Entèferans nan glikozid Phenylethanoid soti nan Cistanche Tubulosa ak tès MTT la

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu ak Yu-Qi Gao

Résumé:

Egzamen MTT a, kòm yon metòd tès depistaj, yo te lajman itilize pou mezire viabilite ak pwopagasyon selil yo. Sepandan, li ta dwe remake ke tès la MTT ka pa byen reflete efè a nanCistanche tubulosaekstrè etanòl sou EA.hy926 selil viabilite. Pou envestige ak idantifye eleman ki responsab pou obsèvasyon kontradiktwa tès MTT, echinacoside, ak acteoside, yo te izole de glikozid phenylethanoid prensipal, ki soti nan ekstrè etanolik C. tubulosa. Done ki sòti nan CCK-8, Hoechst 33342 ak annexin V-FITC/PI tès sijere ke gwoup kafeoyl prezan nan tou de konpoze izole te responsab rezilta konfli nan tès MTT la. Done sa yo mete aksan sou nesesite pou itilize yon varyete metòd diferan pou detèmine efè ajan medsin yo sou viabilite selil yo pou evite jenere rezilta ki twonpe.

Mo kle: MTT assay;phenylethanoid glikozid; asid kafeyik; viabilite selil; entèferans

Entwodiksyon

Plant parazit laCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (fanmi Orobanchaceae) lajman distribye nan peyi Nò Afrik, Arab, ak Azyatik [1]. Tij la soti nanCistanche tubulosaepiCistanche deserticolayo enpòtan nan medikaman tradisyonèl Chinwa, yo te itilize pou tretman fèblès, esterilite, lonbago, ak konstipasyon akòz inèsi kolonik [2]. Anplis de sa, yo te montre ekstrè etanolik nan Cistanche tubulosa gen yon efè pwoteksyon enpòtan kont ipoksi serebral nan sourit [3].

Selil endothelial jwe yon wòl enpòtan nan patojèn tansyon wo ipoksik poumon. Liy selil andotelyal EA.hy926 konsiderableman menm jan ak selil andotelyal prensipal yo. Pandan etid pwòp nou an nan efè a anti-ipoksik nanCistanche tubulosaekstrè etanòl sou selil andotelyal EA.hy926, nou remake ke 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolyom bromur (MTT) esè, ki souvan itilize pou evalye viabilité selilè nan etid cytotoxisite ak aktivite cytostatic, te pwodwi rezilta konfli lè yo montre ogmante viabilite selil EA.hy926 apre tretman an.

Evalyasyon egzat sou viabilite selil yo esansyèl pou idantifye potansyèl efè cytotoxik oswa cytoprotective yon ajan medsin. Se poutèt sa, nou te envestige ki eleman ki prezan nan ekstrè etanolik C. tubulosa ki ka responsab rezilta konfli yo obsève ak tès MTT la. Nou izole de glikozid phenylethanoid prensipal (PhGs) ki soti nan C. tubulosa ekstrè etanolik, echinacoside (apwe sa a konpoze 1) ak acteoside (apwe sa a konpoze 2), epi detèmine efè yo sou viabilite selil EA.hy926 lè l sèvi avèk yon varyete metòd. Anplis de sa, nan lòd yo plis klarifye ki substituant nan konpoze 1 ak 2 ki ka responsab pou rezilta yo kontradiktwa, nou teste aglycones yo, asid kafeyik (apwe konpozisyon 3) ak 3, 4-dihydroxylphenylethanol (ki apre sa konpoze 4), sou viabilite selil EA.hy926 lè l sèvi avèk menm metòd yo.

Rezilta ak Diskisyon

Idantifikasyon konpoze

Estrikti yo nan de konpoze izole nan C. tubulosa ekstrè etanolik yo te idantifye pa nikleyè sonorite mayetik (NMR) ak mas spectrometri (MS) analyses epi yo montre nan Figi 1. Konpoze 1 te idantifye kòm echinacoside pa konparezon ak deja rapòte NMR (Tablo). 1) ak MS (m/z 785 [M−H]−) done [4]. Konpoze 2 espèk RMN yo te trè menm jan ak sa yo ki nan konpoze 1, eksepte pou absans la nan yon gwoup -D-glucopyranosyl (Tablo 1). Konpoze 2 (m/z 623 [M-H]-) te idantifye kòm acteoside [5]. Sa ki enpòtan, tou de konpoze yo gen menm aglikon, ki gen ladan asid kafeyik (konpoze 3) ak 3,4-dihydroxylphenylethanol (konpoze 4).

