Maladi ren: Ki jan nikèl pwovoke otofaji nan ren?

Pou plis enfòmasyon:Ali.ma@wecistanche.com

Pati Ⅰ: Nikèl pwovoke otofaji atravè chemen PI3K/AKT/mTOR ak AMPK nan ren sourit

Heng Yin, Zhicai Zuo & et al.

1. Entwodiksyon

Nikèl(Ni), yon eleman natirèl, lajman distribiye nan konpatiman anviwònman an ki gen ladan tè, dlo, ak lè (Schrenk et al, 2020). Ni (Nikèl)konpoze ak Ni metalik (Nikèl)gen anpil aplikasyon endistriyèl ak komèsyal, tankou pwodiksyon alyaj, galvanoplastie, pil nikèl-kadmyòm, ak katalis nan endistri chimik ak manje (Genchi et al., 2020). Sepandan, vas endistriyèl itilize Ni (Nikèl)mennen nan polisyon nan anviwònman an toupatou, ki ogmante risk pou moun ekspoze a Ni atravè manje ak dlo pou bwè (Das et al, 2018). Malgre ke Ni (Nikèl) se yon mikronutriman esansyèl pou moun ak bèt, twòp ekspoze a Ni trè danjere pou sante moun (Das et al., 2018).

Ak ogmantasyon ensidans Ni (Nikèl)kontaminasyon nan dènye ane yo, Ni toksikoloji, ki gen ladan iminotoksisite, epatotoksisite, nefrotoksisite, ak toksisite poumon, te atire atansyon ogmante (Gathwan et al., 2013; Deng et al., 2016; Hasanein and Felegari, 2017; Guo et al., 2020a. .2020b). Laren, kòm yon ògàn sib enpòtan nan Ni (Nikèl)toksikoloji, ak yon akimilasyon Ni (Nikèl)ak Ni (Nikèl)konpoze ladan l atravè ekspoze kwonik ka pwovoke gwo domaj ren (Elangovan et al, 2018). Rechèch ki egziste deja nan ekip rechèch nou an te demontre endiksyon estrès oksidatif, apoptoz, enflamasyon, ak arete sik selilè nanrennan griyaj pa NiCl2 (Nikèlklori 2) nan manje ki depase 300 mg / kg (Guo et al, 2014, 2016a,2016b). Plizyè etid yo sijere ke mekanis nan toksikoloji ren Ni gen ladan domaj oksidatif, kraze ADN, ak apoptoz (Lee et al, 2001; Chen et al., 2010).

Jwe yon pati enpòtan nan omeyostazi selilè,otofajiyo te jwenn yon asosyasyon ak ensidans ak patojèn divès maladi (Martin et al, 2019). Dènye etid yo te montre ke lanmò selil yo ka entèmedyè pa soti-of-kontwòl oswa overstimulation nanotofaji(Denton ak Kumar, 2019). Kòm yon pwosesis konplèks ak trè òdone entraselilè,otofajikòmanse soti nan fòme vesik doub-manbràn ke yo rekonèt kòm otofagosòm ki ap vale yon pati nan sitosol ak òganèl (Martin et al, 2019). Imedyatman, otofagosòm yo patisipe nan proteolysis nan sibstans ki sou vale apre yo fin deplase nan lizozòm.

Otofajise sansib a divès kalite estrès selilè, tankou kwasans oswa privasyon faktè nitritif, ipoksi, domaj ADN, espès oksijèn reyaktif (ROS), agrégation pwoteyin, patojèn intraselilè, oswa domaj nan òganèl (Dodson et al, 2013). Li se yon pwosesis trè konplèks pou kontwoleotofaji, ki enplike anpil chemen siyal, ki gen ladan adenosine monofosfat aktive pwoteyin kinaz (AMPK), phosphatidylinositol 3-kinase-I (PI3K), ak sib mamifè rapamicin (mTOR) chemen (Cao et al2021). Epi, chemen an mTOR gen yon efè esansyèl nanotofajiinisyasyon. Aktivite mTOR la ​​se yon pòs debaz nanotofaji, ki gen efè inhibition mennen nan dephosphorylation nan ULK1 soulajeotofajianpèchman (Parzvch ak Klionsky, 2014). Anplis de sa, PI3K/Akt ak AMPK se pi gwo regilatè en mTOR (Gong et al, 2020; Xu et al, 2020). Rechèch anvan yo te sijere ke metal lou (tankou Cd, Hg, Cu, ak Pb) ka pwovoke ensidan an nanotofaji(Su et al, 2017). Malgre ke Huang et al.(2016) ak Son et al. (2017) te jwenn ke Ni (Nikèl)ekspoze kapab byen pwovokeotofajinan selil epitelyal bwonch yo, mekanis egzak la toujou klè,

Efè Ni (Nikèl)souotofajite raman rapòte, epi, sèlman kèk etid ki disponib sou efè Ni sou renotofajinan sourit nan vivo. Pakonsekan, travay aktyèl la gen pou objaktif pou konfime si NiCl2 (Nikèlklori 2)tretman ka pwovokeotofajiak evalye mekanis potansyèl NiCl (Nikèlklori)-pwovokeotofaji, ki gen ladan chemen AMPK ak PI3K/AKT/mTOR.

