In Silico Konsepsyon yon nouvo vaksen peptide polivalan milti-sous-inite k ap ogmante iminite kwa kont leishmanioz vissral ak kutane imen: yon apwòch ki baze sou iminoenfòmatik

Résumé

Kontèks Leishmaniasis se yon gwoup maladi enfektye vektè ki te koze pa plis pase 20 espès patojèn Leishmania ki andemik nan anpil peyi twopikal ak subtropikal. Aparisyon nan tansyon ki reziste dwòg, efè segondè negatif nan dwòg anti-Leishmania, ak absans la nan yon estrateji vaksinasyon prevantif menase popilasyon an sansib. Dènyèman, anpil gwoup chèchè te eksplwate domèn vaksenoloji inverse pou devlope vaksen, konsantre sitou sou pwovoke iminite kont swa leishmanioz visceral oswa kutane.

cistanche tubulosa - Anti-enflamatwa

MetòdTravay prezan sa a enplike nan rekipere douz sekans pwoteyin antijenik leishmanyal valide eksperimantal soti nan baz done UniProt, ki te swiv pa pwofil antijenisite yo anplwaye ANTIGENpro ak Vaxijen 2.0 serveurs. Epitop obligatwa MHC pou menm bagay la te prevwa lè l sèvi avèk tou de NetCTL 1.2 ak SYFPEITHI sèvè, pandan y ap epitop pou selil B yo te kalkile lè l sèvi avèk sèvè ABCpred ak BepiPred 2.0. Yo te itilize epitop tès depistaj yo ak nòt siyifikativman pi wo pou konsepsyon konstriksyon vaksen an ak linkers apwopriye ak adjuvant natirèl. Estrikti segondè ak siperyè nan peptide sentetik yo te detèmine pa jaden kondisyonèl o aza, rezo neral fon, ak aliyman pwofil pwofil fil ak simulation asanble estrikti iteratif, respektivman. 3-Modèl vaksen D la te valide atravè CASP10-rafineman teste ak sèvè wèb MolProbity la. Molekilè debakadè ak simulation analiz mòd nòmal milti-echèl yo te fè analize pi bon konplèks vaksen-TLR. Finalman, rezilta simulation iminitè enfòmatik te revele pwomèt repons iminitè selilè ak umoral, ki sijere ke peptide chimerik enjenieri a se yon potansyèl vaksen gwo spectre kont leishmanioz visceral ak kutane.

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

Mo kle Leishmanioz · Vaksinoloji inverse · TLR · Vaksen milti-epitop · Simulation dinamik molekilè · Modèl omoloji

Entwodiksyon

Leishmaniasis se yon gwoup maladi parazit ki te koze pa plizyè manm nan genus Leishmania, yon pwotozo parazit intraselilè dimòfik [1]. Leishmaniasis afekte pifò popilasyon ki soti nan sitiyasyon sosyo-ekonomik ki ba nan peyi twopikal ak subtropikal atravè lemond [2]. Li se yon maladi vektè, epi parazit yo transmèt lè yo mòde mouch sab flebotomin fi ki enfekte yo (WHO, 2019). Dapre dènye rapò Òganizasyon Mondyal Lasante, 700, 000 a 1 milyon nouvo ka ak kèk 26,000 a 65, 000 lanmò rive chak ane (WHO, 2019). Nan Afrik de Lès, epidemi leishmanioz visceral rive souvan. Rejyon Mediterane Lès la reprezante 70% nan ka leishmanioz kutane atravè lemond (WHO, 2019). Nan 2017, 20,792 sou 22,145 (94%) nouvo ka rapòte bay OMS te fèt nan sèt peyi: Brezil, peyi Letiopi, peyi Zend, Kenya, Somali, Sid Soudan, ak Soudan (WHO, 2017). Akoz senaryo alarmant, bann mezir pou kontrol e eradik sa maladi i devret osi ganny soulinyen dan nou pei. Leishmanioz gen yon varyete de manifestasyon klinik, e gen twa fòm prensipal maladi a - visceral (ki rele tou kala-azar ak fòm ki pi grav nan maladi a), kutane (pi komen an), ak mukokutane (WHO, 2019). . Prèv pwòp tèt ou geri nan kèk ka nan leishmanioz kutane (CL) ak iminite a ki lakòz re-enfeksyon dedui sijè ki abòde posib pou vaksinasyon an kòm yon metòd posib pou kontwole leishmanioz sou peryòd la [3]. Sepandan, jiskaprezan, pa gen okenn vaksen ki gen lisans ki disponib kont leishmanioz imen. Malgre ke kèk vaksen kandida potansyèl te avanse nan esè klinik, anpil yo toujou nan faz rechèch ak devlopman bonè [4]. Jenerasyon vaksen peptide yo se yon domèn rechèch ki prevalan ak pwomèt nan domèn sa a. Kontrèman ak tout parazit vivan oswa atenue oswa vaksen ki baze sou subunite yo, peptides sentetik gen plizyè avantaj ki gen ladan absans materyèl ki kapab danjere, pi ba konpleksite antijèn, bon estabilite, ak pri ki ba pou monte [1, 5]. Devlopman nouvo vaksen mande pou plis konesans sou iminoloji, byoloji molekilè, ak jeni chimik. Se poutèt sa, syantis atravè tout tèren sa yo travay men nan men yo konsepsyon ak pwodui vaksen ki san danje epi efikas [6]. Yon vaksen ideyal kont leishmanioz ta dwe pwovoke iminite ki dire lontan ak yon repons iminitè ekilibre TH-1 ak TH-2-medyatè [4, 7]. Apwòch ki baze sou iminoenfòmatik pou desine yon nouvo vaksen kandida konsa se yon nouvo estrateji ki prensipalman anplwaye zouti enfòmatik pou predi yon vaksen peptide milti-sous-inite estriktirèl ki estab ak imunojèn nan yon ti tan. Pwoteyin ki te jwenn prensipalman gen karakteristik iminojenik nesesè pou konfere iminite kont maladi a nan syans imunolojik anvan ki enplike modèl bèt eksperimantal oswa lòt analiz nan silico yo te pi bon kandida epitop posib [1, 8-10]. Pami pwoteyin yo anba envestigasyon, pwoteyin LACK (Leishmania-aktive C-kinase antigen) se yon pwoteyin trè konsève atravè espès Leishmania, epi li konsidere kòm yon kandida vaksen solid kont leishmanioz imen [11]. Li te pwouve yo dwe yon sib kle nan repons iminitè nan sourit BAL b / c sansib [12]. KMP-11 (pwoteyin manbràn kinetoplastid-11) prezan nan tout pwotozo kinetoplastid epi yo konsidere tou kòm yon kandida potansyèl pou vaksen ki montre yo ogmante nivo IL-10 nan modèl murin, sa ki endike potansyèl iminojenik li yo. [13]. Leishmanolysin, oswa GP63, se yon proteinaz sifas ki te postule kòm yon faktè virulans ki enplike nan entèraksyon dirèk parazit la ak reseptè macrophage lame a [14]. Pwoteyin manbràn LCR1 ak GP46 yo jwenn tou ogmante pwodiksyon IFN-gamma, e pakonsekan, yo konsidere kòm itil nan devlope yon vaksen jeneral kont enfeksyon Leishmania [5, 15]. Pwoteyin chòk chalè (HSPs) yo se molekil trè konsève ki trè iminojenik pou pwovoke tou de chemen MHC-I ak MHCII nan iminite adaptasyon epi yo panse yo gen yon wòl enpòtan nan devlopman vaksen kont leishmanioz enfektye [16]. Leishmania idrofil acylated sifas pwoteyin-B (HASP-B) eksprime sèlman nan parazit enfektye sijere yon wòl nan virulans parazit ak, Se poutèt sa, yon kandida potansyèl vaksen [17]. Pwoteyin kinetoplastid baton parafagellar (PFR) yo tou gen enpòtans terapetik ak pwofilaktik akòz distribisyon evolisyonè restriksyon yo, òganizasyon wo-lòd, ak gwo iminojenisite [18]. Menm jan an tou, cysteine ​​proteases ak proteophosphoglycans tou aji kòm faktè virulans esansyèl pou parazit yo nan lame mamifè yo epi yo se sib dwòg atire pou leishmanioz [19-21]. Anplis de sa, pwoteyin beta-tubulin te deja karakterize kòm yon antijèn T cell-stimulating soti nan Leishmania, byenke efikasite li kòm yon kandida vaksen pa te eseye ankò [22]. Beta-tubulin nan L. donovani konsidere tou kòm yon sib potansyèl dwòg kont leishmanioz visceral [23]. Anfen, yo te montre pwoteyin faktè tradiksyon eIF5A ki soti nan L. braziliensis pwovoke pwoteksyon eterològ kont leishmaniasis nan bèt lè yo administre kòm yon vaksen an konbinezon ak yon lòt pwoteyin recombinant. Li ogmante sekresyon citokin espesifik parazit nan bèt ki pran vaksen an. Pwoteyin eIF5A tou konsève nan tout ekaryot [24]. Byen bonè, Khatoon et al. dekri yon apwòch imunoenfòmatik ki baze sou konsepsyon yon vaksen peptide milti-subunit kont leishmanioz visceral (VL) nan eksplore pwoteyin yo sekretè nan L. donovani [6]. Isit la, nou te chwazi plizyè antijèn leishmanial atravè divès espès enfektye parazit la. An menm tan an, tout pwoteyin sa yo te deja idantifye (swa pa etid in vitro sou bèt oswa pa itilize zouti enfòmatik) pou ankouraje yon repons iminitè, pwovoke iminite pwoteksyon. Sekans pwoteyin chwazi yo te fè pati nenpòt nan senk espès patojèn Leishmania, sètadi, Leishmania pi gwo, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi, ak Leishmania amazon, pami ki L. donovani se parazit prensipal ki lakòz leishmaniasis (VL), pandan y ap. lòt moun yo prensipalman responsab pou lakòz leishmanioz kutaneous (CL) oswa mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Rezon ki te dèyè chwa divès kalite pwoteyin konsève ak iminojenik nan diferan espès Leishmania se te konsepsyon yon vaksen peptide jeneral ki ta bay yon iminite kwaze laj spectre kont tou de fòm leishmanioz (VL ak CL) ki souvan afekte moun. .