Selil Viabilite Essays

MTT ak CCK{{0}} yo te itilize analize efè konpoze 1-4 sou viabilite selil EA.hy926. Esè MTT la te montre ke viabilite selil EA.hy926 ogmante anpil apre tretman ak 25 ak 50 μM konpoze 1, 2, oswa 3 (166.3 pousan ak 174.1 pousan pou konpoze 1, 205.8 pousan ak 224.3 pousan pou konpoze). 2, ak 164.8 pousan ak 189.6 pousan pou konpoze 3, respektivman; p <0.05), lè="" yo="" konpare="" ak="" selil="" kontwòl="" (figi="" 2a).="" anplis="" de="" sa,="" yon="" enspeksyon="" mòfolojik="" nan="" selil="" yo="" detèmine="" ke="" tretman="" ak="" 50="" μm="" konpoze="" 1,="" 2,="" oswa="" 3="" ogmante="" fòmasyon="" nan="" kristal="" formazan="" koulè="" wouj="" violèt,="" ki="" konsidere="" kòm="" yon="" endikasyon="" dirèk="" nan="" pwopòsyon="" selil="" k="" ap="" viv="" (figi="" 3).="" kontrèman,="" tès="" cck-8="" te="" sigjere="" ke="" viabilite="" selil="" yo="" diminye="" anpil="" apre="" tretman="" ak="" 12.5,="" 25,="" ak="" 50="" μm="" konpoze="" 1,="" 2,="" oswa="" 3="" (75.5="" pousan,="" 45.1="" pousan,="" ak="" 43.7="" pousan="" pou="" konpoze="" 1,="" 85.5="" pousan,="" 51.8="" pousan,="" ak="" 34.3="" pousan="" pou="" konpoze="" 2,="" ak="" 64.5="" pousan,="" 48.2="" pousan,="" ak="" 36.4="" pousan="" pou="" konpoze="" 3,="" respektivman;="" p=""><0.05), konpare="" ak="" selil="" kontwòl="" (figi="" 2b).="" konpoze="" 4="" pa="" t="" afekte="" viabilite="" selil="" nan="" swa="" mtt="" oswa="" cck-8="" tès="" la.="" diferans="" ki="" genyen="" ant="" rezilta="" yo="" jwenn="" ak="" de="" tès="" yo="" sijere="" ke="" youn="" nan="" de="" tès="" yo="" ka="" pa="" byen="" reflete="" efè="" konpoze="" 1="" ak="" 2="" sou="" viabilite="" selil="">

Evalyasyon Apoptoz pa tach Hoechst

Hoechst 33342 se yon tach ADN pèmeyab nan selil ki eksite pa limyè iltravyolèt epi li emèt fliyoresans ble nan 460 a 490 nm. Kwomatin kondansasyon selil apoptotik yo tache pi klere pase kwomatin selil nòmal yo [6]. Lè nou konsidere ke selil kontwòl yo montre chromatin dispèse inifòm, òganèl nòmal, ak manbràn selilè entak, selil yo enkube ak 50 μM konpoze 1, 2, oswa 3 pou 48 èdtan te montre tach tipik nan selil apoptotik (Figi 4A). Kontrèman, ekspoze selil yo a 50 μM nan konpoze 4 pa t 'ogmante kantite nwayo apoptotik konpare ak tretman an kontwòl.