Nikèl afekte ren ak lakòz maladi ren

Klike sou Cistanche pou maladi ren

2. Materyèl ak metòd

2.1. Pwodwi chimik ak antikò

Nikèlklori(NiCl) te founi pa Chengdu Kelong chimik co, Ltd(Chengdu, Lachin). Nan analiz immunoblot la, tout antikò yo te achte nan men Cell Signaling Technology (CST, USA), ki gen ladan anti-lapen mikrotubule ki asosye pwoteyin1 limyè chèn 3B (LC3B) (Cat no.43566T), anti-lapen p62 (SQSTM1) (Cat). no.5114D), anti-lapen Beclin1 (Cat no.3495T), anti-lapenotofajiki gen rapò protein12 (Atg12) (Cat no.4180T), anti-lapen Atg5 (Cat no.12994T), anti-lapen Atg16L1 (Cat no.8089T), anti-lapen Atg7 (Cat no.8558T), anti-lapen Atg3 ( Cat no.3415T), anti-lapen mamifè sib rapamycin (mTOR) (Cat no.2983T), anti-lapen p-mTOR (Cat no.5536T), anti-lapen unc-51 tankou kinaz 1 (ULK1). )(Cat no.8054D), anti-lapen p-UIK1(Cat no.5869T), anti-lapen PI3K(Cat no.4292S), anti-lapen p PI3K(Cat no.4228T,anti-lapen Akt(Cat no. .9272S), anti-lapen p-Akt (Cat no.4060T), anti-lapen mTOR (Cat no.2972S), anti-lapen p-mTOR (Cat no. 5536S), anti-lapen AMPK (Cat no.5831S ), anti-lapen p-AMPK (Cat no.2535S), ak -actin (Cat no.4970T).

2.2.Bèt ak tretman

Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, Lachin) te bay totalman 160 sourit ICR gason ki an sante ki gen uit semèn. Tout bèt yo te kenbe nan kondisyon konstan (tanperati 25±2C; 12-h sik limyè-fè nwa) nan anviwònman aseptik, epi yo te manje ak rejim alimantè granules estanda ak dlo ad libitum. Sourit yo te klase nan kat gwoup owaza, chak ki gen karant mikro apre yo fin aklimate pandan sèt jou. Dlo distile te bay intragastrik kontwòl la, pandan y ap Ni (Nikèl)(NiCl2 (Nikèlklori 2).6H2O)ak dòz 7.5,15, ak 30 mg/kg te bay intra-gastrik pou bèt nan gwoup eksperimantal. Ni a adopte isit la te detèmine dapre valè medyàn dòz letal (LD50, 306.11 mg / kg) rive nan rechèch la sou toksisite oral egi nan sourit gason. NiCl (Nikèlklori),.6HZO te dilye lè l sèvi avèk dlo distile anvan ou fè eksperyans. Kat gwoup yo te administre ak yon dòz gavage de 1 mL pou chak 100 g pwa kò yon fwa pa jou pou 28 jou. Apre tretman pou 14 ak 28 jou, tout bèt yo te sakrifye imen pou kolekte yorenechantiyon pou analiz nan seksyon ki anba yo. Tout bèt ak pwosedi eksperimantal yo te fèt apre akò a te resevwa apwobasyon nan men Swen bèt ak Komite Etik nan Sichuan Agricultural University (Apwobasyon No: 2012-024, Chengdu, Lachin).

2.3. Detèminasyon endèks ren ak fonksyon

Tout sourit yo te peze chak semèn epi yo te sakrifye imanite lè yo te fini tretman an, epi apre sarenyo te koupe ak peze. Larenendèks itilize se te yon rapò antrenpwa ak pwa kò.

