nan mwayen RPMI-1640 anvan yo te plake nan 24-plak la byen. Singleplenocyte sispansyon kòm selil sekouris yo te izole nan sourit BALB/c. BM-DC yo te melanje ak splenosit dapre rapò yo nan 1:5 ak 1:10. Selil yo te kiltive nan 37˚C nan yon atmosfè 5 pousan CO2 pandan twa jou an twa fwa. Tretman LPS te itilize kòm yon kontwòl pozitif. Kilti yo te ajoute apre sa ak 20 μL MTT pou dènye 4-h kiltivasyon an. Absorbans yo nan longèdonn mezire (490 nm) ak longèdonn referans (650 nm) yo te mezire pou analiz pwopagasyon selil T. Tout echantiyon yo te mezire kont yon kontwòl background.

Tretman pa TLR4 inibitè nan vitro

BM-DC yo te pre-trete ak 5 μM TAK-242 (anibitè nan TLR4, Medchemexpress Inc.USA) pou 1 èdtan ak Lè sa a, ko-kilti ak divès kalite konsantrasyon nan WPCD (100 ak 200 ug / mL) pou 12 èdtan. an prezans oswa absans Golgi Stop an triple. Nan kontwòl pozitif, LPS te ajoute. Selil ak supernatant yo te detekte pa FAC yo pou analize makè sifas CD86ak CD40 ak pa ELISA pou analize cytokines TNF-a ak IL-12, respektivman.

Pwotokòl vaksinasyon

Tès toksisite egi. Nan tès oral egi toksisite nan etid sa a, yo te itilize 40 sourit ICR adilt ki an sante. Sourit ICR yo te jèn (manje men pa dlo lannwit lan) anvan yo pran dòz la. WPCD te administre oralman respektivman nan dòz 0, 50, 500, oswa 5000 mg / kg pwa kò a chak bèt pandan 7 jou. Sourit trete ak saline ak alun-trete yo te enkli nan gwoup kontwòl la. Yo te obsève bèt yo chak jou nan 14 jou youn apre lòt. Sourit yo te obsève endividyèlman pou anrejistre mòtalite ak siy klinik yo. Anplis de sa, pwa kò yo ak konsomasyon manje ak dlo yo te mezire pandan tout eksperyans la. Nan Jou 14, yo te kalkile endèks larat oswa timis kòm (pwa larat oswa timis / pwa kò) × 10.

Deteksyon aktivite imunomodulateur WPCD nan vivo. Pou envestige si WPCD te gen aktivite imunomodulateur, ovalbumin (OVA) (Sigma) te itilize kòm modèl antijèn ak sourit ICR fi yo te owaza separe an 7 gwoup (gwoup kontwòl negatif (0.9 pousan NaCl ak WPCD 400 ug) ak kontwòl pozitif la (Alum 200 ug ak OVA)). Sourit yo te administre anba lar de fwa ak 10 ug OVA pou kont li oswa WPCD ak OVA dapre dòz la nan 20, 100, oswa 400 ug ak yon entèval 2-semèn. Echantiyon san ak larat yo te jwenn apre vaksinasyon rapèl la pou yo ka detekte tit IgG, subklas IgG, pwopagasyon splenosit ak sitokin, makè sifas DCs, ak frekans Treg.

Deteksyon antikò espesifik OVA

ELISA te egzamine tit ak subklas IgG espesifik pou OVA dapre metòd anvan an [27]. Plak ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) yo te kouvwi lannwit lan epi yo te bloke. Echantiyon serom yo te dilye seri pou analiz tit IgG oswa deteksyon IgG1 ak IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Lè sa a, plak yo te enkube ak PBST ki gen HRP-konjige anti-sourit IgG, IgG1, ak IgG2a pou 1 èdtan nan 37˚C. Reyaksyon kolorimetrik la te devlope ak tetramethylbenzidine (TMB) ak Lè sa a, absorbances yo nan 450 nm / 655 nm yo te mezire ak eksprime kòm inite dansite optik (OD).