Flow Cytometric analiz de selil apoptotik

Anexin V-FITC/PI doub-tach tès la idantifye selil apoptotik pa segondè-affinity obligatwa nan annexin V-FITC nan fosfatidylserine, ki ekstèn nan selil sibi apoptoz [7]. Nan tès sa a, selil solid yo pa mare ni annexin V ni PI epi se poutèt sa yo pa tache (anba bò gòch kadran), selil apoptotik bonè yo tache vèt pa obligatwa annexin V-FITC (annexin V-FITC (kadran ki pi ba dwat), ak selil apoptotik an reta. yo tache vèt ak wouj pa obligatwa nan annexin V-FITC nan fosfatidylserine ak PI nan selil nekrotik, respektivman (anwo dwa kadran). Jan yo montre nan Figi 4B, selil enkubasyon ak 50 μM konpoze 1, 2, oswa 3 pou 48 èdtan, pousantaj selil apoptotik ogmante soti nan 3.74 pousan (selil kontwòl) a 10.32 pousan, 12.95 pousan, ak 11.30 pousan, respektivman. Konpare ak selil kontwòl, konpoze 4 pa t ogmante pousantaj selil apoptotik EA.hy926.

Konfòm ak rezilta yo jwenn ak tès CCK-8 ak tach Hoechst 33342, tès sitometri koule a te montre ke konpoze 1, 2, ak 3 pwovoke apoptoz nan selil EA.hy926. Ansanm, obsèvasyon sa yo sijere ke ogmantasyon nan viabilite selil EA.hy926 yo obsève ak tès la MTT apre tretman ak konpoze 1-3 reprezante yon rezilta fo-pozitif.

Diskisyon

An 1983, Mosmann te devlope yon tès kolorimetrik MTT mikroplak pou mezire pwopagasyon selilè ak sitotoksisite [8]. Egzamen senp sa a, ak modifikasyon li yo, se kounye a anpil itilize nan laboratwa byoloji selil atravè mond lan. Etid fraksyon nan selil mamifè yo endike ke kofaktè piridin nukleotid redwi, NADH, responsab pou pi fò rediksyon MTT. Sa a te sipòte pa etid ki itilize selil antye [9]. Se poutèt sa rediksyon MTT ki asosye ak selil metabolik aktif epi li pa sèlman makonnen ak respirasyon mitokondriyo, men tou, ak sitoplasm la ak manbràn ki pa mitokondriyo ki gen ladan lòj endosome / lizozom ak manbràn plasma [10]. Chaj pozitif nèt sou molekil MTT a se faktè prensipal pou absorption selilè li atravè potansyèl manbràn plasma a.

Miyò, tès MTT la ka detanzantan pa reflete avèk presizyon efè aktyèl ke yon konpoze teste genyen sou selil espesifik yo. Sepandan, estrikti chimik oswa gwoup ki ka lakòz rezilta konfli nan tès MTT yo pa te idantifye. Dènye etid yo te demontre ke tès MTT a ta ka underestimate efè anti-proliferatif nan (-)-epigallocatechin -3-gallat, polifenol ki pi abondan nan te vèt [11]. Nan etid ki itilize tès MTT pou detekte timè chemosansiblite, ajan chimyoterapi anti-kansè, tankou epirubicin, paclitaxel, docetaxel, ak imatinib mesylate (Gleevec), te montre ogmante viabilite selil [12,13]. Anplis, yon kantite etid te rapòte ke sèten ekstrè plant ak polifenol redox-aktif ta ka entèfere ak tès MTT la paske yo dirèkteman diminye sèl MTT tetrazolyom nan absans selil [14].

Bezwen pou solubilize kristal formazan MTT yo anvan analiz espektrofotometrik nan yon lektè microplate ak nati nannan pwen final reyaksyon an limite itilizasyon tès MTT pou sèten aplikasyon. Sa a te mennen nan devlopman nan analogue tetrazolyom kote yo te dekore moso fenil yo ak gwoup sulfonat chaje negatif, tankou 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5- sulfophenyl)-2H-tetrazolyum-5-carboxamide (XTT), yon sèl anndan chaje negatif [15] ak 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-({4-sulfophenyl){-2H-tetrazolyom (MTS), yon sèl anndan ki fèb asid ki gen rapò ak MTT [16] . Modifikasyon sa yo te lakòz pwodiksyon an nan kilti medyòm-idrosolubl pwodwi formazan ki elimine egzijans nan yon etap solubilizasyon anvan kantite. An menm tan an, kòm chaj negatif ogmante sou molekil sa yo redwi kapasite yo pou yo deplase atravè manbràn selilè [17], aseptè elèktron entèmedyè (IEA), tankou 1-methoxy-5-methyl phenazinium methyl sulfate ({{25} }}methoxy PMS) yo te oblije fasilite rediksyon tetrazol lank oswa amelyore pousantaj rediksyon an.