Chèchè yo te mezire nitwojèn san ure (BUN) ak nivo kreyatinin serik (CRE) swiv enstriksyon nan twous komèsyal ki te pwodwi pa Naniing Jiancheng Bioengineering Institute of China (Nanjing, Lachin),

2.4. Detèminasyon akimilasyon ren Ni (Nikèl)

renechantiyon yo te pran sou 28yèm jou a pandan eksperyans la. Lè sa a, 1 mL HCiO, ak 9 mL HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co, Ltd., Lachin) yo te itilize mouye-dijere 0.5g pòsyon echantiyon pou 24 èdtan nan tib ki gen rezistans tanperati ki wo. Lè sa a, yo te mete tib sa yo sou yon plak cho pou evapore tout likid soti, ki te swiv pa sispansyon nan rezidi a lè l sèvi avèk 1 0 mL 0.1 M/L HNO. Apre sa, chèchè analize echantiyon an tèm de Ni (Nikèl)ak èd nan yon flanm dife atomik absòpsyon spèktrofotomètr (AAS700, PerkinElmer, USA).

2.5. Obsèvasyon istopatolojik ak ultrastruktur

Apre yo te ranmase ak Lè sa a, fiks nan 4 pousan paraformaldehyde, larenechantiyon yo te dezidrate ak alkòl, entegre nan parafine, tranche nan 5 um, ak trete yo tach ak ematoksilin ak eozin. Yo te itilize yon kamera dijital (Nikon DS-Ri1, Japon) pou obsève tranch yo epi pran foto pou chanjman istopatolojik yo. Dis jaden mikwoskopik nan chakrenyo te revize. Imaj yo parèt nan papye a se yo menm ki reprezante.

Pou evalyasyon ultrastruktural, yo te aplike 2.5 pousan glutaraldehyde pou reparerentisi (apeprè 1 mm5) nan tanperati chanm. Sa a te swiv pa post-fixing nan tisi sa yo nan 1 pousan osmium tetoksid, dehydrated nan asetòn ak entegre nan résine epoksidik. Tranch ultra-mens yo prepare yo te mete sou grid kwiv epi yo tache lè l sèvi avèk acetate uranil ak acetate plon. Yo te kaptire imaj ultrastruktur lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elektwonik transmisyon JEM-1400Flash (JEOL, Japon).

retabli ak amelyore fonksyon ren: cistanche

2.6. Imunoistochimik

Apre yo te fin deparafine lè l sèvi avèk xylene, yo te reidrate tranch parafin lè yo itilize yon seri solisyon etanòl. Sa a te swiv pa lave ak dlo distile ak PBS, ak 15 min bloke nan aktivite peroksidaz andojèn (EPAs) atravè enkubasyon lè l sèvi avèk 3 pousan H,O.in methanol pou trempe EPA a. Pou fasilite rekipere antijèn, nou trete tranch yo atravè chofaj mikwo ond pou 15 minit nan 0.01 M tanpon sitrat so-dyòm ak pH 6.0.Apre yo fin sature pa nòmal 10 pousan sera kabrit pou 30 minit, tranch yo Lè sa a, sibi enkubasyon lè l sèvi avèk antikò prensipal lannwit lan nan 4 degre. Yo te itilize 1 pousan antikò sekndar kabrit anti-lapen/sourit IgG (Boster, Wuhan, Lachin) pou enkube tranch ki lave ak PBS nan 37 degre pou 1 èdtan, epi apre sa a 37 degre, konplèks streptavidin-biotin (SABC;Boster). , Wuhan, Lachin) te itilize pou 30 min. Sa a te swiv pa imèsyon nan tranch nan idroklorid diaminobenzidine (DAB; Boster, Wuhan, Lachin) pou imunoreaction visu-alization. Finalman, apre yo fin kontre limyè lè l sèvi avèk ematoksilin, tranch yo te dezidrate ak etanòl, otorize ak xylene epi monte, youn apre lòt.

Dansite optik entegre (IOD) te itilize pou quantification nan nivo pro-tein nan LC3B ak p62. Metòd analyse pou valè IOD refere li bay Fanget al.(2018).Yon sistèm kamera mikwoskòp dijital Nikon DS-Ril (Japon) te adopte pou pran imaj. Apre sa, chèchè yo te chwazi senk jaden (0.064 mm²) nan chak zòn imaj chak tranch pou analize avèk èd lojisyèl Image-Pro Plus v6.0 (Media Cy-bernetics Inc, Bethesda, MD, USA). ).