Deteksyon pwopagasyon splenosit ak sitokin

Pwopagasyon splenosit te detèmine pa tès MTT la. Nan jou 21 apre premye vaksinasyon an, yo te jwenn yon sèl sispansyon splenosit. Selil yo te kiltive nan mwayen RPMI-1640 nan plak96-byen dapre konsantrasyon 1 × 106 selil/byen an twa fwa. Kilti yo te ankouraje ak OVA (konsantrasyon final 10 ug/mL), ConA (konsantrasyon final 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO), ak LPS (konsantrasyon final 100 ng/mL) pou 48 èdtan nan 37˚C. . Selil yo te kiltive pou 48 èdtan ak 20 μL (5 mg / mL) nan MTT (Sigma, St Louis, MO) te ajoute nan chak pi ak enkubasyon pou yon lòt 4 èdtan. Apre yo fin ajoute 50 μL DMSO nan chak pi pou sispann devlopman koulè (Sigma), plak yo te li nan 570 nm pa yon lektè plak microtiter (Bio-Rad, CA, USA). Pwopagasyon splenosit te eksprime kòm endèks eksitasyon (SI), ki te rapò a OD570 nm nan yon pi stimulé nan yon pi unstimulated.

Yo te mezire pwodiksyon IL-4 ak IFN- nan selil T pa tach intraselilè cytokine dapre yon pwotokòl pibliye ak modifikasyon minè [27, 28]. Sispansyon sèl splenosit te prepare nan Jou 21 apre premye vaksinasyon an. Apre liz globil wouj nan san, yo te enkube splenosit la (2 × 106 selil / mL) ak OVA (10 ug / mL) pou 4- eksitasyon h ak Golgi stop (BD) te ajoute pou 12 h enkubasyon, PMA kòm yon kontwòl pozitif. Selil yo te kolekte, lave ak PBS, tache ak CD4-FITC/CD8-FITC, epi yo te fiks ak pèmeabilize ak Cyto fix/Cytoperm kit (BD) dapre enstriksyon manifakti a. Yo te fè tach cytokine intraselilè ak konsantrasyon apwopriye IL-4-PE oswa IFN- -APC antikò nan 4˚C pou 20 min. Selil tache yo te detekte pa FAC yo. Analiz done yo te fèt nan FlowJo la.

Evalyasyon spirasyon DCs ak selil Treg nan larat la

Pou analiz de spirasyon DCs soti nan splenosit nan sourit, yo te fè tach sifas selil yo ak antikò CD11c-PE, CD40-FITC, ak CD80-APC. Nan jou 3 apre premye vaksinasyon an, yo te jwenn yon sèl sispansyon splenosit (1 × 106 selil/mL) epi selil yo te sibi doub tach. FACs Calibur te mezire entansite fliyoresan yo epi FlowJo analize done yo mezire.

Yo nan lòd yo obsève si WPCD te kapab desann-reglemante frekans nan CD4 plis CD25 plis Foxp3 plis Treg selil yo. Sispansyon sèl splenosit te prepare nan jou 7 apre dezyèm vaksinasyon an. Splenosit la (2 × 106 selil/mL) te sibi tach sifas selil ak antikò CD4-APC, ki te swiv pa tach cytokin nikleyè ak antikò CD25-FITC ak Foxp3-PE ki apwopriye ak twous la sourit regilasyon T-selil tach (eBios ciences) dapre enstriksyon manifakti a. Frekans CD4 plis CD25 plis Foxp3 plis selil Treg yo te teste sou FACs. Analiz done yo te fèt nan FlowJo la.