Kisa zèb cistanche fè—Anti-enflamatwa

Materyèl ak metòd

Seleksyon ak rekipere sekans pwoteyin antijenik Leishmania

Sekans konplè asid amine douz pwoteyin antijenik espesifik Leishmania yo te rekipere nan baz done Uniprot (Universal Protein Resource) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) nan fòma FASTA (aksede sou 21.{{16} }3.2022). Jan sa di pi bonè, tout pwoteyin sa yo te rapòte kòm kandida vaksen imunojèn, trè konsève, ak potansyèl, jan yo te jwenn nan etid iminolojik anvan yo ki enplike modèl bèt oswa metòd enfòmatik nan prediksyon silico. Antigenisite nan pwoteyin yo chwazi yo te kalkile pa anplwaye sèvè a ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) ki kalkile antigenisite nan yon sekans pwoteyin opinyon pa eksplwate yon klasifikasyon de etap ki baze sou SVM valide pa diz fwa. apwòch kwa-validasyon [25]. Lè sa a, pwoteyin yo te sibi analiz peptide siyal lè l sèvi avèk SignalP 4.1 sèvè (SignalP-4.1- Services-DTU Health Tech) yo nan lòd yo fè diskriminasyon ant sekretè klasik ak ki pa sekretè (transmembrane) pwoteyin. Metòd sa a enkòpore yon prediksyon nan sit klivaj ak yon peptide siyal / peptide ki pa siyal prediksyon ki baze sou yon konbinezon de plizyè rezo neral atifisyèl [26]. Prediksyon lokalizasyon pou tout pwoteyin yo te fèt apre lè l sèvi avèk DeepLoc (DeepLoc—1.0—Services—DTU Health Tech), yon algorithm san modèl ki itilize rezo neral gwo twou san fon pou predi lokalizasyon subselilè pwoteyin eksplwate sèlman enfòmasyon sekans, reyalize bon presizyon [27]. Tout sekans pwoteyin fonksyonèl, jan yo jwenn nan sèvè SignalP 4.1 la, yo te sibi prevwa prezans detèminan antijenik (epitop) ke reseptè selil B ak T yo pral rekonèt. Sa a te fè asire ke konstriksyon vaksen ki fèt la gen sèlman imino-dominan selil T ak epitop selil B epi, kidonk, yo ta kapab kondwi yon repons iminitè efikas ki enplike tou de chemen umoral ak selil mekanis mekanis iminitè.

Sitotoksik T lenfosit (CTL) epitop prediksyon

Prediksyon nan epitop lenfosit T sitotoksik (CTL) se yon aspè esansyèl nan konsepsyon yon peptide ideyal [28]. Yo te itilize yon sèvè entènèt aksesib lib, sètadi NetCTL1.2 (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL), pou predi epitop CTL yo pou tout pwoteyin yo chwazi yo. Metòd la entegre prediksyon nan peptide MHC klas I obligatwa, proteasomal C klivaj tèminal, ak efikasite transpò TAP [29], tout nan yo ki se karakteristik esansyèl ke yon sekans nan CTL-obligatwa epitop ta dwe posede. Sèvè a pèmèt pou prediksyon nan epitop CTL ki gen restriksyon sou 12 MHC klas I supertypes, pami ki sèlman sipètip A1 te itilize pou etid la prezan. MHC klas I obligatwa ak klivaj proteasomal yo fèt lè l sèvi avèk rezo neral atifisyèl. Yo prevwa efikasite transpò TAP lè l sèvi avèk yon matris pwa [29]. Sekans ki gen pi gwo nòt obligatwa yo konsidere kòm epitop CTL ki pisan. Anplis NetCTL 1.2, yon lòt apwòch ki baze sou sèvè entènèt ki disponib piblikman, sètadi, SYFPEITHI (http://www. syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), te tou pwofite pou prediksyon epitop CTL soti nan. tout pwoteyin Leishmania yo chwazi. Pwevwa a baze sou motif pibliye epi li konsidere asid amine yo nan pozisyon jete lank ak oksilyè ak lòt asid amine souvan [30]. Nan lis kalite MHC yo bay nan sèvè sa a, yo te chwazi HLA-A*01, HLA-A*02:01, ak HLA-A*03 pou prediksyon an. Yo te espesifye rechèch epitop la pou sekans nonamer pou konparezon inifòm ak rezilta yo bay nan sèvè NetCTL 1.2 la. Se sèlman epitop komen ki soti nan chak pwoteyin (si genyen), ki te prevwa pa tou de NetCTL 1.2 ak SYFPEITHI serveurs ak pi gwo nòt konpatib, yo te chwazi pou konstriksyon vaksen final la.

Helper T lenfosit (HTL) epitop prediksyon

Lenfosit T Helper yo se selil iminitè ki pi enpòtan yo paske yo mande yo nan tout kalite repons iminitè adaptatif yo. Prediksyon epitop HTL (sitou nan kalite Th-1), kidonk, vin tounen yon eleman esansyèl pou desine yon vaksen peptide efikas. Nan etid aktyèl la, zouti analiz MHC-IIbinding nan sèvè IEDB (Immuno Epitope Datan baz and Analysis) (http://tools.iedb.org/mhcii/) te anplwaye pou prediksyon 15-mer HTL. epitop pou yon seri twa alèl imen, sètadi, HLA-DRB1 * 01:01, HLADRB1 * 01:02, ak HLA-DRB1 * 01:03. Alèl HLA imen yo te chwazi pou estimasyon pi reyalis nan afinite MHC-IIbinding epitop yo kòm vaksen an te fèt kont leishmanioz imen. Pwodiksyon an prevwa bay nan inite IC50nM pou bibliyotèk la konbinezon ak aliyman SMM. Se poutèt sa, yon nimewo ki pi ba endike pi wo afinite. IEDB rekòmande metòd prediksyon yo te itilize nan apwòch sa a nan ki ba ajisteman ran se indicative de lyan MHC-II apwopriye epi, kidonk, yo ka defini kòm epitop HTL ki pisan.

Idantifikasyon ak seleksyon epitop HT ki pwovoke sitokin

Sitokin yo gen anpil enpòtans pou fonksyone apwopriye nan sistèm iminitè a. Yon batri cytokin tankou IL-2, IL-4, IL-6, ak entèferon- kapab pwovoke tou de CTL-medyatè ak repons iminitè umoral [31]. Pakonsekan, epitop HTL yo ki ka deklanche pwodiksyon sitokin yo pi bon pou desine yon vaksen iminitè-profilaktik. Avèk opinyon sa a, yo te itilize sèvè IFNepitope a (http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/) pou idantifikasyon epitop HTL ki gen kapasite cytokine-inducing. IFNepitope se yon sèvè prediksyon sou entènèt ki vize pou predi peptides ki soti nan sekans pwoteyin ki ka pwovoke IFN-gama ki soti nan selil T CD4+ yo. Sèvè entènèt la te devlope sou baz yon seri done ki gen ladan lyan IFN-gamma-inducing ak ki pa-inducing MHC klas II lyan [32]. Epitopes HTL yo te prevwa pa sèvè IEDB a ak pi gwo afinite MHC-II-obligatwa (pi ba ranje ajiste) yo te bay kòm opinyon yo tcheke pou kapasite cytokine-pwodwi pa sèvè a IFNepitope. Epitop yo te idantifye konsa yo te sibi pwochen nivo analiz pa sèvè IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in) epi tou pa sèvè IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3). .php) yo nan lòd yo asire ke epitop HTL yo chwazi yo ta byen evoke sekresyon IL-4 ak IL{-10, respektivman. Yo konsidere tou konsèvasyon pozisyon nan rezidi asid amine ak konpozisyon asid amine nan. peptides pou prediksyon pi egzak [33, 34] Epitops HTL ki gen MHC-II-obligatwa yo te prevwa ke yo te pozitif pa tout twa sèvè yo te chwazi pou enkòporasyon nan konstriksyon vaksen final la. Yo te adopte estrateji sa a pou amelyore efikasite vaksen an paske li te kapab ankouraje. yon repons entans ki enplike yon gran varyete sitokin (IFN-gamma, IL-4, ak IL-10), ki mennen nan iminite akselere ak ki dire lontan.

Analiz konsèvasyon epitop

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (default).

Konsepsyon sekans vaksen milti-epitop

Dapre analiz iminoenfòmatik la, yo te konstwi yon sekans prensipal vaksen sou-inite a lè yo enkòpore sekans epitop CTL ak HTL yo chwazi yo. Epitop sa yo te lye ansanm pa linkers AAY ak GPGPG, respektivman [28, 31]. Linkers yo mete pou separasyon apwopriye nan epitop endividyèl yo ki nesesè pou fonksyone efikas nan konstriksyon vaksen an [28, 36]. Dezyèmman, ajoute yon adjuvant apwopriye enpòtan anpil nan yon vaksen sou-inite pou ranfòse repons iminitè a [31]. Chwa a nan yon adjuvant apwopriye se kadinal nan konsepsyon vaksen pou esè imen. IL-12 ki pwodui pa divès selil iminitè se esansyèl nan devlope iminite selil kont leishmanioz, e potansyèl IL-12 kòm yon adjuvant nan vaksen kont leishmanioz yo te rapòte nan modèl murin [3, 37, 38]. IL-12 sa a te chwazi kòm yon adjuvant pou konsepsyon vaksen an, epi sekans sa a te enkli nan tèminal N nan konstriksyon vaksen an lè l sèvi avèk linker EAAK la [28, 31]. Yo te rekipere sekans IL-12 alfa imen an nan baz done Uniprot (www.uniprot.org; Nimewo Asesyon P29459). Finalman, yo te jwenn konstriksyon vaksen peptide a ki gen adjuvant, linker, epitop CTL, ak epitop HTL (avèk entra-epitopik AAY ak linkers GPGPG) nan yon sekans k ap deplase soti nan tèminal N a tèminal C.

