LIMIT se yon LncRNA iminojenik nan iminite kansè ak iminoterapi

Résumé

MHC-I prezante antijèn timè nan selil CD8+ T epi deklanche iminite anti-timè. Moun ka gen 30,000-60,000 RNA ki pa kode (lncRNAs). Sepandan, li rete mal konprann si lncRNA yo ka afekte iminite timè. Isit la, nou idantifye yon LncRNA, ki kapab pwovoke MHC-I ak iminojenisite timè (LIMIT) nan imen ak sourit. Nou te jwenn IFN ankouraje LIMIT, LIMIT cis-aktive guanilat obligatwa pwoteyin (GBP) gwoup jèn, ak GBPs deranje asosyasyon ki genyen ant HSP90 ak faktè chòk chalè -1 (HSF1) - kidonk sa ki lakòz HSF1 aktivasyon ak transkripsyon nan MHC-I. machin, men se pa PD-L1. Aktivasyon CRISPR ki gide RNA nan LIMIT ranfòse GBPs ak MHC-I, ak potensye iminojenisite timè ak terapi pòs.

Silans LIMIT, GBPs, ak/oswa HSF1 diminye MHC-I, andikape iminite antitumoral, ak efase efikasite iminoterapi. Klinikman, LIMIT, GBPs- ak HSF1-siyal transkripsyon ak pwoteyin ki gen rapò ak MHC-I, selil T ki enfiltre timè yo, ak repons blokaj pwen kontwòl nan pasyan kansè yo. Ansanm, nou demontre LIMIT se yon lncRNA iminojenik kansè ki pa konnen deja epi aks LIMIT-GBP-HSF1 ka vize pou iminoterapi kansè.

Mo kle 

Long noncoding RNA; LIMIT; MHC-I; IFN; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; iminite selil T; imunoterapi kansè

Entwodiksyon

Blòk pòs tchèk degaje pouvwa iminitè CD8+ T ki te medyatè kont kansè1. Gwo konplèks istokonpatibilite-I (MHC-I) jwe yon wòl kle nan CD8+ T selil priming ak aktivasyon2. Sepandan, MHC-I souvan regilasyon nan selil kansè yo, sa ki lakòz evazyon iminitè timè ak rezistans iminoterapi3,4. Li enpòtan pou konprann kijan pou refè ekspresyon timè MHC-I ak revitalize repons iminitè antitumoral5. LncRNA yo ap parèt rapidman ansanm ak avansman nan sekans RNA gwo twou san fon, ki kouvri anpil plis loci nan genòm imen an pase jèn ki kode pwoteyin6. LncRNA yo kontwole jèn ki kode pwoteyin nan plizyè nivo7-9 epi jwe yon wòl enpòtan nan enpresyon jenomik10, diferansyasyon selilè11, ak pwogresyon kansè12. Sepandan, idantite, mòd aksyon, fonksyon, ak enpòtans klinik espesifik lncRNAs nan iminite kansè ak imunoterapi rete enkoni. Isit la, nou idantifye LIMIT kòm yon lncRNA iminojenik kansè enkoni deja. LIMIT afekte machin MHC-I ak iminite antitumoral. Nou te jwenn ke LIMIT vize GBP lokalman, kidonk fòme yon kaskad molekilè nan LIMIT-GBP-HSF1-MHC pou chanje iminite antitumoral ak efikasite imunoterapi timè. Travay nou an pa sèlman revele byoloji yon lncRNA iminojenik, LIMIT, li pa t konnen deja, men tou sijere ke aks LIMIT-GBP-HSF1 ka vize pou iminoterapi kansè.