Pi resamman, yo te devlope yon nouvo jenerasyon sèl tetrazolyom idrosolubl nan ki WST-1 se pwototip [18]. WST-1, yon sèl anndan disulfonate chaje negatif ki gen yon rezidi yòd, pi estab pase XTT ak MTS nan prezans 1-methoxy PMS, IEA obligatwa li yo. Sa a te mennen nan maketing WST-1/{1-methoxy PMS kòm yon twous pratik sèl pwopagasyon selil reyaktif. Plizyè lòt sèl tetrazolyòm nan seri WST yo te devlope, ki pi itil nan yo petèt se WST -8 [19]. WST-8 sanble gen pwopriyete rediksyon selilè ki sanble anpil ak WST-1 epi yo ap mache poukont li kòm tès CCK-8. WST-8 se selil ki enpèmeyab epi se poutèt sa redwi nan yon lòt kote, atravè transpò elektwon soti nan NADH entraselilè rive nan WST-8 atravè manbràn plasma a medyatè pa 1-methoxy PMS. Malgre ke rediksyon MTT ak WST-8/{1-methoxy PMS yo kondwi pa NADH intraselilè, sous NADH parèt diferan nan de metòd sa yo. WST-8/{{1-methoxy PMS rediksyon an plis depann de navèt malat/aspartate ki lye sik asid trikarboksilik mitokondriyo-NADH ak espas ekstramitokondriyo a [20].

Nan eksperyans preliminè, nou konfime ke konpoze 1, 2, 3, ak 4 pa t 'kapab dirèkteman redwi sèl MTT tetrazolyom (pa montre). Nan etid prezan an, yo te elimine enfliyans dirèk konpoze yo ak reyaktif la lè yo lave mikroplak yo ak anpil atansyon ak saline ki gen tanpon fosfat (PBS) anvan yo te ajoute solisyon MTT oswa CCK-8, jan sa endike nan pwotokòl manifakti a. Men, rezilta yo te jwenn lè l sèvi avèk de metòd yo te toujou kontradiktwa (Figi 2). Kòm espere, enkubasyon selil ki gen konpoze 1, 2, ak 3 ogmante rediksyon sèl la tetrazolyom nan formazan koulè wouj violèt, konpare ak gwoup kontwòl la (Figi 3), sijere ke sèlman rediksyon sèl la tetrazolyom nan prezans yon konpoze espesifik. pa ase pou jije kapasite konpoze an pou entèfere ak tès MTT la.

Pou detèmine si konpoze 1, 2, 3, ak 4 ta ka pwovoke apoptoz nan selil EA.hy926, yo te evalye chanjman mòfolojik selilè ak ekstènasyon fosfatidylserine. An konfòm ak diminisyon nan viabilite selilè yo obsève ak tès CCK-8, rezilta yo nan tach Hoechst ak analiz sikometri koule lè l sèvi avèk aneksin V-FITC/PI sijere ke anpèchman kwasans yo obsève apre tretman konpoze 1, 2, ak 3 yo te. akòz, omwen an pati, nan apoptoz selil EA.hy926. Rezilta nou yo te sipòte tou lide ke gwoup kafeoyl prezan nan tou de konpoze 1 ak 2 te responsab rezilta kontradiktwa yo te jwenn ak tès MTT la.