Prediksyon epitop selil B konformasyon ak lineyè

Iminite umoral enplike nan sentèz la ak sekresyon nan antikò espesifik pa aktive selil B, ki mande pou prezans nan detèminan antijenik ke yo rekonèt pa reseptè selil B ki prezan sou sifas lenfosit B yo. Yon vaksen peptide iminitè-pwoteksyon ideyal ta dwe gen konpozan sa yo nan lòd yo kominike ak, epi, kidonk, estimile selil B yo. Se poutèt sa, de sèvè, sètadi, ABCpred ak BepiPred 2.0, yo te aplike pou prediksyon egzak epitop selil B nan sekans prensipal vaksen ki fèt la. Sèvè ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html) se yon apwòch ki baze sou rezo neral atifisyèl (ANN) ki predi epitop selil B nan yon sekans antijèn bay lè l sèvi avèk paramèt longè fiks yo. Dataset fòmasyon yo itilize nan metòd sa a gen epitop selil B ki soti nan baz done epitop selil B (BCIPEP). Sèvè a kapab predi epitop ak 65.93% presizyon lè l sèvi avèk yon rezo neral frekan [39]. Yo te bay sekans prensipal la nan konstriksyon final vaksen an kòm opinyon an nan yon fòma klè, epi yo te itilize paramèt default sèvè ABCpred, ki gen ladan yon valè papòt 0.51 ak yon longè fenèt 16 résidus asid amine, prediksyon an. Sèvè BepiPred 2.0 (BepiPred—2.0—Services—DTU Health Tech), nan lòt men an, predi epitop selil B sekans ki soti nan yon sekans opinyon pa yon algorithm forè o aza ki fòme sou epitop ak asid amine ki pa epitop yo detèmine nan estrikti kristal ki te swiv pa yon atenuasyon prediksyon sekans [40]. Yo te bay sekans prensipal vaksen an nan fòma FASTA kòm opinyon an. Aplikasyon de sèvè diferan ki predi epitop selil B ki baze sou de algoritm diferan fè prediksyon an pi reyalis. Pifò nan detèminan antijenik yo rekonèt pa reseptè selil B yo ak antikò yo se discontinuous, sa vle di yo gen résidus asid amine ki sitiye byen lwen nan estrikti prensipal la nan imunojèn nan men yo pote adjasan youn ak lòt pandan plisman an nan pwoteyin [41]. Yo te fè prediksyon sou epitop selil B discontinuous sa yo nan estrikti siperyè vaksen an valide lè yo itilize sèvè ElliPro (http://tools.iedb.org/ellip ro/) ki enkòpore nan pòtal IEDB la. ElliPro se yon zouti entènèt aksesib gratis ki aplike metòd Thronton modifye epi ki pran an kont sant mas chak rezidi olye ke atòm C yo. Lè w fè sa, chak nan epitop yo gen rapò ak yon nòt asiyen defini kòm PI (endèks pwotrusion) mwayèn sou rezidi epitop yo. Yo detèmine epitop ki pa kontinyèl yo baze sou valè PI respektif yo epi yo gwoupe yo dapre distans ant sant mas rezidi yo (R). Pi gwo valè R yo gen rapò ak epitop ki pi enpòtan yo prevwa [42]. An menm tan an, epitop lineyè selil B nan modèl pwoteyin opinyon yo kapab tou prevwa ak vizyalize lè l sèvi avèk ElliPro. Deteksyon epitop selil B lineyè ak discontinuous nan modèl 3D rafine vaksen an asire yon estrateji vaksen ki gen siksè.

Profilage nan antijenisite, alèjisite, ak toksisite nan konstriksyon vaksen an

Antijenisite se yon kritè esansyèl pou yon vaksen iminitè-profilaktik. Pou asire ke konstriksyon vaksen ki fèt la ta pwovoke yon repons iminitè ki dire lontan lè li kominike avèk reseptè selil B ak T yo, yo te evalye antigenisite menm bagay la lè yo itilize sèvè ANTIGENpro ak VaxiJen 2.0. Sèvè ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci. edu/) kòrèkteman klase 82% nan antijèn pwoteksyon li te ye lè yo fòme lè l sèvi avèk sèlman ansèm done mikwo-array pwoteyin yo. Presizyon an nan done konbine yo estime a 76% pa eksperyans diz fwa kwa-validasyon ki pèmèt siyifikativman pi bon rekonesans nan peptides antijenik. Li kouri sou yon achitekti de etap, ki gen ladan yon klasifikasyon dezyèm etap ki baze sou SVM. Pou yon nouvo sekans pwoteyin antre, pwobabilite ki kalkile pa prediktè SVM dezyèm etap la se nòt final prediksyon ANTIGENpro [25]. VaxiJen2.0 (http://www. dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) se yon lòt sèvè entènèt aksesib piblikman ki evalye antijenisite yon sekans pwoteyin pa yon apwòch aliyman ki baze sou sou transfòmasyon oto kwa-covariance (ACC) nan sekans pwoteyin nan vektè inifòm nan pwopriyete prensipal asid amine ak pèmèt klasifikasyon antijèn sèlman ki baze sou divès kalite pwopriyete fizikochimik nan pwoteyin nan san yo pa refere a aliyman sekans [43]. Dezyèmman, yo nan lòd yo eskli nenpòt posibilite ke konstriksyon vaksen an ka deklanche yon repons alèjik nan yon moun, yo te itilize sèvè AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) pou detèmine alèjisite li yo. Zouti sèvè a bay yon varyete de apwòch, ki gen ladan kat epitop IgE, motif MEME/MAST, metòd SVM ki baze sou konpozisyon dipeptide, ak BLAST ARP, yo tout eksplwate pou yon prediksyon egzat. Yo te fikse papòt la nan 0.4 (default) pou pi wo presizyon prediksyon. Anplis de sa, yo te aplike tou AllerTop v.2.{{20}} (https://www. dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), yon zouti ki baze sou sèvè entènèt aksesib gratis. pou konfime nati ki pa alèjik nan konstriksyon vaksen an. Metòd sa a baze sou transfòmasyon auto-covariance (ACC) nan sekans pwoteyin nan vektè inifòm egal-longè. Li te aplike nan syans quantitative estrikti-aktivite relasyon (QSAR) nan peptides ak longè diferan, ak pwoteyin yo klase pa algorithm k-nearest vwazen an [44]. Toksisite, si genyen, te prevwa lè w itilize sèvè ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). Zouti prediksyon sa a travay ki baze sou tou de teknik aprantisaj machin ak metòd quantitative ki resevwa fòmasyon sou yon seri done divès peptides toksik ak ki pa toksik yo jwenn nan SwissProt ak TrEMBL [45]. Profilage toksisite enpòtan anpil pou evalye sekirite vaksen an ak lòt peptides imunoterapi sa yo ki fèt pou yon esè imen. Analiz la te fèt lè w chwazi SVM (TrEMBL) + apwòch ki baze sou motif nan yon papòt valè E nan 10.0 pou metòd la ki baze sou motif ak yon papòt SVM nan 0.1.

Evalyasyon pwopriyete fizikochimik

Dekri karakteristik fizik ak chimik yon peptide chimerik vin vital paske, lè yo administre kòm yon vaksen, li ta dwe kapab pwovoke yon repons iminitè apwopriye. Sèvè ProtParam ki disponib ak pòtal ExPASY (Expert Protein Analysis System) (https://web.expasy.org/ program/) te itilize pou kalkile divès paramèt fizikochimik nan konstriksyon prensipal vaksen an ki gen ladan karakteristik tankou pwa molekilè, pI teyorik, endèks enstabilite, endèks alifatik, in vivo ak in vitro mwatye lavi, gwo mwayèn hydrophobicity (GRAVY), ak lòt moun.

Prediksyon estrikti segondè nan peptide vaksen an

Eleman estriktirèl segondè nan konstriksyon vaksen ki fèt yo te prevwa lè w aplike sèvè PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) ak sèvè pwopriyete RaptorX (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/). predi /) tou de nan yo se gratis aksesib sou entènèt serveurs analiz estrikti pwoteyin. Yo te bay sekans prensipal peptide vaksen an kòm opinyon an. PSIPRED predi estrikti segondè nan sekans pwoteyin antre nan eksplwate de rezo neral feed-forward ki fonksyone ki baze sou pozisyon-espesifik matris nòt (PSSM) ki te pwodwi pa PSI-BLAST [46]. Li enkòpore idantifikasyon sekans ki omològ ak konstriksyon vaksen nou an pa PSI-BLAST, ki te swiv pa jenerasyon PSSM. PSIPRED 3.2 ak vèsyon pi wo yo te jwenn yon nòt mwayèn Q3 nan 81.6% jan yo evalye pa yon metòd sevè twa fwa kwa-validasyon ki fè apwòch sa a siyifikativman presi ak egzat. Sèvè entènèt pwopriyete RaptorX angaje yon teknik aprantisaj machin ki trè resan yo rele DeepCNF (champ neral konvolisyon pwofon) pou predi plizyè karakteristik tankou estrikti segondè, aksè sòlvan, ak rejyon dezòdone ansanm. DeepCNF se yon apwòch entegre ki konbine tou de chan kondisyonèl o aza (CRF) ak rezo neral ki pa fon ki modèl relasyon sekans-estrikti konplèks pa yon achitekti pwofon yerarchize epi li ka jwenn apeprè 84% Q3 presizyon pou yon estrikti segondè klas 3-[47] .

Prediksyon estrikti siperyè

Te prevwa estrikti siperyè peptide vaksen final la lè w sèvi ak sèvè entènèt sou entènèt I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER se yon apwòch modèl estrikti pwoteyin yerarchize ki baze sou aliyman wofil-pwofil (PPA) ak simulation asanble estrikti iteratif ki te swiv pa rafineman estrikti nan nivo atomik. Li travay nan twa etap: idantifikasyon modèl estriktirèl, asanble estrikti iteratif, ak anotasyon fonksyon ki baze sou estrikti. Modèl estrikti ki pi wo yo ak estimasyon presizyon mondyal ak lokal yo retounen ak nòt C yo ak nòt TM reprezantan yo, ki gen rapò ak kalite modèl prevwa a. Pwogram I-TASSER reprezante youn nan metòd ki gen plis siksè demontre nan CASP pou prediksyon otomatik estrikti pwoteyin ak fonksyon [48, 49].

Rafineman estrikti siperyè vaksen an

Modélisation enfòmatik konvansyonèl nan yon estrikti pwoteyin pou kont li pa garanti otantisite ak presizyon nan modèl la prevwa paske estrateji modèl sa yo depann lajman sou degre nan probabilité nan opinyon an (sib) ak estrikti modèl ki disponib yo. Amelyorasyon nan bon jan kalite a nan modèl la ki baze sou modèl pi lwen pase presizyon an te, Se poutèt sa, te panse yo dwe nesesè, e sa ta ka reyalize pa raffinage estrikti nan pwoteyin antye. Avèk pèspektiv sa a, pwodiksyon modèl tridimansyon an soti nan sèvè I-TASSER ak pi bon nòt C a te sibi plis rafineman pa sèvè GalaxyRefne la (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} AFINE). Li se yon apwòch revizyon CASP10-teste nan ki chèn bò pwoteyin yo rebati an premye, ak Lè sa a, reanbalaj chèn bò ak detant estrikti an jeneral fèt pa simulation dinamik molekilè. Sa a mennen nan amelyorasyon egzak nan tou de estrikti lokal ak mondyal siperyè nan pwoteyin sib [50].

benefis sipleman cistanche—Anti-enflamatwa

Validasyon estrikti siperyè vaksen an

Estrikti siperyè vaksen an te bezwen valide pou idantifye erè potansyèl ki ta ka rive nan modèl 3D yo prevwa a. Yo te bay modèl rafine ki te jwenn nan sèvè GalaxyRefne la kòm estrikti opinyon nan fòma a.pdb. Anplis de sa, konplo Ramachandran a se yon lòt apwòch trè itil pou vizyalize rejyon enèji ki pèmèt ak entèdi nan ang diedral phi (ϕ) ak psi (ψ) nan chenn bò asid amine yo ki konsidere kòm eleman enpòtan pou validation yon estrikti pwoteyin. Pakonsekan, sèvè MolProbity la [Main page—MolProbity (duke.edu)] te anplwaye ki jenere yon konplo Ramachandran pou modèl vaksen an bay ki baze sou validasyon Phenix style MolProbity ki baze sou Python [51]. Nou te itilize plis ankò sèvè ERRAT [SAVESv6.0—Structure Validation Server (UCLA. edu)] ki analize estatistik entèraksyon ki pa lyezon ant diferan atòm nan modèl la epi ki trase valè fonksyon erè a kont yon {{ 6}}residu glisman [52]. Sèvè entènèt ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), yon platfòm entèaktif ki baze sou entènèt ki baze sou pwogram estanda ProSA, te itilize pou objektif sa a [53]. Etap sa a te fèt pou jwenn yon validation plis sofistike ak presi nan estrikti modèl la.