LIMIT se yon lncRNA imunojèn

cistanche tubulosa-amelyore sistèm iminitè

Pou eksplore jèn regilasyon enkoni nan iminite timè, ki baze sou timè CD8+ enfiltrasyon selil T, nou divize melanom imen (TCGA, SKCM) an kalite timè cho ak frèt epi analize korelasyon jèn imunojèn. Anplis CD8A, IFN, ak transkripsyon MHC-I (HLA-ABC), nou te jwenn ke yon kandida lncRNA te rich nan timè a cho, nan mitan 3926 kandida lncRNA anote pa GENCODE13 (Fig. 1a; Tablo siplemantè 1). Baze sou etid fonksyonèl nan eksperyans sa yo, nou deziyen kandida lncRNA sa a kòm LIMIT: lncRNA Inducing MHC-I ak Immunogenicity of Tumor (LIMIT). Nan seri done melanom imen an, nivo LIMIT te gen rapò pozitif ak IFN, MHC-I ak CD8 (Fig. 1b-d). Nan liy ak sa a, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) te revele ke ekspresyon LIMIT ki gen rapò ak jèn repons IFN, prezantasyon antijèn atravè MHC-I, ak aktivasyon iminitè (Fig. 1e-h). Anplis, nivo LIMIT yo te asosye ak pousantaj repons imunoterapi améliorée 14-17 (Fig. 1i) epi yo te asosye ak siviv nan pasyan ki gen melanom (Fig. 1j). Anplis de sa, ekspresyon LIMIT te gen rapò ak IFN, MHC-I, ak CD8 atravè plizyè kalite kansè (Done Pwolonje Fig. 1a-l). Kidonk, LIMIT se yon potansyèl lncRNA iminojenik.

Nou valide si LIMIT se yon lncRNA. Northern blotting te montre ke LIMIT te apeprè 2 kb nan longè nan selil melanom A375 imen (figi 1k). Nou aplike rapid anplifikasyon nan pwent cDNA (RACE) epi karakterize bout cDNA LIMIT nan tou de selil melanom imen (A375) ak sourit (B16) (Fig. 1l, m). Apre sa, nou klonaj tout longè LIMIT nan tou de moun ak sourit epi aliyen li ak sekans genomic korespondan (Done pwolonje Fig. 2a, b). Moun LIMIT te lokalize nan kwomozòm 1, ak 1967 nukleotid ak 6 exons (Done pwolonje Fig. 2a), pandan y ap Limit sourit la te lokalize nan kwomozòm 3, ak 1634 nukleotid ak 7 ègson (Done pwolonje Fig. 2b). LIMIT pa t gen yon sekans Kozak ki valab. Lè nou te prepare RNA nan fraksyon nikleyè ak sitoplasmik nan selil A375, LIMIT te sitou detekte nan fraksyon nikleyè a (Fig. 1n). Kidonk, LIMIT pa gen okenn potansyèl kodaj pwoteyin. Ansanm, LIMIT satisfè tout kritè yo dwe defini kòm yon lncRNA. Miyò, nan plas LIMIT la, yon kandida lncRNA, yo te jwenn yon pseudogene nan GBP1 (GBP1P1) nan karsinom hepatocellular (HCC)18. Sepandan, LIMIT te montre resanblans ki ba ak GBP1P1 oswa GBP1 (Done Pwolonje Fig. 2c, Tablo Siplemantè 2). Kidonk, LIMIT se pa GBP1P1. Yon gwo korelasyon ant LIMIT ak siyati jèn ki reponn IFN (Fig. 1e) sijere ke IFN ka ankouraje ekspresyon LIMIT. Vreman vre, tretman ak IFN pwovoke ekspresyon LIMIT, jan yo montre Northern blotting (Fig. 1k) ak RNA-seq nan selil A375, HT29, Meijuso, ak A549 (Fig. 1o). Sepandan, tretman ak lòt cytokines, tankou IFN ak TNF, echwe pou pou pwovoke ekspresyon LIMIT (Fig. 1k). Anplis, IFN echwe pou pou pwovoke LIMIT nan selil STAT1 knockout (KO) A375 (figi 1p). Pakonsekan, LIMIT se yon IFN ki te deja enkoni - lncRNA reponn nan tou de selil imen ak sourit.