Analiz estatistik

Yon sèl-fason analiz de divèjans (ANOVA) tès (Tukey's Multiple-Comparison Test) te fèt pou analize diferans ki genyen ant plizyè gwoup eksperimantal. Tout valè yo eksprime kòm mwayen ± SD. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Rezilta yo

WPCD ankouraje spirasyon ak fonksyon BM-DC nan vitro

Iminite adaptasyon detèmine pa deklanchman DCs, ki gen ladan kalite molekil ko-stimulatwa ak sitokin [29, 30]. Okòmansman, nou te envestige si WPCD te kapab ankouraje ekspresyon de molekil ko-stimulation. Dapre diferan dòz WPCD, yo te administre BM-DC ki soti nan C57BL/6. Nivo ekspresyon CD11c, CD86, CD80, CD40, ak MHC-II nan selil yo te analize (figi 1). Selil yo fèmen ak SSC ak FSC te montre ke tretman an ak diferan dòz WPCD pa t chanje mòfoloji BM-DCs (done yo pa montre). Nivo ekspresyon CD86, CD80, ak CD40 te siyifikativman kontwole nan yon fason ki depann de dòz konpare ak gwoup la ki pa trete epi yo te rive nan plato a anba dòz 20 ug/mL WPCD, men diferans lan te. pa enpòtan konpare ak gwoup LPS la (Fig 1A-1C). Nivo ekspresyon MHC-II siyifikativman ogmante nan valè maksimòm li anba dòz 50 ug/mL (figi 1D). Rezilta analiz makè sifas selilè yo te demontre ke DC yo trete ak LPS oswa WPCD te montre nivo ekspresyon siyifikativman ogmante nan CD86, CD80, CD40, ak MHC-II ak ankouraje spirasyon fenotip.

Gen kèk adjuvant ki ka ogmante molekil ko-stimulatwa sou DC oswa dirèkteman pwovoke sekresyon sitokin. IL-12 ak TNF- se pi gwo sitokin pou aktive repons iminitè Th1. Nou analize pwodiksyon cytokine nan BM-DCs sou tretman WPCD. Apre BM-DC yo te trete ak diferan kontni WPCD pou 12 èdtan, yo te kolekte supernatant la pou detekte sa ki nan IL-12 ak TNF- ak yon twous ELISA. WPCD te kapab ogmante pwodiksyon IL -12 (figi 2A) ak TNF- (figi 2B). Rezilta yo demontre ke WPCD te kapab pwovoke spirasyon fonksyonèl DC yo

Nan yon repons iminitè, li nesesè pou fonksyonèl aktive DCs. Lè sa a, nivo ki pi wo nan pwopagasyon selil T allojenik yo te pwovoke pa DC ki gen matirite konplètman. Se poutèt sa, repons fonksyonèl DCs nan WPCD te envestige pa MLR. Kapasite allostimulatory DCs pwovoke WPCD, menm jan ak LPS, te amelyore dramatikman nan yon fason ki depann de dòz nan rapò ki endike a (figi 2C ak 2D). Rezilta yo endike ke WPCD amelyore prezantasyon antijèn ak optimize repons selil T pa MLR nan vitro.

WPCD ankouraje spirasyon DC yo atravè chemen TLR4

Li ta ka dedwi nan rezilta ki anwo yo ke BM-DC aktive pa WPCD endike ekspresyon molekil sifas DCs menm jan ak LPS (yon ligand TLR4). Nou konsa ipotèz ke BM-DC yo aktive pa WPCD atravè chemen TLR4 la. Apre BM-DC yo te pretrete ak TAK-242 (inibitè TLR4) ak ko-kilti ak WPCD ak LPS pou 12 èdtan, ekspresyon CD40, CD86, TNF-a, oswa IL{{12 }} te detekte pa FACs oswa ELISA. Jan yo montre nan Fig 3A ak 3B, tretman TAK-242 te lakòz ekspresyon siyifikativman anba reglemante nan CD40 ak CD86 pwovoke pa LPS oswa WPCD, ak pwodiksyon sitokin nan IL-12 oswa TNF-a te tou siyifikativman diminye (figi 3C ak 3D). Rezilta yo endike ke WPCD te kapab aktive spirasyon DC atravè chemen TLR4 la.