Jeni disulfid nan peptide vaksen an

Lyezon disulfid kontribye nan estabilite pwoteyin nan bese entropi konformasyon an epi tou lè yo ogmante enèji gratis nan eta a denatire. Entwodiksyon de lyezon disulfid roman yo te konsidere kòm yon zouti biotechnologique kritik amelyore thermostabilité nan pwoteyin natif natal, ki plwaye. Disulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12 sèvè te itilize pou amelyore estabilite estriktirèl an jeneral nan vaksen ki fèt la pa entwodwi lyen disulfide. Metòd sa a itilize jeyometri natif natal epi kalkile yon valè enèji pou chak disulfid potansyèl, kidonk bay yon mwayen pou klase lyezon disulfid kandida yo. Lyezon disulfid ki bay estabilite maksimòm yo te kandida ki gen gwo valè chi3, enèji lyezon, ak faktè B [54]. Rejyon fleksib nan peptide a te chwazi ki baze sou paramèt yo mansyone pi bonè, ak korespondan estabilize mitasyon yo te kreye pa fòme lyen disulfide ant résidus yo chwazi pè.

Docking molekilè nan konstriksyon vaksen ak reseptè iminitè (Human TLRs-2, 4, 5, 8, ak sourit TLR-9)

Reseptè Toll-like (TLR) se gwo atribi repons iminitè selilè ki rekonèt modèl molekilè ki asosye ak patojèn (PAMP) epi ki evoke repons iminitè natirèl kont enfeksyon. Aktivasyon dirèk TLR-2 ak konpozan Leishmania yo te rapòte imedyatman [55]. Nan lòt etid eksperimantal ki gen rapò, mank TLR-4 te lakòz ogmante kwasans parazit ak reta gerizon nan blesi kutane ki te koze pa L. gwo enfeksyon ki endike wòl plauzib TLR-4 nan pwovoke iminite kont Leishmania [56 ]. Nan lòt men an, TLR-2, 4, ak 9 yo te jwenn yo patisipe nan yon spectre imunopatolojik nan CL ki te koze pa L. braziliensis ak L. amazonensis [57]. TLR-9 te evalye tou kòm yon jwè kle nan aktivasyon selil dendritik nan patojèn VL nan imen [58]. Gen kèk nan eleman ki sòti nan Leishmania yo aktive TLR-2, 4, ak 9 nan majorite etid ki fèt nan domèn sa a. Obsèvasyon sa yo mete aksan sou lefèt ke plizyè TLR yo patisipe nan deklanche iminite pwoteksyon kont Leishmania. Se poutèt sa, yo te konsidere yon entèraksyon ant TLR yo ak konstriksyon vaksen ki fèt yo te konsidere kòm nesesè pou pwovoke iminite efikas kont enfeksyon Leishmania. Sa a te tcheke lè w fè anbache molekilè nan peptide vaksen milti-epitopik la ak TLR imen-2, 4, 5, 8, ak sourit TLR-9 lè l sèvi avèk sèvè PatchDock [PatchDock Server (tau.ac.il). )]. Algorithm PatchDock a gen twa etap prensipal, sètadi, reprezantasyon fòm molekilè, matche sifas patch, ak filtraj ak nòt. Li se yon jeyometri ki baze sou algorithm molekilè debakadè ki prensipalman opere sou konplemantasyon fòm molekilè ant reseptè a ak ligand la. Plak konplemantè yo matche, epi transfòmasyon kandida yo pwodwi. Yo klase chak transfòmasyon sa yo plis lè yo bay yon fonksyon nòt ki konsidere tou de enèji atomik desolvasyon ak ft jewometrik [59, 60]. Nan etid nou an, imen TLR-2 (PDB id: 6NIG), TLR-4 (PDB id: 4G8A), TLR-5 (PDB id: 3J0A), ak TLR-8 (PDB id: 4QC0), ak sourit TLR-9 (PDB id: 3WPF) yo te chwazi kòm reseptè, epi yo te rekipere dosye PDB separe yo nan Pwoteyin DataBank (www. .rcsb.org). Modèl 3D rafine nan peptide vaksen an te itilize kòm ligand pou tout simulation debakadè yo. Sèvè PatchDock la te mete nan paramèt default (clustering RMSD: 4.0). Nou analize pi bon modèl debakadè a lè l sèvi avèk sèvè Cluspro ki baze sou yon algorithm wotasyon lyezon posib, epi yo te evalye lyezon yo lè l sèvi avèk lojisyèl PyMOL [61].

Optimize Kodon, prediksyon estrikti mRNA, ak klonaj in silico pou ekspresyon pwoteyin vaksen an

Optimizasyon kodon an oblije reyalize maksimòm ekspresyon jèn etranje nan òganis lame a lè itilizasyon yon kodon pa lame a diferan anpil de sa ki lame natif natal la te elimine sekans orijinal yo pou konstriksyon final vaksen an. JCat (Java Codon Adaptation Tool), ki disponib piblikman nan (http://www.jcat.de/), te itilize pou tradiksyon ranvèse ak optimize kodon lè yo bay yon sekans prensipal nan konstriksyon final vaksen an kòm opinyon an. Itilizasyon kodon an te optimize nan òganis prokaryotik ki pi sekans, E. coli K12 [6]. Twa opsyon adisyonèl bay zouti a te chwazi pou fè pou evite terminateur transcription rho-endepandan, sit prokaryotic ribosome-obligatwa, ak sit klivaj restriksyon vle. Endèks adaptasyon kodon (CAI) ak kontni GC, jan zouti JCat kalkile a, endike kouman optimize a te bon. Pi bon optimize asire pi wo ekspresyon nan pwoteyin vaksen an. Anplis de sa, sit restriksyon pou anzim XhoI ak NdeI yo te enkòpore nan sekans cDNA optimize zouti JCat bay pou fasilite klonaj. Lè sa a, yo te mete sekans modifye a (ak sit restriksyon) nan vektè plasmid E. coli pET 28-a(+) lè l sèvi avèk modil klonaj restriksyon zouti SnapGene [6, 31, 62, 63]. Lojisyèl SnapGene disponib sou entènèt la nan (https://www.snapgene.com/). Anplis, nou te itilize tou sèvè entènèt mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) pou prediksyon estrikti segondè mRNA kode pa jèn yo nan peptide chimerik la. Yo te bay sekans optimize tradui ranvèse ki te jwenn nan zouti JCat la kòm opinyon. Pwogram mfold la baze sou yon algorithm debaz ki predi minimòm enèji gratis, ∆ G, ak minimòm enèji gratis pou pliye ki gen nenpòt pè baz patikilye. Yo aplike plizyè kontrent plisman pou prediksyon egzat enèji plisman yo. Enèji plisman pou RNA plisman fikse nan 37 degre, pandan y ap kondisyon iyonik yo fiks nan [Na+]=1 M ak [Mg++]=0 [64].

Simulation iminitè ki baze sou C-immsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index. php?page=1) se yon zouti prediksyon repons iminitè ki baze sou sèvè ki itilize klas ki baze sou ajan, epi prediksyon li depann sou rezo neral. Li ka predi tou de repons iminitè umoral ak selil-medyatè. C-immsim itilize modèl Celda Seiden, modèl lasi poliklonal bit-string, ak endèks Simpson pou karakterize prediksyon selil aktif, repo, ak memwa ak lonjevite yo. Li ede predi pwofil cytokine nan yon reyaksyon bay yo evalye repons enflamatwa [65].

Cistanche ekstrè poud

Simulation dinamik molekilè

Simulation dinamik molekilè a te fèt pou evalye estabilite pi bon konplèks nou an, sa vle di, TLR, ak vaksen yo pwopoze a lè l sèvi avèk iMOD (iMod Server paj lakay (csic.es) sèvè. Sèvè ki baze sou entènèt sa a sèvi ak amelyore analiz mòd nòmal (NMA) Pou karakterizasyon divès pwopriyete dinamik biomolekil, tankou fleksibilite pwoteyin ak estabilite, pa mwayen yon jaden fòs entra-atomik.Nan etid aktyèl sa a, nou analize defòmasyon chèn prensipal yo, faktè B, valè pwòp yo, faktè kovarans ak modèl rezo elastik. kòm paramèt NMA estanda pou evalyasyon konplèks pwoteyin-pwoteyin yo jwenn nan apwòch in silico [66-69].

Rezilta yo

Seleksyon ak rekipere sekans pwoteyin antijenik Leishmania

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), ki reflete pi gwo puisans yo pou konsepsyon vaksen (Tablo 1). Pwoteyin yo te diskriminasyon kòm sekretè ak ki pa sekretè ki baze sou prediksyon an nan sit klivaj peptide siyal pa sèvè SignalP 1.4 la. De nan pwoteyin yo chwazi Leishmania viz. L. mexicana cysteine ​​proteinase A (Uniprot id: P25775) ak L. amazoensis glikoprotein sifas GP-46/M2 (Uniprot id: P21978) yo te jwenn peptides siyal yo epi, kidonk, prevwa kòm pwoteyin sekretè. Rès dis antijèn Leishmania yo pa te jwenn okenn peptide siyal ki endike nati ki pa sekretè yo. Analiz lokalizasyon te predi ke pwoteyin sistèn proteinaz A nan L. mexicana (Uniprot id: P25775) yo dwe lokalize nan lizozom/vakuol, pwoteyin leishmanolysin C1 ak proteophosphoglycan nan L. mexicana (Uniprot id: P43150 ak Q9TW13, respektivman) yo dwe pwoteyin manbràn. , LACK pwoteksyon antijèn nan L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) yo dwe nan nwayo a ak chòk chalè 70 ki gen rapò pwoteyin 1 nan L. pi gwo (Uniprot id: P12076) yo dwe lokalize nan mitokondri. Tout lòt pwoteyin yo te prevwa kòm sitoplasmik (Tablo 1). Anplis de sa, sekans asid amine nan chèn alfa IL-12 imen an te jwenn tou nan baz done Uniprot (Uniprot id: P29459) pou itilize kòm yon adjuvant nan konstriksyon final vaksen an.