LIMIT ogmante ekspresyon MHC-I

benefis sipleman cistanche-ki jan yo ranfòse sistèm iminitè

Klike la a pou w wè pwodwi Cistanche Enhance Immunity

【Mande plis】 Imèl:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pou etidye fonksyon LIMIT nan selil timè yo, nou te premye frape LIMIT ak ti RNA epengl (shLIMIT). Nou te anplwaye zouti Blast pou chwazi LIMIT shRNA ki pa gen kandida ki pa sib (Tablo Siplemantè 3-6). ShLIMIT pa t 'sib GBP kode jèn (Done pwolonje Fig. 3a). Nan selil A375, shLIMIT siprime ekspresyon LIMIT (Fig. 2a), men li pa afekte fosforilasyon STAT1 (Fig. 2b) an repons a IFN - sijere ke LIMIT pa afekte siyal jèn IFN mondyal la. MHC-I ak PD-L1 se jèn sib IFN19-21. ShLIMIT te mennen nan yon diminisyon nan ekspresyon MHC-I (Fig. 2c), men se pa PD-L1 (Done Pwolonje Fig. 3b), an repons a eksitasyon IFN. Nan liy ak done imen sa a, Limit silans nan selil melanom murin YUMM1.7 oswa selil kansè nan kolon CT26 te lakòz ekspresyon MHC-I redwi an repons a IFN (Fig. 2d-g). Nan selil A375, shLIMIT afekte pa sèlman ekspresyon MHC-I (HLA-ABC, HLA-E, ak HLA-F), men tou ekspresyon MHC-II (HLA-DRA ak HLA-DMA); tandiske LIMIT pa t chanje lòt ekspresyon jèn siyal IFN (Done pwolonje Fig. 3c). Kidonk, LIMIT patisipe nan règleman ekspresyon IFN-induit MHC-I ak MHC-II san yo pa chanje chemen siyal IFN mondyal la.