WPCD amelyore iminite umoral ak selilè

Pou rezon konparezon, nou evalye efè WPCD sou eksitasyon repons iminitè umoral nan sourit iminize OVA. Anvan vaksinasyon an ak jou 14, 21, 35, ak 49 apre premye vaksinasyon an, yo te kolekte san pou detekte tit IgG ak serom IgG sou klas pa ELISA. Repons antikò IgG nan OVA ogmante ak ogmantasyon nan dòz WPCD administrasyon (100 ak 400 ug) nan yon fason ki depann de dòz (figi 4). Konsantrasyon pi bon an te 100 ug / mL nan WPCD ak ogmante repons IgG pa de fwa konpare ak OVA a pou kont li nan Jou 21, 35, ak 49 (Fig 4A). Ogmantasyon konsiderab nan OVA-espesifik IgG1 ak IgG2a nivo antikò anba 20 ak 100 ug nan administrasyon WPCD yo te jwenn konpare ak gwoup la OVA nan serom nan Jou 35 (Fig 4B). Pandan se tan, Alum ankouraje sèlman nivo ekspresyon nan OVA-espesifik IgG ak IgG1 antikò nan sourit iminize yo. WPCD pou kont li pa t 'deklanche OVA-espesifik antikò. Rezilta ki anwo yo evidamman endike ke WPCD te pwodwi pi wo tit antikò ak repons Th1/Th2 ki pi ekilibre pase Alum.

Pwopagasyon splenosit se yon lòt endikatè iminite selilè. ConA stimul selil T ak LPS stimul pwopagasyon selil B yo. Nan jou 21 apre premye vaksinasyon an, yo te jwenn sispansyon yon sèl splenosit epi respektivman ankouraje ak OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL) peptide, ConA (5 ug/mL) ak LPS (5). ug/mL) pou 48 èdtan. Lè sa a, pwopagasyon selil T yo te mezire pa metòd MTT la. WPCD te kapab siyifikativman ankouraje OVA-antigen, Con A-mitogen ak LPS mitogen-stimule pwopagasyon splenosit nan sourit yo vaksinen ak OVA ak WPCD (Figi 5) ak konsantrasyon nan pi bon nan WPCD te 100 ug / mL. Done sa yo te endike ke WPCD kòm yon adjuvant vaksen nan sourit vaksen OVA te kapab pi efikasman pwovoke aktivasyon nan selil T ak selil B pase Alum.

Tout adjuvant WCPD yo teste ki te fòme ak vaksen OVA te pwodwi iminite umoral ak selilè egalman fò (figi 4 ak 5). Sou baz done sa yo, pou plis evalye enfliyans WPCD sou repons selil OVA-espesifik T helper (Th), nou analize plis ekspresyon cytokine nan CD8 plis ak CD4 plis T selil pa Flow sitometri (Fig 6). Nan jou 21 apre premye vaksinasyon an, yo te izole yon sèl splenosit nan sourit ak Lè sa a, ko-kilti ak OVA a (10 ug / mL). Sede IL-4 nan selil CD4 plis T nan gwoup la ki te administre ak 100 ug OVA/WPCD te siyifikativman pi wo pase sa nan gwoup OVA/Alum ak gwoup OVA ak menm jan ak sa ki nan PMA (figi 6A). Anplis, IFN-sede nan CD8 plis ak CD4 plis T selil yo te tou siyifikativman amelyore nan sourit yo administre ak OVA / WPCD (20, 100, ak 400 ug) (Fig 6B ak 6C). Konpare ak adjuvant Alum, WPCD te montre yon pi bon kapasite pou pwovoke sekresyon IL-4 ak IFN- nan selil T yo.