2.7. Western blotting

Pwoteyin ekstraksyon derenechantiyon yo te fèt lè l sèvi avèk RIPA lysis tanpon, ak reyaktif nan tès pwoteyin BCA (P0010S, Beyotime Teknoloji, Lachin) te itilize pou mezire konsantrasyon. Lè sa a, SDS-PAGE te pote soti pou echantiyon pwoteyin, ki te transfere nan manbràn nitrocellulose apre sa. Bloke lè l sèvi avèk 5 pousan lèt ekreme pou 1 èdtan nan tanperati chanm, manbràn yo te enkube ak antikò prensipal nan 4 degre lannwit lan. Apre w fin itilize antikò segondè konjige peroksidaz refor pou enkube pou 1 èdtan, yo te anplwaye yon Chemidoc XRS pou detekte bann pwoteyin sou manbràn yo lè l sèvi avèk twous ECL la (P0018A, Beyotime Technology, Lachin).

2.8.Quantitative an tan reyèl reyaksyon chèn polymerase (qRT-PCR)

renYo te pran ak moulen ak nitwojèn likid nan yon mòtye lè l sèvi avèk yon pilon epi konsève nan tanperati ki ba (-80 degre), RNA total ren yo te ekstrè lè l sèvi avèk RNAiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Japon) apre rekòmandasyon ki soti nan manifakti a. Sa a te swiv pa sentèz ADN konplemantè (cDNA) ak yon twous reyaktif RR047A Prim-ScriptTM RT ki te pwodwi pa Takara nan Japon swiv enstriksyon yo. Apre sa, qRT-PCR te fèt atravè itilizasyon yon sistèm PCR an tan reyèl LightCycler ⑩ 480 (Bio-Rad, USA) ak yon twous SYBR Premix Ex TaqTMII (DRR820A, Takara, Japon). Jadendanfan yo itilize pou yon PCR yo ki nan lis nan Tablo 1. Yo te itilize -aktin pou nòmalizasyon ekspresyon jèn yo, epi ekspresyon relatif mRNA yo te kalkile atravè metòd 2-4ac (Livak and Schmittgen, 2001).

2.9. Analiz estatistik

Done yo te eksprime sou fòm mwayèn ± devyasyon estanda epi yo te analize atravè LSD oswa analiz divèjans T3 Dunnett la. Yo te itilize lojisyèl SPSS (vèsyon 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, USA) pou tout analiz estatistik pou fenèt yo. P<0.05 represents="" a="" significant="">

Tablo 1: Sekans premye yo itilize nan etid la,

3. Rezilta yo

3.1.NiClz (Nikèlklori)afekte fonksyon ren

Jan yo montre nan Fig.1A, pwa kò a te bese nan twa gwoup trete ak NiCl2 (Nikèlklori 2). Epi, yo te jwenn yon diminisyon enpòtan tou nan pwa relatif laren(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

Serom CRE ak BUN yo te itilize kòm byomarkè estanda pou fonksyon ren. Rezilta yo nan fonksyon ren yo te parèt nan Fig.1C ak D, ak konsantrasyon yo nan CRE ak BUN yo te siyifikativman ogmante (P<0.05)in the=""> (Nikèlklori 2)-gwoup tretman nan jou 14 ak 28 fanmi nan kontwòl la.

Fig.1E te montre ke twa Ni a (Nikèl)gwoup tretman yo gen pi gwo konsantrasyon Ni nan ren an (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (Nikèlklori)- pwovoke varyasyon istopatolojik nan ren

Fig.2 montre ke NiClz (Nikèlklori)tretman ki te koze varyasyon istopatolojik nan larenak dòz ak tan, ki enplike glomerulus anfle ansanm ak espas kapsulè etwat, vacuolar a, ak koripsyon granulaire nan epithelium nan tubulaires ren.

Figi 2. NiCl2 (Nikèlklori 2)pwovoke chanjman istopatolojik nan ren an.

Blesi istopatolojik yo te gen ladan glomerulus anfle ansanm ak espas kapsulè réduit (*), koripsyon vakuolè (flèch nwa) ak koripsyon granulaire (flèch blan) nan epiteli tubulaires ren yo. HE tach, ba echèl=50 µm.

3.3.NiCl (Nikèlklori)pwovoke otofaji ak ogmante jèn ki gen rapò ak otofaji ak pwoteyin nan ren an

LC3 ak p62 yo se byomarkè enpòtan yootofaji(Gomez-San-chez et al..2016). Konpare ak kontwòl la, twa NiCl2 la (Nikèlklori 2) gwoup tretman yo te temwen yon ogmantasyon enpòtan nan nivo pwoteyin LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">otofajise tou detèminasyon TEM nan etid sa a. Jan yo montre nan Fig, 3F, obsèvasyon TEM yo te montre ke nimewo otolysosomes yo te ogmante nan tisi ren apre NiCl2. (Nikèlklori 2)ekspoze.

Figi 3. NiCl2 (Nikèlklori 2)ogmante otofaji nan ren sourit yo.