LIMIT se yon jèn entèwonp ak gwo entron, ki okipe anviwon 17 kb nan genòm nan. Nou te echwe pou pou frape soti nan LIMIT ak sgRNAs pè ak Cas9. Etandone ke gen 5 prevwa sit obligatwa STAT1 / IRF1 nan pwomotè a LIMIT, nou te fèt 4 sgRNA pè yo efase sit sa yo obligatwa nan pwomotè a LIMIT (Done pwolonje Fig. 3d). Nou te pwodwi selil A375 ak sipresyon pwomotè LIMIT nan tout 4 konbinezon sgRNAs. Nou te jwenn IFN pa efikas ankò pou pwovoke ekspresyon LIMIT ak MHC-I nan selil timè ak efase pwomotè LIMIT lè yo konpare ak selil sovaj (figi 2h, i). Anplis de sa, nou te anplwaye yon sistèm deklanchman CRISPR ki gide RNA pou aktive ekspresyon Limit nan selil timè yo22. Nou te etabli 4 RNA gid ki vize rejyon pwomotè Limit (sgLimit), epi ko-eksprime ak dCas9-VPR, yon activator transcriptional tripartite ki te kole ak nuclease-null Cas9, nan selil B16 (Done pwolonje Fig. 4a). Tout 4 sgLimit amelyore ekspresyon Limit, osi byen ke MHC-I (Done Pwolonje Fig. 4b, c). Lè nou transfekte selil B16 ak sgLimit pisin ak sgRNAs ki pa vize (sgNT), sgLimit pwovoke ekspresyon Limit ak MHC-I, men se pa PD-L1 (figi 2j, k). Pakonsekan, Limit vize oaza MHC-I, men se pa PD-L1. Ansanm, eksperyans pèt ak pwogrè fonksyon yo montre LIMIT ka chanje ekspresyon 1.5-3 pliye-MHC-I nan plizyè selil kansè atravè sourit ak imen. Apre sa, nou te mennen ankèt sou si ekspresyon MHC-I ki chanje LIMIT gen enpak sou tiye timè an vitro CD8+ T ki baze sou selil T a espesifik. Pou sa ka fèt, nou premye jenetikman kraze B2M ak shRNA espesifik nan ovalbumin (OVA)--eksprime selil B16. shRNA-B2M te lakòz yon rediksyon 1.5-pliye nan ekspresyon OVA-H2Kb (Done Pwolonje Fig. 4d). Lè selil B{16-OVA ki te pote shFluc ak shB2M yo te enkube ak selil OT-I, nou te obsève yon diminisyon nan touye selil shB2M-B{16-OVA ki te medyatè OT-I lè nou te konpare ak shFluc-B{{63} }} Selil OVA (Done pwolonje Fig. 4e-g). Done yo sijere ke chanjman 1.5-3-pliye nan ekspresyon MHC-I kontwole pa LIMIT ta ka fonksyonèl enpòtan nan afekte aktivite CTL espesifik TAA yo. Pou valide sa, nou aktive LIMIT nan selil B16-OVA ki eksprime shellac ak shB2M. Kòm espere, aktivasyon CRISPR nan LIMIT pwovoke ekspresyon MHC-I minim nan selil shB2M, kòm konpare ak selil kontwòl (Fig. 2l). An konsekans, selil OT-I medyatè tiye timè minimòm nan selil shB2M-OVA-B16 lè yo konpare ak selil kontwòl (figi 2m, n). Done yo sijere ke LIMIT-induit ekspresyon MHC-I enpòtan nan TAA-espesifik deklanchman selil T ak fonksyon. Selil ki prezante antijèn (APCs), ki gen ladan makrofaj ak selil dendritik (DC), eksprime MHC-I, prezante antijèn ak aktive selil T TAA-espesifik yo. Nou pwolonje etid nou yo soti nan selil timè yo rive nan APC yo. IFN ki pisan ankouraje ekspresyon Limit nan DCs mwèl zo ak makrofaj (Done pwolonje Fig. 4h, i). Nou transfekte makrofaj ak siRNA ki make 5'FAM (siLIMIT). Frape desann LIMIT te lakòz pi ba ekspresyon MHC-I an repons a eksitasyon IFN, kòm konpare ak kontwòl (Done pwolonje Fig. 4j, k). Kidonk, LIMIT se yon lncRNA ki reponn IFN epi li ka ankouraje ekspresyon MHC-I nan tou de selil timè yo ak APC yo.