WPCD ankouraje spirasyon DCs ak diminye frekans Treg nan vivo

DCS yo rekonèt kòm APC ki pi pisan ki enplike nan kòmanse repons iminitè prensipal yo. Kidonk, nan jou 3 apre premye vaksinasyon an, nou menm tou nou te envestige efè WPCD sou CD40 ak CD80 sou DCs nan larat nan sourit (figi 7A ak 7B). Sourit ki nan gwoup 100-ug OVA/WPCD yo te pwodui nivo CD40 ak CD80 siyifikativman pi wo pase sa ki nan gwoup OVA/Alum. Done sa yo te montre ke WPCD te kapab aktive DC ak pwovoke spirasyon DC nan sourit. Selil Treg yo ka balanse tolerans ak repons iminitè yo. Pou plis envestige ki jan WPCD modul repons iminitè a, selil Treg nan larat nan sourit yo te tache ak yon twous sourit regilasyon selil T tach. Nan jou 21 apre premye vaksinasyon an, yo te obsève yon frekans diminye nan CD25 plis Foxp3 plis selil Treg nan total CD4 plis selil T yo (figi 7C). Konpare ak gwoup OVA ak OVA/Alum, gwoup WPCD te montre yon frekans Treg siyifikativman redwi.

Evalyasyon sekirite WPCD nan sourit

Yo nan lòd yo estime toksisite egi oral la, nou te pote soti tès la toksisite egi. Sourit yo te administre oralman ak 5000 mg / kg pwa kò pa te montre okenn konpòtman nòmal oswa efè segondè epi yo pa te jwenn okenn mòtalite nan tès la toksisite evalyasyon. Pa gen okenn diferans enpòtan nan pran pwa kò, endèks Thymus, ak endèks larat yo te anrejistre nan mitan divès gwoup sourit yo administre ak diferan dòz WPCD epi yo pa te gen okenn diferans enpòtan (Tablo 1). Pa gen okenn mòtalite obsève apre 14 jou. Se poutèt sa, valè LD50 nan WPCD te plis pase 5000 mg pou chak kg pwa kò.

Pou teste si WPCD te gen efè negatif sou kwasans sourit yo, anvan ak apre vaksinasyon lar, yo te detèmine pwa kò a pou chak sourit (Tablo 2). Nan obsèvasyon ki vin apre sourit yo, efè segondè oswa konpòtman nòmal pa te obsève. Anplis de sa, pwa kò sourit yo administre ak WPCD ak sourit yo administre ak solisyon saline oswa OVA / Alum pa montre okenn diferans enpòtan. Rezilta obsèvasyon sa yo te montre administrasyon WPCD an sekirite.

Diskisyon

Adjuvant yo se eleman kle nan vaksen yo [31]. Akòz pwogrè yo nan jenomik ak pwoteomik, pi plis ak plis recombinants ak molekil vaksen sentetik yo idantifye. Se poutèt sa, plis adjuvant ak fòmilasyon yo mande yo. Gen kèk adjuvant ki pisan yo jeneralman ki gen rapò ak ogmante toksisite, pou egzanp, FCA. Se poutèt sa, li nesesè jwenn yon fòmilasyon ki an sekirite ki gen diferan konpozan sinèrji evantyèlman kondwi repons iminitè a vle. Polisakarid ki soti nan remèd fèy Chinwa yo pa toksik epi yo pa montre okenn efè segondè enpòtan [32,28]. Yon adjuvant ki an sekirite nesesè pou yon sèten vaksen.

Cistanche deserticola se yon zèb tonik enpòtan ak lajman egziste nan tè arid ak dezè cho nan nòdwès Lachin. Cistanche deserticola se lajman konsène akòz byoaktivite li yo ki gen ladan efè imunomodulatwa, antioksidatif, anti-bakteri, ak efè antitumoral [20,21]. Gen kèk pwogrè ki fèt nan karakterizasyon estriktirèl ak aktivite iminolojik Cistanche deserticola, ki se yon bon kandida pou devlope adjuvant. Nou eksperimantalman evalye efè adjuvant ak mekanis WPCD nan vitro ak nan vivo. Administrasyon anba lar nan WPCD siyifikativman ankouraje repons iminitè umoral ak selilè lè yo ogmante antikò serik ak pwopagasyon lenfosit, amelyore ekspresyon cytokines, moute-reglemante spirasyon DC a, ak desann-reglemante frekans CD4 plis CD25 plis Foxp3 plis Treg selil yo.