(A) Rezilta Western blot LC3 ak p62. (B, C) Kantifikasyon LC3-II/I ak p62. (DE) Ekspresyon mRNA LC3 ak p62. (F)

Estrikti ultraestriktirèl selil epitelyal tibil konvoke proximal (figi dwat yo montre elajisman pasyèl figi gòch yo; flèch nwa yo ki endike estrikti otolyzosome).

Valè yo prezante ak mwayen ± devyasyon estanda (n {{0}}). Kolòn ki make ak lèt ​​diferan yo se diferans enpòtan (P <>

Anplis de sa, yo te itilize imunohistochimi pou mezire nivo pwoteyin LC3B ak p62 nanrentisi nan etid prezan an. Jan yo montre nan Fig.4, selil pozitif yo tache mawon, ak LC3B ak p62 yo te eksprime sitou nan sitoplasm nan selil epitelyal tubul ren yo. An konparezon ak kontwòl la, valè IOD yo nan LC3B montre yon ogmantasyon siyifikatif (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nikèlklori) nan jou 14 ak 28. Anplis de sa, valè IOD p62 yo te siyifikativman diminye (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Fig. 4. Rezilta imunohistochimik LC3B ak p62 nan ren sourit yo.

(A) Imaj imunohistochimik LC3B yo. (ba echèl=50 µm) (B) Imaj imunohistochimi p62 yo (ba echèl =50 µm)

(C) Dansite optik entegre (IOD) nan LC3B. (D) Dansite optik entegre (IOD) p62.

Valè yo prezante ak mwayen ± devyasyon estanda (n {{0}}). Kolòn ki make ak lèt ​​diferan yo se diferans enpòtan (P <>

Jèn ak pwoteyin ki gen rapò akotofajiak patisipe nan laotofajiflux yo te mezire plis verifye efè NiCl (Nikèlklori) souotofaji. Sa yo enkli Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, ak Atg3 (Li and Zhang.2019; Nishimura and Tooze, 2020). Jan yo montre nan Fig.5A-C, konpare ak kontwòl la, gwoup tretman Ni (Nikèl)montre nivo ki pi wo nan pwoteyin Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, ak Atg3(P).<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Figi 5. NiCl2 (Nikèlklori 2)ogmante jèn ki gen rapò ak otofaji ak pwoteyin nan ren sourit yo.

(A) Rezilta blot lwès yo nan Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, ak Atg3. (B&G) Kantifikasyon ekspresyon pwoteyin Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, ak Atg3.

(HM) Ekspresyon mRNA Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7, ak Atg3. Valè yo prezante ak mwayen ± devyasyon estanda (n=8). Kolòn ki make ak lèt ​​diferan yo se diferans enpòtan (P <>

3.4.NiCl2 (Nikèlklori 2)pwovoke chemen PI3K/Akt/mTOR ak AMPK nan ren

mTOR se yon regilatè esansyèl nanotofaji(Wang et al.,2017).Epi byen etabli en regilatè chemen mTOR yo genyen ladan yo PI3K/Akt ak AMPK (Gong et al..2020:Xu et al..2020). Kidonk, etid sa a mezire pwoteyin AMPK ak PI3K/Akt.

Kòm Fg.6A ak B montre ke nivo pwoteyin p-PI3K, p-AKT, ak p-mTOR yo te jwenn yon diminisyon enpòtan (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Nikèlklori 2)nan jou 14 ak 28 nan eksperyans la relatif nan kontwòl la. Gwoup tretman yo te montre nivo pwoteyin p-AMPK ak p-ULK1 siyifikativman pi wo (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Nikèlklori 2)-Gwoup tretman yo te jwenn yon diminisyon enpòtan nan ekspresyon mRNA nan PI3K, AKT, ak mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Rezilta sa yo revele saotofajipwovoke pa NiCl2 (Nikèlklori 2)nan sourit kid-ney ki enplike AMPK ak PI3K/Akt/mTOR chemen.

Figi 6. NiCl2 (Nikèlklori 2)pwovoke chemen siyal PI3K/Akt/mTOR ak AMPK nan ren sourit yo.

(A) Rezilta Western blot p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1, ak ULK1.

(BF) Quantification de p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR, ak p-ULK1/ULK1 ekspresyon pwoteyin. (G, K)

Ekspresyon mRNA PI3K, AKT, AMPK, mTOR, ak ULK1. Valè yo prezante ak mwayen ± devyasyon estanda (n=8). Kolòn ki make ak lèt ​​diferan yo se diferans enpòtan (P <>

KLIKE LA POU PATIⅡ