LIMIT amelyore iminite anti-timè

Benefis cistanche tubulosa-Antitumor

Ensifizan ekspresyon MHC-I bay timè evazyon iminitè ak rezistans iminoterapi3. Pou konprann wòl Limit nan repons iminitè anti-tumeur nan vivo, nou te vaksinen kontwòl (shFluc) ak Limit-silans (shLimit) selil timè YUMM1.7 nan NOD scid c-deficient (NSG, iminitè ensufizant) ak sovaj C57BL/6. (iminitè konpetan) sourit. Konpare ak timè kontwòl, timè shLimit YUMM1.7 te grandi konparab nan sourit NSG (Fig. 3a), tandiske pwogrese pi vit nan sourit sovaj-kalite (Fig. 3b). Anplis de sa, nou vaksinen timè shLimit CT26 nan sourit BALB/c sovaj. Yon fwa ankò, Limit silans la te lakòz kwasans timè CT26 amelyore nan modèl iminitè-konpetan (figi 3c). Done yo sijere ke Limit silans la ka afekte iminite anti-timè ak fasilite kwasans timè nan yon fason iminitè-depandan. Pou sipòte sa a, nou detekte yon rediksyon nan CD 3+, IFN +, ak TNF + T selil nan timè shLimit YUMM1.7 yo (Fig. 3d, e). Ansanm, silans Limit afekte iminite anti-timè. Pou detèmine ekspresyon MHC-I ak MHC-I: SIINFEKL in vivo, nou etabli selil YUMM1.7 ki estab ki eksprime OVA (YUMM1.7-OVA) ak transduit ak shRNA vize Limit oswa Fluc. Apre tretman IFN, nou detekte ekspresyon sifas redwi OVA-H2Kb nan selil shLimit-YUMM1.7 (Done pwolonje Fig. 5a). Nou te bay shLimit YUMM1.7-selil OVA ak selil shFluc-YUMM1.7-OVA nan sourit C57BL/6. Lè sa a, nou diseke tisi timè yo epi detekte ekspresyon H2Db ak OVA-H2Kb nan selil timè yo. Nou te obsève yon rediksyon nan H2Db ak OVA-H2Kb nan shLimit-YUMM1.7-OVA selil lè yo konpare ak selil kontwòl (Done pwolonje Fig. 5b-f). Done yo endike ke Limit ka afekte MHC-I ak MHC-I: ekspresyon antijèn nan vivo. Anplis de sa, nou te vaksinen selil B16 kontwòl (sgNT) ak Limit-aktive (sgLimit) nan sourit C57/BL6 sovaj. Kòm espere, sgLimit (Limit aktivasyon) redwi dramatikman kwasans timè (Fig. 3f). Sa a te akonpaye pa ogmante nimewo selil T timè-enfiltre ak aktivasyon (figi 3g, h). Melanom B16 se yon modèl timè relativman ensansib nan blokaj PD-L123. Konfòm ak sa a, blokaj PD-L1 echwe pou pou kontwole kwasans timè sgNT B16 nan sourit yo. Enteresan, Limit deklanchman nan timè B16 ak sgLimit sansibilize repons timè nan blokaj PD-L1, jan yo montre pa pwogresyon timè redwi (Fig. 3i). Ansanm, Limit pote iminite timè ak sansibilize repons imunoterapi timè.