Prediksyon nan epitop CTL ak HTL

Soti nan tout pwoteyin yo te envestige, yon kantite total de 59 epitop CTL nonnameric komen yo te idantifye ansanm pa NetCTL 1.2 ak SYFPEITHI serveurs. Chak nan epitop prevwa CTL yo te asiyen yon nòt patikilye kalkile pa sèvè respektif yo. Se sèlman 26 nan motif komen 9-mer CTL sa yo te chwazi akòz pi gwo nòt yo (ki endike pi gwo afinite MHC I-obligatwa). Vennsis epitop CTL sa yo idantifye souvan pa tou de sèvè yo ak pi gwo nòt konpatib yo te enkli nan konstriksyon final vaksen an (sipleman Tablo S1). Menm jan an tou, zouti analiz IEDB MHCII-obligatwa prevwa 15-mer HTL epitop soti nan tout pwoteyin yo chwazi kont yon seri twa alèl HLA imen (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 ak HLADRB1*). 01:03). Epitop HTL prevwa ak pi ba ran ajiste pou chak youn nan alèl sa yo dokimante tankou nan Tablo S2 siplemantè. Soti nan pisin sa a, yo te chwazi yon kantite total nèf sekans sou baz ran ajisteman ki ba yo (Tablo 2) ki fè epitop HTL sa yo lyan MHC-II ki pi pisan pou nenpòt nan twa alèl HLA yo. Epitop HTL yo chwazi yo te sibi plis analiz enfòmatik yo nan lòd yo predi kapasite cytokine-pwodwi yo.

Tablo 1 Yo te eksplwate douz peptides antijenik potansyèl ki soti nan diferan espès Leishmania pou konstriksyon vaksen yo epi yo chwazi yo dapre gwo nòt antijèn yo jan sèvè ANTIGENpro a prevwa.

Depistaj pou epitop HTL ak kapasite ki pwovoke sitokin

Tout nèf epitop HTL yo te chwazi yo (Tablo 2) yo te evalye pou kapasite yo nan pwodwi interferon- pa anplwaye yon sèvè IFNepitope. Sèvè a te prevwa (IFN- vs nonIFN, lè l sèvi avèk SVM ak analiz ibrid ki baze sou motif) sèlman twa peptides tankou FRRLYKTLGQLVYKK soti nan pwoteyin baton parafagellar 2C nan L. major, DNGAYLGMEPSSVAA soti nan proteophosphoglycan nan L. mexicana, ak RLHFFMMGFAPLTSR soti nan tubulin beta chain L. mexicana kòm "pozitif" ak nòt ki pi piti pase 1.0 (Tablo 3). Twa peptides sa yo te tcheke plis pou kapasite IL-4 ak IL-10-pwodwi lè l sèvi avèk sèvè IL4pred ak sèvè IL10pred, respektivman. Tou de sèvè yo itilize yon klasifikasyon SVM epi konsidere divès paramèt opinyon SVM tankou konpozisyon asid amine, konpozisyon dipeptide, tandans asid amine, ak pwopriyete fizikochimik pou prediksyon an [32, 33]. Sèvè respektif yo te prevwa ke twa epitop ki pwodui 15-mer IFN- -sa yo te pwodiktè IL-4 ak IL-10 tou (Tablo Siplemantè S3). Kidonk, yo te finalman chwazi twa epitop HTL ki gen MHC-II-lye 15-mer HTL sa yo pou konstriksyon vaksen an konsidere kapasite yo genyen pou yo pwovoke sitokin IFN-, IL-4, ak IL{{24. }} kidonk medyatè yon repons iminitè ogmante.

Analiz konsèvasyon epitop

Modil IEDB "konsèvasyon atravè antijèn" ki disponib nan sèvè IEDB a te pwofite pou jwenn degre konsèvasyon epitop CTL ak HTL yo chwazi ki ta enkòpore nan konstriksyon final vaksen an. Chak nan vennsis epitop CTL ak twa epitop HTL yo te tès depistaj endividyèlman kont yon seri espesifik nan sekans pwoteyin omològ yo te jwenn pa Uniprot BLAST. Rezilta BLAST yo te montre yon wo degre de konsèvasyon nan pwoteyin yo chwazi nan divès espès Leishmania ak tou nan lòt pwotozo parazit ki gen rapò, sitou Trypanosoma. Yo te jwenn tout epitop HTL yo trè konsève (100%) atravè seri pwoteyin Leishmania ki gen rapò yo itilize nan analiz la, pandan y ap ranje konsèvasyon pou epitop CTL chwazi yo varye ant 0 a 100% (Tablo siplemantè. S4). Enkòporasyon epitop CTL ak HTL konsèvasyon sa yo nan konstriksyon final vaksen an ta asire iminite kwa lajè kont plizyè espès Leishmania patojèn ki souvan enfekte moun.

Tablo 2 Detay sou epitop HTL chwazi (15 mer) ak pwoteyin sous yo, alèl obligatwa korespondan, ak ran ajiste ke zouti IEDB MHC-II-obligatwa prevwa.

Tablo 3 Sèvè IFNepitope prevwa epitop MHC II ki pwovoke ki kapab pwodiksyon entèferon

Konstriksyon sekans vaksen milti-epitop

Sekans prensipal vaksen peptide milti-subunit la te konstwi pa fizyone sekans vennsis CTL epitop ak twa epitop HTL chwazi sou baz antijenisite yo, afinite MHC-obligatwa, ak kapasite cytokin-induit. Epitop CTL ak HTL endividyèl yo te amalgam lè yo itilize linkers AAY ak GPGPG, respektivman, ak longè total peptide vaksen ki te lakòz la te 369 asid amine. Adjuvant, 219 asid amine chèn alfa long nan IL-12 imen (Uniprot id: P29459), te ajoute nan tèminal N nan peptide ki fèt pa EAAK Linker. Ajoute IL-12 kòm yon adjuvant natirèl te sipoze amelyore efikasite vaksen an nan akselere repons iminitè a, jan sa deja valide nan etid sou bèt [3, 37]. Anplis de sa, yo te ajoute yon tag 6XHis tou nan tèminal C nan peptide a pou fasilite idantifikasyon ak pirifikasyon pwoteyin nan apre pwodiksyon li pa teknoloji ADN recombinant. Apre adisyon nan linkers, adjuvant, ak tag histidine, yo te jwenn longè peptide vaksen final la se 598 résidus asid amine (figi 1).

Prediksyon epitop selil B lineyè, kontinyèl ak discontinu

Prezans detèminan antijenik nan sekans prensipal vaksen ki fèt la te idantifye lè yo te itilize de sèvè diferan, sètadi, ABCpred ak BepiPred 2.0, pou prediksyon pi efikas. Sèvè ABCpred predi epitop selil B yo lè l sèvi avèk yon rezo neral ki resevwa fòmasyon epi li reprezante sekans kandida yo kòm 16- peptides Mer klase dapre nòt obligatwa yo (Tablo Siplemantè S5). Yon nòt ki pi wo nan peptide a vle di yon pi gwo pwobabilite pou yo te yon epitop. Yo te jwenn peptide vaksen ki fèt la gen sèt peptides ki pa sipèpoze 16-mer ak nòt prevwa 0.90 ak pi wo nan yon valè papòt default 0.51. , ki reflete pisans trè wo yo pou mare ak estimile selil B yo. Lòt sèvè a, BepiPred 2.0, predi pwobabilite pou chak rezidi asid amine nan sekans antre a dwe yon pati nan epitop selil B la epi li dekri pwodiksyon an kòm yon ilistrasyon ak yon gradyasyon koulè zoranj ki endike degre nan. pwobabilite. Rezid yo prevwa ki fè pati epitop selil B yo make kòm "E." Sèvè a te idantifye yon gwo kantite rezidi yo dwe epitop lineyè selil B ak gwo pwobabilite nan yon detire rezidi nan 380-53{{20}} pozisyon nan peptide a (figi 2) lè papòt epitop la te fikse nan 0.5 (default). Kidonk, idantifikasyon detèminan antijenik pou reseptè selil B pa de sèvè endepandan etabli lefèt ke peptide a, lè yo administre kòm yon vaksen, ta kapab ankouraje pwodiksyon an nan antikò pa selil B yo pwoteje moun ki soti nan enfeksyon Leishmania. Kostim Ellipro (ki disponib nan pòtal IEDB a) te prevwa yon total de 323 résidus asid amine ki sitiye nan uit epitop selil B diskontinye nan estrikti tersyè rafine nan vaksen peptide a, ak nòt ki sòti nan 0.509 a 0.802. Pami yo, pi gwo epitop konformasyon an te genyen 107 résidus asid amine ak yon nòt prevwa 0.772. Yo te itilize paramèt default sèvè a pou analiz la. Ellipro te prevwa tou douz epitop lineyè selil B ak yon kantite total 324 résidus nan yon seri nòt 0.535-0.885 (Tablo Siplemantè S6 ak imaj siplemantè M1).

Antijenisite, alèjisite, ak toksisite pwofil nan konstriksyon vaksen an

Se ANTIGENpro ak VaxiJen 2.0 sèvè yo te evalye antigenisite sekans vaksen final la (ak adjuvant). Sèvè ANTIGENpro te prevwa menm bagay la kòm yon antijèn pwobab ak yon nòt antijenisite 0.745396. VaxiJen 2. 0 sèvè evalye peptide vaksen an kòm yon anti-gen pwobab ak yon nòt 0.5325 nan yon papòt {{10}}.5 lè òganis sib la. te chwazi yo dwe yon parazit (Tablo 4). Sepandan, lè VaxiJen 2 te analize sekans vaksen orijinal la san adjuvant la.0, li tou te prevwa kòm yon antijèn pwobab ak yon nòt 0.5768 nan modèl parazit yo. Nòt prediksyon ANTIGENpro pou sekans orijinal la te 0.714582. Pakonsekan, tou de sekans vaksen yo konstwi (avèk ak san adjuvant) yo te jwenn yo se antijenik nan lanati, sipòte lefèt ke eleman peptides yo nan vaksen an te antijenik poukont yo, menm nan absans adjuvan an te ajoute (Tablo 4). An sa ki konsène alèjisite, AlgPred te jwenn sekans vaksen final la ki pa alèji ak yon nòt prevwa 0.4018 nan yon papòt 0.4. Anplis de sa, yo pa jwenn sekans pwoteyin nan genyen okenn epitop IgE ki pwouve eksperimantal, epi yo pa jwenn okenn frape pou rezilta BLAST pou peptides ki reprezante alèrjèn (ARPs), ki endike nati vaksen an ki pa alèjik. Sèvè AllerTOP v.2.0 te defini tou pwoteyin nan kòm yon pwobab ki pa alèjik. Analiz toksisite pa sèvè ToxinPred la te prevwa peptide a pa toksik lè SVM (TrEMBL) + apwòch ki baze sou motif te adopte nan yon papòt SVM nan 0.1, ak valè E koupe a pou motif ki baze sou yo te mete nan 10.0. Pakonsekan, sekans vaksen pwodwi a te prevwa kòm yon antijèn pwobab, ki pa alèrjèn ak ki pa toksik, yo tout se kritè enpòtan pou yon vaksen peptide milti-sous-inite ideyal.