DCS yo se APC kle pou priming selil T nayif. Aktivasyon DCs enpòtan pou adjuvant. Yo souvan itilize DCS, espesyalman DC ki sòti nan mwèl murin, pou evalye adjuvant ak vaksen yo. Sitometri koule ka distenge selil yo ki te aktive apre yo fin kaptire yon antijèn nan selil ki antoure yo. Nan analiz FCM, degre nan agrégation nan selil stimulé se yon endikatè endirèk nan evalye sekirite nan imunomodulateur [3]. Kidonk, done aktivite adjuvant WPCD nan DCs in vitro ka bay bonjan enfòmasyon pou modèl bèt. Dapre modèl BM-DC, nivo ekspresyon MHC-II, CD86, CD80, ak CD40, pwodiksyon cytokine, ak pwopagasyon selil T allojenik yo te detekte nan pi gwo ranje konsantrasyon WPCD. Nivo ekspresyon MHC-II, CD86, CD80, ak CD40 yo te kontwole nan BM-DC yo ak pwodiksyon TNF-a ak IL-12 yo te ogmante nan yon fason ki depann de dòz la. Yo te obsève pwopagasyon selil T allojenik la. Mòfoloji BM-DC yo pa te chanje. Lè w pwovoke deklanchman BM-DCs ak sekresyon sitokin enflamatwa nan vitro, WPCD adjuvant ta ka ogmante kantite antijèn ak kantite APC yo epi ankouraje selil T yo sekrete IFN-, ki kontribye nan amelyorasyon nan aktivite imunomodulateur.

Plizyè polisakarid èrbeuz Chinwa yo kapab aktive sistèm iminitè a epi yo posede ekselan kapasite adjuvant atravè stimulation DCs spirasyon pa chemen TLR4 la [33,28]. Kidonk, nou sipoze ke TLR4 patisipe nan chemen siyal WPCD-induit DCs spirasyon. Kòm espere, tretman inhibiteur TLR4 te lakòz yon diminisyon enpòtan nan TNF-a ak IL-12. Anplis de sa, anpèchman nan chemen an TLR4 tou anpeche ekspresyon CD 40 ak CD80 sou DCs, ki endike ke spirasyon nan DCs te depann sou TLR4. Se poutèt sa, li evidan ke TLR4 patisipe nan spirasyon DCs WPCD-induit.

Dòz pi gwo adjuvant ak fòmilasyon vaksen yo detèmine anpirik nan anpil eksperyans. Yo nan lòd yo eksplore relasyon dòz-repons nan WPCD adjuvant ak antijèn OVA nan sourit, nou chwazi diferan dòz WPCD ki baze sou done deja rapòte nan BM-DCs in vitro pou administre sourit ICR de fwa. Nou te jwenn ke WPCD siyifikativman ogmante sede nan antikò OVA-espesifik ak pwovoke yon repons ekilibre Th1 / Th2immune ak yon amelyorasyon nan nivo IgG1 ak IgG2a. Espesyalman, nivo IgG2a a te pi wo pase sa yo trete ak Alum nan pi gwo dòz la. Se poutèt sa, WPCD te lakòz pi wo nivo antikò espesifik ak pi wo efikasite ak piki pi ba yo.

Nouvo vaksen mande pou endiksyon repons selilè fò, ki enplike antikò, selil T helper (Th) ak lenfosit T cytotoxic (CTL). Vaksen terapetik la gen pou objaktif pou pwovoke pi fò repons selil T yo. Adjuvant ideyal la amelyore puisans vaksen an epi li ankouraje iminite selilè san li pa lakòz efè toksik [34]. Pami obsèvasyon yo nan modèl sourit iminize, WPCD te mennen nan yon ogmantasyon nan pwopagasyon splenosit espesifik OVA-espesifik ak ki pa espesifik konpare ak Alum. Gen kèk adjuvant ki kontwole cytokines ak sistèm iminitè a. Pou egzanp, saponin ka estimile repons iminitè selilè nan yon antijèn ki nòmalman pwovoke antikò sèlman. Nou te chwazi IL-4 ak IFN- kòm endikatè pou evalye endirèkteman nivo iminite nan sourit yo. WPCD ka pwovoke plis sekresyon IL-4 ak IFN- pase Alum. Kidonk, yo te obsève gwo repons selilè T asistan yo ak sekresyon cytokine kòm rezilta vaksinasyon WPCD, sa ki sijere ke WPCD ta ka pi efikasman estimile lenfosit sekrete cytokine Th1-tip ak Th2-sitokin la pase. Alum.