LIMIT cis-aktive GBP pou ranfòse MHC-I ak iminite timè

Apre sa, nou te eksplore kijan LIMIT afekte MHC-I ak iminite timè. LncRNA yo ka kontwole lokalman ekspresyon jèn vwazen yo24. LIMIT lokalize byen nan yon gwoup jèn, pwoteyin obligatwa guanylate (GBPs), nan tou de genòm imen ak sourit (Done pwolonje Fig. 2a, b). Nou te mande si LIMIT ta ka kontwole ekspresyon GBP yo. Silans LIMIT te redwi nivo GBP mRNAs ki gen matirite yo (Fig. 4a), ak GBP 1-5 pwoteyin (Fig. 4b) nan selil A375 imen an repons a tretman IFN. Done yo sijere ke LIMIT ka ankouraje transkripsyon GBPs nan cis. Nan sipò posiblite sa a, silans Limit tou diminye ekspresyon Gbp2 nan selil sourit YUMM1.7 ak CT26 (Done pwolonje Fig. 6a, b). Anplis de sa, aktivasyon CRISPR nan Limit pwovoke ekspresyon Gbp2 nan selil B16 (figi 4c). Pou teste si LIMIT te kapab trans-reglemante GBPs, nou te fòse ekspresyon de LIMIT cDNA nan selil A375. Nou te jwenn GBP1 ak plizyè faktè iminitè (ki gen ladan IRF1, HLA-ABC, ak PD-L1) pa chanje pa LIMIT twòp ekspresyon (Done pwolonje Fig. 6c). Kidonk, LIMIT se yon lncRNA ki aji cis ki kapab pwovoke ekspresyon GBP. Pami manm fanmi Gbp, Gbp2 se yon manm fanmi Gbp dominant nan selil sourit (Done pwolonje Fig. 6d). Pou teste si LIMIT ka kontwole MHC-I atravè GBP, nou te etabli selil YUMM1.7 ki estab ki pote shellac, shLimit, shGbp2, oswa shLimit plis shGbp2. Nou te jwenn ke an repons a eksitasyon IFN, shLimit ak shGbp2 te mennen nan yon diminisyon konparab nan ekspresyon Gbp2 ak MHC-I; an menm tan silans Limit ak Gbp2 echwe pou pou anplis chanje ekspresyon Gbp2 ak MHC-I (figi 4d, e). Anplis, nou te mande si GBP twòp ekspresyon ka sove ekspresyon MHC-I downregulated-MHC-I nan Limit frape selil timè yo. Nou fòse ekspresyon GBP1 nan selil shLIMIT A375 (GBP1OE) epi nou trete selil sa yo ak IFN. Nou te obsève ke shLIMIT te lakòz ekspresyon MHC-I redwi nan selil kontwòl, men se pa nan selil GBP1OE (Done pwolonje Fig. 6e). Ekspresyon PD-L1 ak IRF1 pa te afekte pa shLIMIT oswa GBP1OE (Done pwolonje Fig. 6e, f). Kidonk, Limit ka kontwole ekspresyon MHC-I nan yon fason ki depann de GBP. Apre sa, nou te vaksinen selil YUMM1.7 ak Limit ak/oswa Gbp2-silans nan sourit C57BL/6. Silence Limit ak silans GBP yo menm jan an te lakòz kwasans timè pi rapid konpare ak gwoup kontwòl la, tandiske silans LIMIT ak GBPs an menm tan pa t 'plis afekte pwogresyon timè (Fig. 4f). Anplis de sa, nou detekte yon diminisyon nan timè-enfiltre nimewo selil T ak aktivasyon nan timè shLimit, timè shGbp2, ak timè shLimit plis shGbp2 (figi 4g ak done pwolonje fig. 6g). Ansanm, LIMIT ogmante ekspresyon MHC-I ak iminite timè nan yon fason ki depann de GBP. GBP yo se jèn ki reponn IFN nan fibroblasts25 ak macrophages26 nan yon kontèks defans lame kont patojèn. Sepandan, wòl GBP yo nan iminite kansè yo pa konnen. Etandone ke GBP yo silans redwi ekspresyon MHC-I ak deklanchman selil CD8+ T (Fig. 4g ak Done Pwolonje Fig. 6g), nou te sipoze ke GBP yo ta ka afekte efikasite iminoterapi kansè. Pou teste ipotèz sa a, nou silans Gbp2 nan selil MC38, yon modèl timè sansib a imunoterapi23. Kòm espere, silans Gbp2 nan selil MC38 redwi ekspresyon MHC-I sou tretman IFN (Fig. 4h), ak lajman anile efikasite nan blokaj PD-L1 (Fig. 4i). Sa a, ansanm ak done yo mansyone pi wo a, sijere patisipasyon nan LIMIT ak GBPs nan kontwole efikasite imunoterapi kansè. Pou sipòte posiblite sa a, analiz done klinik yo te revele ke nivo segondè nan ekspresyon GBP ki gen rapò ak LIMIT, ekspresyon MHC-I, ak repons imunoterapi (Done pwolonje Fig. 6h-j) nan pasyan ki gen melanom 14-17. Anplis de sa, nivo ekspresyon GBP yo te asosye pozitivman ak siviv pasyan (Done pwolonje Fig. 6k). Pou valide si GBP yo se jèn ki reponn IFN nan selil kansè yo, nou ankouraje selil A375 ak IFN ak lòt sitokin. GBP yo te pwovoke pa IFN, men yo te afekte pa lòt cytokin iminitè (figi 4j). Apre sa, nou te itilize sistèm CRISPR-Cas9 pou vize sekans pataje pami GBP1-5, epi nou te pwodwi GBP1-5 selil knockout (KO) A375 (Fig. 4k). Nou te obsève ke IFN mal ankouraje transkripsyon machin jèn MHC-I (figi 4l) ak pwoteyin sifas HLA-ABC nan selil GBP KO A375 (figi 4m). Se poutèt sa, LIMIT cis-aktive GBP pou ranfòse machin MHC-I ak iminite timè.