Fig. 1 Deskripsyon eskematik vaksen peptide milti-epitop ki fèt ki gen yon total de 598 sekans asid amine ki reprezante posib konstriksyon vaksen ak adjuvant natirèl tèminal N (vèt) ki lye avèk EAAK (vyolèt) ak 26 CTL (zoranj) lè l sèvi avèk linker AAY (ble). , ak 3HTL (jòn) yo konekte ak GPGPG (wouj) linker. Li fini ak 6-Tag li nan tèminal C a pou rezon pou pirifye

Fig. 2 Epitop selil B prevwa pa sèvè Bepipred 2.0. Detire nan diferan pwen soti nan 1 a 590 sekans asid amine yo te prevwa ak epitop potansyèl pi wo pase nivo papòt la default. Premye liy ki make kòm E montre kote epitop yo prevwa a

Evalyasyon paramèt fizikochimik

Sèvè Protparam la te kalkile paramèt fizikochimik nan konstriksyon final vaksen an sou baz résidus asid amine ki prezan nan sekans yo bay la. Pwa molekilè (MW) nan peptide ki fèt la te kalkile yo dwe 65.68 kDa ki fè li apwopriye pou pwovoke yon repons iminojèn. PI teyorik la (pwen izoelektrik) te kalkile kòm 5.98, ki deziyen peptide a kòm yon ti kras asid nan lanati. Kantite total résidus ki chaje pozitivman ak chaje negatif nan peptide a te 48 ak 55, respektivman. Mwatye lavi a te kalkile kòm 30 èdtan nan retikulosit mamifè an vitro, plis pase 20 èdtan nan ledven, ak plis pase 10 èdtan nan E. coli in vivo. Pèsistans pwoteyin nan pou 30 èdtan nan selil mamifè yo (ki gen ladan moun) te ase pou pwovoke yon repons iminitè dezirab depi mekanis a mande pou pwosesis ak prezantasyon nan pwoteyin nan pa selil iminitè yo. Endèks alifatik (volim relatif okipe pa chèn bò alifatik yo) te prevwa yo dwe 78.34, ki endike pwoteyin nan se tèmostab nan lanati kòm endèks la alifatik ka konsidere kòm yon faktè pozitif kontribye nan ogmantasyon nan thermostabilité nan pwoteyin globulèr. Endèks enstabilite a te kalkile a 47.10. Yo prevwa gwo mwayèn idropati (GRAVY) valè konstriksyon vaksen an te prevwa a se -0.140; valè negatif la defini li kòm idrofil nan lanati epi li pral kominike avèk molekil dlo [28, 70-72]. Pou konkli, analiz iminoenfòmatik la te prevwa konstwi peptide ki fèt la kòm antijenik, tèmostab, ki pèsistan nan selil mamifè yo, ak idrofil. Tout faktè sa yo afekte efikasite konstriksyon an kòm yon kandida vaksen pwobab.

Prediksyon nan estrikti segondè

Sèvè PSIPRED prediksyon estrikti segondè a pou 592 rezidi long peptide chimerik la revele prezans 45.77% helix alfa, 4.89% beta-fèy, ak 49.32% bobin, jan sa montre nan Figi 3 sa a. Anplis de sa, estrikti RaptorX la. sèvè prediksyon te analize aksè a sòlvan ki enpòtan pou peptide a nan ki 36% nan résidus yo te prevwa yo dwe ekspoze, 28% yo te prevwa kòm mwayen antere l ', ak 35% nan résidus yo te prevwa kòm antere l', ki endike ke pwoteyin nan pral gen yon kontak jis an jeneral. ak dlo (sòlvan). Se sèlman 32 résidus (5% nan peptide a) te prevwa yo dwe nan domèn nan dezòd nan pwoteyin nan pa sèvè a RaptorX.

Prediksyon estrikti siperyè

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 endike yon modèl ki gen pliye ki kòrèk la. Nòt TM se yon paramèt endepandan sekans-longè pou mezire resanblans estriktirèl modèl la prevwa ak lòt pwoteyin ki idantik nan menm fanmi SCOP/CATH pliye [47].

Tablo 4 Rezilta antijenisite yo kalkile apati sèvè ANTIGENpro ak sèvè Vaxijen2.0 ak ak san antijèn

Fig. 3 Prediksyon estrikti segondè nan sekans vaksen lineyè pa sèvè PSIPRED

Fig. 4 Prediksyon ak rafineman estrikti siperyè 3-D Modèl estrikti vaksen an jan sèvè I-TASSER prevwa. b Rafineman modèl brut 3-D a pa sèvè GalaxyRefne

Rafineman ak validasyon modèl 3-D vaksen an

Yo te rafine modèl "brit" siperyè pou vaksen peptide a lè yo trete li atravè sèvè GalaxyReone la. GalaxyRefne te bay senk modèl, yo te jwenn modèl 1 ki pi bon apre evalyasyon ak konparezon paramèt ki asosye yo tankou GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbity (2.398); nòt konfli (21.1); pòv rotamers (0.6); ak rejyon Rama te favorize (88.8) ak rès modèl yo (figi 4b). Konplo Ramachandran ki te pwodwi pa sèvè MolProbity la te montre ke modèl rafine 3-D a gen 88.8% résidus nan rejyon favorize a, 98.6% résidus nan rejyon pèmèt yo, ak sèlman 0.013% outliers. Kontrèman, yo te jwenn premye modèl brut la gen 77.1%, 94.2%, ak 0.057% résidus nan rejyon favorize, pèmèt, ak outlier, respektivman. Rezilta sa yo klèman konkli ke bon jan kalite a nan modèl la siperyè rafine te siyifikativman amelyore. Sèvè ERRATA te eksplwate tou pou validation adisyonèl nan modèl la rafine. Sèvè ERRATA analize modèl la ak yon faktè kalite jeneral 43.542, ki aktyèlman reprezante pousantaj nan modèl pwoteyin opinyon ki tonbe pi ba pase limit rejè 95%. Kidonk, nou te jwenn avèk siksè yon estrikti siperyè rafine ak valide pou konstwi vaksen an. Estrikti siperyè vaksen an rafine, ansanm ak trase yo jwenn nan sèvè MolProbity ak sèvè ERRAT, reprezante nan Fig. 5. Sèvè entènèt ProSA a te montre yon nòt Z nan -1.08 (imaj siplemantè M2), kote negatif la. valè endike ke modèl la tonbe deyò ranje nòt yo nan pwoteyin ki sanble ak gwosè konparab ki gen estrikti yo te detèmine pa difraksyon X-ray oswa pa RMN [51].

Jeni disulfid nan peptide vaksen an

Disulfide by Design 2.12 sèvè te retounen 45 pè rezidi asid amine ki se sit pwobab pou fòmasyon kosyon disulfide. Nou te idantifye kat pè rezidi kandida ki pi enpòtan ki ta ka lokalize nan rejyon an bouk fleksib nan pwoteyin vaksen an ki baze sou gwo enèji kosyon yo ak valè Chi3 yo (Tablo Siplemantè S7). Résidus sa yo, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:{+125.92), THR{323-GLU359 (chi3). :+121.54), ak TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), yo te ranplase ak sistein nan modèl rafine siperyè nan pwoteyin vaksen final la, kidonk amelyore estabilite tèmik la. nan peptide (figi 6). Sepandan presizyon nan faktè B limite a atenuasyon nan epapiye netwon oswa radyografi pa mouvman an tèmik nan molekil nan kristalografi pwoteyin. Kidonk, nou seleksyone sevè enèji kosyon ak valè Chi3 sou faktè B pou modèl vaksen rafine ak asistans òdinatè sa a [73, 74].

Analiz entèraksyon debakadè peptide vaksen an ak TLR yo

Entèraksyon peptide chimerik la ak reseptè iminitè yo (TLR imen {{0}}, 4, 5, 8 ak TLR sourit-9) yo te etidye lè yo fè analiz debakadè lè l sèvi avèk sèvè PatchDock kote lyezon an. yo te evalye afinite vaksen an (ligand) ak divès kalite TLR (reseptè). Yo te konsidere dis pi gwo modèl PatchDock ki te pwodwi pou chak debakadè, pami yo te chwazi modèl ki pi byen plase yo ak pi gwo nòt debakadè yo pou chak ka. Nòt yo reprezante fòm ak konpleman elektwostatik òganizasyon charitab ant reseptè yo ak ligand yo. Pi bon konplemantè a te jwenn nan ka imen TLR-2 (PDB id: 6NIG) ak yon nòt 18,714, sifas 3963.10, ak enèji kontak atomik (ACE) 217.99 (Fig. 7a) . Vaksen an te montre tou yon lyezon efikas ak TLR-5 (PDB id: 3J0A) ak TLR{-9 (PDB id: 3WPF) ak yon nòt demaraj 18,258; sipèfisi 2879.80 ak ACE nan -666.94 ak nòt debakadè 18,164; ak sifas 4090.70 ak ACE nan 495.74, respektivman. Docking ak lòt TLR yo te montre pi fèb afinite obligatwa jan yo reflete nan pi ba nòt ancrage ki te pwodwi pa PatchDock, 16,708 pou TLR-4 (PDB id: 4G8A), ak 17,800 pou TLR-8 (PDB id: 4QC0). Kidonk, konstriksyon vaksen nou an te kapab mare ak diferan reseptè iminitè ak diferan afinite obligatwa. Sa a ta trè dezirab pou yon vaksen efikas an tèm de pwovoke yon iminite apwopriye ak entansifye pou anpeche enfeksyon Leishmania. Anplis de sa, yo te itilize zouti entènèt FireDock pou rafineman ak rekòmanse pi bon konplèks (TLR-2 vaksen konplèks), ki te rafine menm bagay la ak enèji mondyal minimòm-19.01, asosyasyon Van Der Waals (-25.74), kontak atomik. enèji (-0.03), ak obligatwa enèji gratis (-24.26). Rezilta sa yo konfime lefèt ke peptide vaksen an reyaji pi efikasman ak TLR imen-2 epi, kidonk, fòme yon konplèks ki rezonab ki estab ki ta ka rive yon repons iminitè ki make kont parazit Leishmania. Anplis de sa, nou plis envestige anbako ant TLR-2 ak vaksen; lè l sèvi avèk sèvè wèb Cluspro, yo chwazi modèl tèt la (Fig. 7b) ki baze sou 5D wotasyon FFT ak CAPRI (evalyasyon kritik entèraksyon prevwa) ak nòt balanse balanse-1192.5 ki gen pi gwo gwosè gwoup 42 manm. Tablo 5 gen yon lis 10 résidus asid amine ki kominike nan Fig. 7b ki fòme yon konplèks reseptè-ligand ki estab.