Adjuvant ki enfliyanse prezantasyon antijèn ka afekte pwosesis iminitè konplèks. Selil Treg ka modile repons Th1 ak Th2 [35]. Yon dòz apwopriye nan WPCD ka ankouraje spirasyon DCs nan sourit atravè ogmante nivo ekspresyon CD80 ak CD40 ak anplifye kapasite prezantasyon antijèn OVA nan repons iminitè bonè. Rezilta eksperimantal deklanchman DCS ak frekans Treg te demontre ke WPCD pwovoke spirasyon DCs ak diminye frekans Treg nan larat nan sourit yo. Rezilta sa yo te pwouve ke WPCD amelyore efikasite vaksen OVA lè yo ogmante vize selil ki prezante antijèn yo epi fè pwomosyon deklanchman espesifik selil T yo.

Nan devlopman adjuvant, li difisil pou oaza pwovoke repons iminitè ki apwopriye a kont enfeksyon ki koresponn lan. Adjuvant apwopriye ta dwe gen efè segondè ki ba ak toksisite nan èt imen oswa bèt. Kidonk, yo ta dwe konsidere sekirite WPCD, ki gen ladan efè segondè imedya ak alontèm. Nan etid sa a, nou eksplore toksisite egi WPCD ak efè negatif WPCD sou pèfòmans kwasans sourit yo pou 110 jou. Rezilta yo nan toksisite egi nan WPCD te montre ke pwa kò, endèks timis, oswa endèks larat pa te gen okenn diferans enpòtan. Valè LD50 WPCD te plis pase 5000 mg pou chak kg pwa kò. Pandan tout obsèvasyon eksperimantal ki vin apre sourit yo, pa gen okenn efè segondè oswa konpòtman nòmal nan sourit yo te jwenn. Rezilta sa yo te endike ke WPCD te an sekirite.

An konklizyon, nan etid sa a, WPCD, yon polisakarid brit ekstrè nan C. deserticola soti nan Xinjiang, ekspoze kèk pwopriyete adjuvant. Pou egzanp, WPCD amelyore tou de repons Th1 ak Th2 pa aktive DCs, ogmante repons antikò, amelyore pwodiksyon sitokin. Anplis, nou te eksplore mekanis efikasite WPCD nan analize spirasyon DC ak fonksyon atravè chemen TLR4 an vitro. Nan sourit yo sèlman trete ak WPCD, pa gen okenn efè segondè evidan yo te obsève. Pakonsekan, WPCD te posede aktivite imunostimulatwa ki pi wo nan repons iminitè selilè ak umoral. Adjuvant yo se yon melanj de plizyè konpoze. Yon melanj de plizyè ekstrè brut ka gen pi gwo efè benefisye pase yon sèl ekstrè plant. Li nesesè sistematik eksplore ekstrè WPCD, teste efikasite ak sekirite yo, ak elicide mekanis efè yo.

Sipòte enfòmasyon

Dosye S1. Arive Lis Verifikasyon. (DOCX)

Rekonesans

Avèk mèsi espesyal Bing Wang ak Daocheng Wu pou bay bon lide nan eksperyans yo.

Kontribisyon otè

Konsepyalizasyon: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Done curation: Xiumei Yang, Yu Yang.Analiz fòmèl: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Akizisyon finansman: Ailian Zhang.Administrasyon pwojè: Ailian Zhang.

Resous: Ailian Zhang, Gan Zhao.Writing - orijinal bouyon: Ailian Zhang.

Ekri - revizyon & koreksyon: Ailian Zhang, Daocheng Wu.