Menm jan ak konklizyon nou yo, Rottlerin, yon gwo konduktivite ki pisan ouvè kanal potasyòm, pa t montre reyaksyon anvè MTT nan vitro. Sepandan, li fòtman amelyore fòmasyon nan kristal formazan andedan selil yo, yon rezilta ki te nan konfli evidan ak anpèchman Rottlerin nan NF-κB ak pwopagasyon selil obsève pa analiz de [3 H]-thymidine enkòporasyon nan ADN [21]. Mekanis nan ki Rottlerin amelyore rediksyon MTT te atribiye a efè dekoupaj mitokondriyo li yo [22]. Rottlerin gen yon gwoup substituant asid cinnamoyl. Konpare ak asid cinnamoyl, konpoze 3 genyen de rezidi idwoksil adisyonèl, ki sitiye nan C-3 ak C-4. Se poutèt sa, nou espekile ke mekanis nan ki konpoze 1 ak 2 lakòz rezilta konfli nan tès la MTT ka asosye tou ak efè dekoupaj mitokondriyo yo. Pou teste ipotèz sa a, yo bezwen etid konparatif nan mitan konpoze 1, 2, ak yon dekouplè chimik, tankou trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP).

Seksyon eksperimantal

Reyaktif ak pwodwi chimik yo

Konpoze 3 (asid kafeyik-poud, pite=98.6 pousan) te achte nan men Chengdu Push Bio-Technology co, Ltd (Chengdu, Lachin). Konpoze 4 (3,4-dihydroxylphenylethanol-lwil, pite=98.5 pousan) te jwenn nan Chengdu Must Bio-Technology co, Ltd (Chengdu, Lachin). MTT ak dimethyl sulfoxide (DMSO) yo te jwenn nan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Yo te achte tès CCK-8 nan Dojin Laboratories (Kumamoto, Japon). Hoechst 33342 ak annexin V-FITC/PI apoptoz deteksyon twous yo te achte nan men Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Lachin)

Materyèl Plant

C. tubulosa tij yo te kolekte nan Yutian Prefecture, Xinjiang Uygur Otonòm Rejyon, Lachin. Espesimèn bon yo te depoze nan laboratwa kle Medsin altitid wo, twazyèm Inivèsite Medikal Militè (Chongqing, Lachin) epi yo te otantifye pa Yi Zhang nan Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, Lachin)

Ekstraksyon ak Izolasyon nan Materyèl Plant

Tij C. tubulosa (0.6 kg) sèk lè yo te an poud epi yo te ekstrè ak 50 pousan etanòl pou 2 èdtan nan 70 degre. Apre yo fin retire sòlvan an anba presyon redwi, ekstrè etanolik la (212.5 g) te fonn epi sispann nan dlo (2 L) ak ekstrè ak n-butanol (2 L × 3). Ekstrè n-butanolik (110 g) te chromatographed sou yon kolòn poliamid ak eluye ak etanòl / dlo (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) pwodwi senk fraksyon (A-E) . Fraksyon B (65 g) te fraksyon sou yon kolòn ODS; elisyon ak etanòl: dlo (1:9) separe konpoze 1 (3 g). Fraksyon D (10.5 g) te fraksyon sou yon kolòn ODS; elisyon ak etanòl/dlo (1:4) separe konpoze 2 (1 g).

Spectre NMR yo te anrejistre sou yon espektromèt Bruker Avance 600 nan CD3OD ak Tetramethylsilane (TMS) kòm estanda entèn yo. Spectre mas yo te pote soti sou yon espektromèt mas BioTOF-Q.

Kilti Selil

Liy selilè EA.hy926 yo te jwenn nan American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Selil yo te kiltive nan mwayen RPMI 1640, complétée ak 10 pousan (v/v) serom fetal bovine ak 1 pousan (v/v) penisilin-streptomycin nan yon anviwònman imidite ak 5 pousan CO2 nan 37 degre.

Viabilite selilè

Yo te evalye viabilite selil yo lè l sèvi avèk MTT ak CCK{{0}} tès yo. Konpoze 1 ak 2, ak aglycones yo, asid kafeyik (3) ak 3,4-dihydroxylphenylethanol (4) te fonn nan DMSO nan konsantrasyon final DMSO <0.1 pousan="" (v/v)="" nan="" medya="">