Fig. 5 yon trase Ramachandran pou modèl GalaxyRefne. b sèvè ERRAT prevwa evalyasyon kalite estrikti pwoteyin

Fig. 6 Disulfide pa konsepsyon 2. 0 te prevwa kat (ki endike ak flèch) potansyèl fòmasyon lyezon disulfid pou amelyore estabilite tèmik konstriksyon final vaksen an.

Optimize Kodon ak klonaj in silico pou ekspresyon pwoteyin vaksen an

Nan yon tantativ pou simonte pwoblèm patipri kodon, yo te itilize zouti JCat pou optimize kodon ki te retounen sekans asid amine peptide vaksen an nan fòm yon sekans cDNA ki te tradui ranvèse ak yon valè CAI optimize 1. Valè sa a bay manti. nan ranje valè CAI aksepte 0.8–1.0 [28], ki asire yon gwo pousantaj ekspresyon jèn nan òganis lame a, E. coli K12. Pi wo valè CAI, pi bon an pral to ekspresyon jèn etranje a. Anplis de sa, kontni GC nan sekans amelyore yo te jwenn 51.85%, ki endike yon bon optimize kodon. Pou pi bon ekspresyon jèn, 35-70% kontni GC obligatwa [63]. Sit restriksyon yo pou anzim XhoI ak NdeI yo te kreye nan pwent 5/ ak 3/ nan sekans lan, ki te swiv pa ensèsyon sekans modifye a nan vektè pET28 a(+). Insérer klonaj la, ki reprezante nan koulè wouj, manti ant sit restriksyon yo espesifye nan vektè a. Yon detire nan sis résidus histidine tou sitiye nan tou de bout nan sekans klonaj la fasilite pwosesis pou pirifye apre pwodiksyon an nan pwoteyin vaksen recombinant la [6, 31]. Gwosè konstriksyon vektè plasmid final la ak fragman jèn ki te mete a te apeprè 7 kb (Fig. 8). Sèvè entènèt mfold la te prevwa yon kantite total senkant konformasyon plisman mRNA a, pami yo te chwazi tèt estrikti a akòz pi ba nòt enèji li yo (ΔG= -492.50). Konfòmasyon an patikilye ki plwaye sa a te prevwa gen yon sèl bouk ekstèn ak kat pil ak enèji minimòm gratis ki endike estabilite nan konfòmasyon an. Bouk la te fòme ak 21 baz sèl-bloke ak de elis fèmen. Konplo enèji pwen an kalkile enèji optimal (δG) pou 494.4 kcal/mol. Pwen ki gen koulè diferan nan jaden an refere a diferan klas enèji nan yon pè baz patikilye prezan nan mRNA a konsidere δG kalkile pa sèvè a [64]. Dapre trase a, enèji gratis pifò pè baz yo nan -487.5 la.<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Tablo 5 PyMOL te pwodwi dis résidus asid amine kominike nan reseptè ak ligand soti nan Fig. 7b, ak nimewo a nan () endike pozisyon respektif nan asid amine nan reseptè ak ligand.

Simulation iminitè

Nan silico simulation iminitè lè l sèvi avèk sèvè entènèt C-immsim prevwa konte antijenik rive jiska 6.9 × 105 / ml nan 2 jou apre yon premye dòz piki, ak nivo antijèn tonbe a 0 sou katriyèm jou a ivè. Enkreman sa a nan konte antijèn korelasyon ak yon ogmantasyon remakab nan konsantrasyon tou de nivo IgM IgG ak nivo IgM poukont yo pandan peryòd enfeksyon an bonè epi rive nan nivo pik apeprè nan 12 jou sik enfeksyon an sou yon echèl abitrè. Lòt subtip IgG1+nivo IgG2 ak IgG1 ogmante ansibleman kòm yon rezilta repons iminitè segondè (figi 9a). Pwofil cytokine montre medyatè enflamatwa tankou INF ki rive nan nivo jiska 4 × 106 ng / ml nan 12yèm jou a, pandan y ap lòt nivo cytokine rete byen ba (Fig. 9b). Selil-medyatè repons iminolojik sijere pa prezans nan lenfosit T aktif ak repoze sitotoksik ogmante apre 2-3 jou apre premye piki a, ak prezans nan selil T èd memwa proliferatif te tou enpòtan (Fig. 9c ak d). Popilasyon selil B total la ogmante tou nan 2-3 jou, ansanm ak jenerasyon selil B memwa apre 1 semèn nan administrasyon dòz prensipal la (figi 9e).

Fig. 8 Sistèm ekspresyon vaksen Leishmania lè l sèvi avèk vektè pET28 a(+), rejyon wouj endike sekans asid nikleyik nan vaksen ki antoure pa sit restriksyon NdeI ak XhoI.

Entèpretasyon simulation molekilè dinamik

Te pi bon nòt anbakaj ki te reyalize nan konplèks TLR2-vaksen an te plis analize pa NMA-asistans simulation dinamik molekilè. Deformabilite nan chèn prensipal la reprezante pa gon segondè (figi 10a), ki vle di deformabilite segondè. Faktè B (figi 10b) te kalkile pa NMA, ki vle di fleksibilite pwoteyin ki baze sou paramèt deplasman atomik [73]. Valè pwòp la (Fig. 10c) delimite sou enèji ki nesesè pou defòme estrikti a. Konplèks vaksen TLR-2 montre yon valè pwòp anviwon 7.778× 10−7. Divèjans (Fig. 10d) se envès ki gen rapò ak valè pwòp la. Matris kovarans lan (figi 10e) montre si pè rezidi yo gen rapò (wouj), ki pa korelasyon (blan), oswa si wi ou non pè ki gen rapò (ble). Modèl rezo elastik la (figi 10f) kalkile sous yo ant pè atòm korespondan yo, pwen nan graf ki reprezante pa gradyan koulè ki endike frigidité oswa fleksibilite prentan, ak koulè ki pi fonse reflete sezon prentan pi rèd. Kidonk, rezilta simulation molekilè dinamik te sigjere ke vaksen peptide nou pwopoze a estab.