GBP yo aktive HSF1 pou ankouraje MHC-I ak iminite timè

Pou demontre kijan GBP yo ka kontwole ekspresyon MHC-I ak iminite timè, nou te fòse ekspresyon GBP nan selil A375 yo. Enteresan, twòp ekspresyon nan GBP ogmante ekspresyon MHC-I imen - jan yo montre nan qRT-PCR (Fig. 5a), tach sifas manbràn (Fig. 5b), ak Western blotting (Fig. 5c). Done yo sijere ke GBP yo ka aktive MHC-I nan nivo transcriptional la. Toujou, twòp ekspresyon nan Gbp2 ogmante ekspresyon sourit MHC-I nan selil YUMM1.7 ak B16 (figi 5d). Pou idantifye faktè transkripsyon (yo) ki kontwole MHC-I atravè GBP an repons a IFN, nou te fè prediksyon byoenfòmatik ak PROMO27. Nou jwenn 8 faktè transkripsyon ki chanje pa IFN nan selil A375, ki ka vize HLA-ABC, HSPA5, CALR, ak TAP1. Anplis plizyè faktè byen li te ye, aktivite HSF1 te trè pwovoke pa IFN (Done pwolonje Fig. 7a). Lè nou trete seri done ChIP-seq nan ENCODE28, nou te jwenn ke tou de STAT1 ak HSF1 te rich nan pwomotè jèn MHC-I ki asosye ak diferan modèl obligatwa (Done pwolonje Fig. 7b). Nou te fè tès ChIP ak antikò anti-HSF1 nan selil A375 ki ankouraje IFN. HSF1 te rich nan pwomotè HLA-ABC, HSPA5, CALR, ak TAP1, men se pa HPRT1, yon kontwòl negatif (figi 5e). Rezilta yo sijere ke HSF1 se yon faktè transcription pou MHC-I. HSF1 anjeneral aktive pa entèripsyon proteostaz29. Pou teste si deklanchman HSF1 ap amelyore ekspresyon MHC-I, nou te trete selil A375 ak yon lis estrès30: chòk chalè, estrès oksidatif (Luperox), inibitè tradiksyon (puromicin), proteazòm (MG-132), ak chaperone (17-AAG). Enteresan, sa yo estrès inivèsèl ankouraje ekspresyon MHC-I - tandiske KRIBB11, yon inibitè HSF1, redwi efè sa a (figi 5f ak done pwolonje Fig.7c). Kidonk, aktivasyon HSF1 jeneralman pwovoke ekspresyon MHC-I. Apre sa, nou te mande si GBP yo ka aktive HSF1. Ekspresyon fòse GBP pwovoke aktivite luciferase HSF1 repòtè HSE-Luc (figi 5g), osi byen ke fosforilasyon HSF1 (figi 5h). Sa a sijere ke GBP yo ka aktive HSF1. IFN echwe pou pou pwovoke ekspresyon HSPA5 nan selil GBP-KO A375 (figi 5i). Kidonk, IFN aktive HSF1 pa pwovoke ekspresyon GBP. Anplis de sa, tretman ak KRIBB11, yon inibitè HSF1, anile regilasyon MHC-I medyatè pa overexpression GBP1 (figi 5j). Kidonk, GBP yo ankouraje ekspresyon MHC-I nan yon fason ki depann de HSF1-. Pou solidifye relasyon mekanistik ant GBP ak HSF1, nou fèmen bouch Gbp2 ak / oswa Hsf1 nan selil MC38 (figi 5k). Lè yo fin fè tretman IFN, silans Gbp2 oswa Hsf1 pou kont li diminye ekspresyon MHC-I, men an menm tan silans Gbp2 ak Hsf1 echwe pou pou anplis modile ekspresyon MHC-I (figi 5l). Pou demontre enpòtans fonksyonèl entèaksyon ant GBP ak HSF1 nan iminite timè, nou vaksinen selil timè MC38 ki eksprime shellac, shGbp2, shHSF1, oswa shGbp2 plis shHSF1 nan sourit C57BL/6. An konparezon ak kontwòl shFluc, silans Gbp2 ak silans Hsf1 konparab akselere kwasans timè (figi 5m), ak diminye nimewo selil T timè-enfiltre ak aktivasyon (figi 5n ak done pwolonje figi 7d). Anplis, an menm tan silans Gbp2 ak Hsf1 echwe pou pou plis afekte kwasans timè ak timè-enfiltre selil T (figi 5m, n ak done pwolonje Fig. 7d). Ansanm, GBP yo ankouraje ekspresyon MHC-I ak iminite antitumoral lè yo aktive HSF1.