Selil EA.hy926 yo te simen sou 96-plak byen nan 4 × 103 selil/pi. Apre enkubasyon pou 24 èdtan, selil yo te trete ak 6.25-50 μM konpoze 1, 2, 3, oswa 4 pou 24 èdtan. Yo te retire mwayen kilti a epi yo te lave selil yo de fwa ak saline tampon fosfat (PBS). Aliquots (10 μL) nan stock MTT solisyon (5 mg · mL-1) yo te ajoute nan chak pi ki gen 100 μL nan mwayen ak enkubasyon ak selil pou 4 èdtan. Apre enkubasyon, yo te retire mwayen an epi yo te ajoute 150 μL aliquot DMSO nan chak pi pou solubilize kristal formazan yo. Yo te mezire absorpsyon nan 490 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Viabilite selil yo te eksprime kòm pousantaj rediksyon MTT, bay valè 100 pousan nan absòbe selil kontwòl yo. Tout eksperyans yo te fèt twa fwa epi prezante kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD).

Yo te fè tès CCK-8 apre literati a ak ti modifikasyon [23]. Espesyalman, selil yo te trete ak 6.25-50 μM konpoze 1, 2, 3, oswa 4 pou 24 èdtan epi yo lave de fwa ak PBS anvan adisyon nan 10 μL CCK-8 solisyon ak 100 μL nan medya kilti. Apre enkubasyon mikroplak la nan 37 degre pou 2 èdtan, yo te mezire absorbans nan 450 nm lè l sèvi avèk yon lektè microplate. Viabilite selil yo te eksprime kòm pousantaj selil solid ki gen rapò ak selil kontwòl (100 pousan). Tout eksperyans yo te eskize twa fwa epi yo te eksprime kòm mwayen ± SD.

Evalyasyon apoptoz pa Hoechst 33342 tach

Chanjman mòfolojik apoptotik yo te obsève pa tach Hoechst 33342. Yon ti tan, selil EA.hy926 yo te simen sou 48-plak byen (2 × 104 selil/byen) epi yo te trete ak 50 μM konpoze 1, 2, 3, oswa 4 pou 48 èdtan nan 37 degre, lave de fwa ak PBS, ak fiks ak 4 pousan (v/v) paraformaldehyde pou 15 min nan tanperati chanm. Apre rense de fwa ak PBS, selil yo te tache ak Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) pou 5 min nan tanperati chanm epi lave de fwa ak PBS. Nwayo Hoechst-tache yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan (Olympus, Tokyo, Japon).

Analiz apoptoz pa Flow Cytometry

Selil apoptotik yo te detekte pa anexin V-FITC / PI doub-tach ak analiz sikometri koule. Yon ti tan, apre tretman ak 50 μM konpoze 1, 2, 3, oswa 4 pou 48 èdtan, selil yo te rekòlte ak resuspend nan PBS nan 1 × 105 selil · mL-1. Apre santrifujasyon nan 500 × g pou 5 min nan 25 degre, yo te ajoute 195 μL nan tanpon annexin V-FITC obligatwa ak 5 μL nan annexin V-FITC. Apre melanje toubiyon dou, yo te enkube melanj lan pou 10 minit nan tanperati chanm nan fè nwa a. Apre santrifujasyon nan 500 × g pou 5 min nan 25 degre, yo te ajoute 190 μL nan FITC-konjige tanpon annexin V obligatwa ak 10 μL PI. Apre melanje toubiyon dou, echantiyon yo te analize lè l sèvi avèk yon FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) nan lespas 30 minit.

Analiz estatistik

Tout done eksperimantal yo te eksprime kòm mwayen ± SD. Siyifikasyon diferans ki genyen ant echantiyon eksperimantal yo ak kontwòl korespondan an te evalye pa yon sèl-fason analiz de divèjans (ANOVA) lè l sèvi avèk lojisyèl an SPSS (vèsyon 11.5). Yo te fikse siyifikasyon estatistik nan p <>

Konklizyon

Rezilta nou yo sijere ke surestimasyon kantite selil solid yo obsève nan tès MTT a ta ka maske sitotoksisite sèten konpoze. Se poutèt sa, pandan pwosesis tès depistaj dwòg, nou rekòmande pou itilize yon varyete metòd pou detèmine efè konpoze espesifik la nan viabilite selil (tankou CCK-8 ak 3 H-TdR tès) pou evite jenere rezilta ki twonpe.