Diskisyon

Leishmaniasis konsidere kòm youn nan maladi twopikal ki pi neglije ki afekte prensipalman moun k ap viv nan zòn povrete nan peyi devlope yo, tankou peyi Zend [2]. Dapre rapò OMS, peyi Zend se endemik pou tou de fòm maladi a, CL ak VL. CL ki te koze pa L. tropica ak L. major rive nan eta nòdwès yo nan peyi Zend, Punjab, ak Rajasthan ki se fokis yo (https://www.who.int/leishmaniasis/ burden/Leishmaniasis_India/en/ ). Anplis de sa, ak ogmantasyon ensidan viris iminodefisyans imen an (VIH) epidemi atravè mond lan, leishmaniasis te parèt kòm yon patojèn opòtinis resurfacing nan pasyan SIDA ki fè sitiyasyon an menm plis terib [22, 38]. Nan etid aktyèl la, nou vize konsepsyon yon nouvo vaksen jeneral polivalan pou leishmanioz ki ta ka bay pwoteksyon eterològ kont espès parazit patojèn komen. Nou te chwazi douz pwoteyin espesifik Leishmania ki anglobe senk tansyon patojèn nan parazit la ki lakòz enfeksyon VL ak CL nan imen. Pwoteyin sa yo te deja evalye pou wòl yo nan virulans ak iminojenisite ak potansyèl yo kòm kandida vaksen nan divès etid iminolojik [1, 8–10, 75]. Se poutèt sa, yon konstriksyon vaksen ki fèt an silico pa enkòpore pwoteyin imunojèn ki byen karakterize ak trè konsève ki soti nan diferan espès patojèn Leishmania ta ka bay iminite kwa kont tout fòm leishmanioz imen (sitou VL ak CL) epi, kidonk, li ka itilize pou yon pwogram vaksen jeneral pou anpeche enfeksyon Leishmania nan imen. Pwoteyin yo chwazi yo te prensipalman tès depistaj pou prezans potansyèl CTL ak HTL epitop. Deteksyon nan epitop selil T enpòtan paske selil T yo ka rekonèt antijèn sèlman lè yo trete swa pa yon chemen andojèn oswa ekzojèn, konplèks ak MHC klas I oswa MHC klas II molekil, epi yo imedyatman prezante nan reseptè selil T yo pa selil ki prezante antijèn yo. APC). MHC-I espesifik pou CD8+CTL yo, pandan y ap MHC-II li espesifikman ak reseptè CD{4+HTL yo. Idantifikasyon pou CTL epitop yo te fèt sevè lè yo te anplwaye de serveurs endepandan ansanm. Se sèlman epitop sa yo ki te prevwa pa tou de sèvè ak afinite siyifikativman pi wo MHC-obligatwa yo te finalman enkli nan peptide vaksen an. Epitop HTL idantifye yo te plis evalye pou kapasite cytokine-induit yo pa eksplwate twa sèvè entènèt. Sa yo ki ta ka ankouraje pwodiksyon yon gran varyete sitokin, sètadi, IFN-, IL{{20}}, ak IL{-10, yo te chwazi pou konsepsyon vaksen peptide chimerik la pou asire ke li ta ankouraje pwodiksyon tout cytokines espesifik parazit sa yo nan lame a. Sa a se pi gwo enpòtans depi Kedzierski ak kòlèg yo te pwopoze ke sekresyon IL-10 enpòtan menm jan ak sekresyon IFN- pou detèmine si yon vaksen ka pwovoke yon repons iminitè pwoteksyon e ke iminite apwopriye pa pwovoke si IL. -10 nivo yo pa pwopòsyonèlman wo [8, 75]. Epitops eksklizif CTL ak HTL yo te pwochen kole lè yo itilize linkers AAY ak GPGPG pou konstwi peptide chimerik la. AAY ak GPGPG linkers yo te deja rapòte itil pou konsepsyon vaksen milti-epitop paske yo pèmèt iminojenisite minim junctional ak fasilite pwosesis la ak prezantasyon nan epitop chwazi pa MHC-II [6, 28, 71]. Chèn alfa adjuvant IL-12 imen an te lye ak tèminal N nan peptide rezilta a atravè linker EAAK la. IL-12 te chwazi kòm yon adjuvant paske li se youn nan adjuvant ki pi efikas pou vaksen Leishmania nan modèl bèt, jan yo te dokimante nan etid iminojenik anvan yo [3, 37, 71]. Piske vaksen an fèt pou administrasyon imen, enkòpore IL-12 imen kòm yon adjuvant natirèl olye de nenpòt agonist TLR sentetik yo espere ranfòse iminite san yo pa lakòz efè segondè negatif. Wòl IL-12 kòm yon adjuvant jeneral pou vaksen yo tou souliye akòz puisans li nan amelyore tou de pwoteyin ak repons antikò vaksen polisakarid ak pwovoke bon jan enflamasyon lokal ki pèmèt eksudasyon IgG ki mennen nan yon repons iminitè ogmante [72]. EAAK linker te ajoute pou reyalize yon pi gwo pousantaj ekspresyon ak ankouraje fonksyon byolojik peptide fizyon an pa mete restriksyon sou entèraksyon an nan mitan domèn vaksen yo [76, 77]. Analiz iminoenfòmatik te montre ke konstriksyon vaksen nou an gen anpil epitop lineyè selil B ki trè dezirab pou yon vaksen ki fèt pou itilizasyon imunoprofilaktik. Ankò, nou itilize de zouti diferan pou prediksyon pi egzak. Tou de sèvè prevwa ase epitop selil B nan sekans vaksen an. Yo prevwa vaksen ki fèt la ki pa alèjik, ki pa toksik, ak ase iminojenik pou deklanche yon reyaksyon iminitè apwopriye. Analiz fizikochimik ki vin apre yo te revele peptide vaksen an yon ti kras asid (pI 5.98) ak yon endèks alifatik konsiderableman pi wo (78.34), sijere nati tèrmostab li yo. Yon valè GRAVY negatif (-0.14) endike peptide a se idrofil, ki plis kontribye nan puisans li kòm yon vaksen. Se sèvè PSIPRED v 4.0 ki detèmine eleman estriktirèl segondè vaksen an, ki se youn nan metòd enfòmatik ki pi egzak ak lajman itilize pou prediksyon estrikti segondè pwoteyin. Anplis, estrikti 3D pou peptide ki fèt la te prevwa tou lè l sèvi avèk sèvè I-TASSER ki te bay enfòmasyon detaye sou kowòdone résidus enpòtan pwoteyin yo, ki gen anpil enpòtans pou etidye dinamik, byaktivite, ak entèraksyon vaksen an. ak lòt ligand. Yo te rafine ak valide estrikti inisyal la lè yo itilize zouti validasyon estrikti pwoteyin pou jwenn ak korije erè potansyèl nan chèn bò oswa kolòn vètebral modèl la prevwa a. Analiz konplo Ramachandran te montre ke plis pase 90% nan résidus nan modèl la rafine tonbe nan rejyon an pèmèt ak yon ti pousantaj nan outliers, pandan y ap sèvè a ERRAT te montre yon faktè bon jan kalite nan 43.542 ki se tout enplikasyon nan bon jan kalite modèl satisfezan. Modèl 3D valide a te jwenn yon kantite adekwat konformasyon epitop selil B pa sèvè ElliPro a, ki enplike ke li ta ka jenere yon repons selil B dezirab ak estimile pwodiksyon an nan antikò espesifik nan lame a. Aktivasyon selil B enpòtan tou nan memwa iminolojik epi li responsab pou iminite ki dire lontan nan moun ki pran vaksen an. Entèraksyon vaksen an ak reseptè iminitè yo (TLRs) te evalye tou pa fè analiz debakadè. Yo te jwenn peptide vaksen an gen pi gwo afinite pou TLR-2, ki te swiv pa TLR{-5, byenke li te kapab mare ak lòt TLR nan yon pi piti limit. Entèaksyon an ak TLR yo esansyèl pou pwovoke iminite pwoteksyon depi etid anvan ki enplike modèl bèt dokimante ke diferan espès Leishmania oswa eleman antijenik yo kominike avèk divès TLR ki mennen nan yon repons iminitè entans nan lame defi. Pou satisfè egzijans pou ekspresyon satisfezan nan pwoteyin recombinant vaksen an nan sistèm lame E. coli (K12), optimize kodon yo te fèt pa aplike zouti JCat ki ajiste CAI a ak sa ki GC nan sekans lan, ki fè li apwopriye pou ekspresyon nan. E. coli. Klonaj nan silico te fèt tou lè l sèvi avèk vektè ekspresyon ki baze sou plasmid pET28a(+) pou montre posibilite sekans pou klonaj ak ekspresyon pou reyalize pwodiksyon ranfòse pwoteyin vaksen recombinant. Prediksyon nan estrikti segondè nan mRNA a kode pa sekans jèn chimerik la te fè pou montre estabilite nan konfòmasyon ki plwaye nan mRNA a ki pral enfliyanse pwosesis la tradiksyon efikas nan lame a bakteri. Mitasyon estabilize yo te kreye lè yo ajoute nouvo lyen disulfid nan pwoteyin vaksen an paske li ta kontribye nan fòs pwoteyin natif natal la, ki fè li posib pou plis eksplorasyon byochimik, iminolojik ak bioteknoloji.

Fig. 9 C-immsim simulation iminitè ki baze sou sèvè. a Total de jenerasyon antijèn ak respektif antikò, b profil pwodiksyon sitokin, c ak d jenerasyon selil T asistan ak total (aktif ak repo) konte lenfosit T sitotoksik, e repons selil B apre administrasyon vaksen an.

Fig. 10 Simulation dinamik molekilè. a Deformabilité chèn prensipal ki endike pa gon, b NMA te pwodwi B faktè ki montre estabilite pwoteyin, c valè pwòp pou defòme estrikti nan konplèks debakadè, d endividyèl (koulè wouj violèt) % nan divèjans la ak kimilatif (vèt) nan estrikti a, e matris kovarans ki gen rapò. (wouj), san korelasyon (blan) oswa anti-korele (ble) ant pè atòm, f modèl rezo elastik ki montre sous dlo konekte ant pè atòm, gri pi fonse endike sous dlo rijid ak vis vèrsa.

benefis sipleman cistanche-ogmante iminite

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Konklizyon

Nan travay sa a, nou te eksplwate yon apwòch vaksinoloji ranvèse pou konsepsyon an silico yon vaksen peptide polivalan milti-sous-inite kont leishmanioz imen (tou de visceral ak kutane) ki ta ka kapab bay pwoteksyon eterològ kont parazit Leishmania komen ki enfekte moun ak, konsa, yo ka konsidere yo dwe gwo-spectre nan lanati. Menm bagay la tou ta ka itilize pou yon pwogram vaksinasyon jeneral pou kontwole ak elimine maladi a kòm yon estrateji konplemantè ansanm ak ajan chimyoterapi ki disponib kounye a. Anplis de sa, nou te itilize IL-12 kòm yon adjuvant natirèl olye pou yo nenpòt peptide sentetik ki pa imanize. Sèvi ak IL-12 kòm adjuvant la ap ogmante iminojenisite vaksen an san yo pa lakòz okenn efè segondè negatif nan kò lame a. Depi peptide vaksen an konpoze de yon varyete de peptides trè konsève ak potansyèlman iminojèn yo jwenn nan senk espès Leishmania patojèn, li itil pou pwovoke yon iminite kwa nan moun ki pran vaksen an, kidonk li gen tou avantaj terapetik ak pwofilaktik. Divès analiz imunoenfòmatik sevè ki itilize plizyè zouti enfòmatik yo te jwenn vaksen yo pwopoze a iminojèn, ki estab, ak repwodiktif kòm yon pwoteyin recombinant ak san danje pou esè imen. Sepandan, validasyon eksperimantal rete yo dwe fèt pou garanti bon rezilta nan pwoteksyon ak iminite ki dire lontan ak eskli toksisite.

Referans

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM et al. (2018) Vaksen peptides pou leishmanioz. Front Immunol 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) Fado sosyal ak ekonomik nan leishmanioz imen. Am J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24 (1): 16-25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Estati rechèch vaksen ak devlopman vaksen pou leishmanioz. Vaccine 34(26):2992–2995. https:// doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI ak Dube A (2014) Leishmaniasis visceral: avansman nan devlopman vaksen atravè apwòch klasik ak molekilè. Front Immunol 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) Eksplore pwoteyin sekretè Leishmania pou konsepsyon vaksen sou-inite milti-epitop selil B ak T lè l sèvi avèk apwòch imunoinformatik. Sci Rep 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS et al (2011) KSAC, premye kandida vaksen poliprotein defini pou leishmanioz visceral. Clin Vaccine Immunol 18 (7): 1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Vaksen kont Leishmaniasis: ki kote nou ye jodi a? J Glob Infect Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Kandida vaksen pou leishmanioz: yon revizyon. Int Immunopharmacol 11 (10): 1464–1488. https://doi.org/ 10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Dezyèm jenerasyon vaksen kont leishmanioz. Tandans Parasitol 21 (5): 244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M et al (2018) Antigenicity of Leishmania-activated c-kinase antigen (LACK) in moun periferic san mononuclear selil yo, ak efè pwoteksyon vaksinasyon premye ranfòsman ak pCI-neo-LACK plis atenuasyon LACK-eksprime viris vaccinia nan hamster. Front Immunol 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) Leishmania pi gwo LACK antijèn obligatwa pou parazitizasyon vertebrate efikas. J Exp Med 198(11):1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Kinetoplastid manbràn pwoteyin -11 kòm yon kandida vaksen ak yon faktè virulans nan Leishmania. Front Immunol 6:524. https://doi.org/ 10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Suppression jèn vize nan Leishmania pi gwo idantifye leishmanolysin (GP63) kòm yon faktè virulans. Mol Biochem Parasitol 120 (1): 33-40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL et al (1993) Viris vaccinia recombinant eksprime GP46/M-2 pwoteje kont enfeksyon Leishmania. Enfekte Immun 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) Chalè chòk pwoteyin anrichi-promastigotes nan Leishmania pi gwo pwovoke repons iminitè Th2 nan sourit BALB / c. Iran Biomed J 16 (4): 209-217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Eksplore wout ekspòtasyon Leishmania hydrophilic acylated sifas pwoteyin B (HASPB) pa metòd D 'selil vivan. Metòd Mol Biol 1459:191-203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) Yon BECA sou baton parafagellar kinetoplastid. J Parasit Dis 39(4):589–595. https:// doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: proteaz cysteine ​​yo esansyèl pou kwasans ak patojèn. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Wòl Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote cysteine ​​protease nan siviv parazit travellular: etid pa dezòd jèn ak anpèchman mRNA antisans. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) Wòl leishmania proteo phosphoglycans nan transmisyon mouch sab ak enfeksyon nan lame a mamifè. Front Microbiol 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Idantifikasyon roman antijèn Leishmania donovani ki ede defini korelasyon pwoteksyon vaksen medyatè nan leishmanioz visceral. PLoS One 4(6):e5820. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) Nan etid silico nan Leishmania donovani - tubulin ak inhibiteurs. J Chem. https://doi.org/10.1155/2014/492579