LIMIT-GBP-HSF1 aks kondwi MHC-I ak iminite timè

benefis cistanche pou gason-ranfòse sistèm iminitè

Apre sa, nou te egzamine kijan GBP yo aktive HSF1 pou chanje ekspresyon MHC-I ak iminite timè. Nan kondisyon nòmal, HSF1 monomerik asosye ak siprime pa chaperon, tankou HSP9031. Entèripsyon entèraksyon yo pèmèt trimerization ak akimilasyon HSF1 nan nwayo a, sa ki lakòz aktivasyon transkripsyon jèn sib li yo32. Nou te sipoze ke GBP yo ka deranje asosyasyon ki genyen ant HSP90 ak HSF1, sa ki lakòz deklanchman HSF1. Pou teste posibilite sa a, nou te trete selil A375 ak IFN epi nou te fè Co-IP ak yon antikò HSP90. Nou te jwenn IFN-induced GBP andojèn yo te asosye ak HSP90 (Fig. 6a). Anplis de sa, nou transfekte selil A375 ak ekzojèn Flag-GBP1 epi fè eksperyans Co-IP ak Flag-antikò. HSP90 te detekte nan pwodwi IP a soti nan Flag-GBP1 selil transfekte, men se pa selil kontwòl vektè transfekte (figi 6b). Tach imunofluoresan te demontre ke GBPs ak HSP90 yo te lajman ko-lokalize nan sitoplasm la (Fig. 6c). Lè nou transfekte selil 293T ak ogmante dòz GBP1 plasmid, HSP{30}}asosye HSF1 te redwi nan yon fason ki depann de dòz (figi 6d). Done yo sijere ke GBP kominike avèk HSP90 ak entèraksyon sa a deranje asosyasyon ki genyen ant HSF1 ak HSP90. HSP90 se yon chaperone pou plisman pwoteyin miltip ak estabilite, nou te kesyone si GBP yo ka chanje aktivite chaperone nan HSP90. Malgre ke HSP90 inibitè siprime ekspresyon an nan pwoteyin kliyan HSP90 (tankou RAF1, BCL2, ak CDK433), twòp ekspresyon nan GBPs echwe pou pou fè sa (Fig. 6e). Kidonk, GBP yo kominike avèk HSP90, epi yo lage HSP90-HSF1 ki asosye, men yo pa chanje aktivite HSP90. Lè sa a, nou dirèkteman egzamine wòl HSF1 nan ekspresyon MHC-I. Nou trete selil A375 ak IFN nan prezans HSF1 inhibitor KRIBB11. Kòm espere, tretman ak KRIBB11 redwi ekspresyon mRNA stimulé IFN nan jèn ki gen rapò ak MHC-I, ki gen ladan HLA-ABC, TAP1, HSPA5, ak CALR, men se pa IRF1 (figi 6f). Enteresan, KRIBB11 redwi ekspresyon IFN-induced MHC-I, men li te gen yon efè minim sou ekspresyon PD-L1 (figi 6g). Kidonk, HSF1 ka kontwole ekspresyon IFN-induit MHC-I san yo pa chanje siyal IFN mondyal la. Pou envestige si HSF1-regleman MHC-I te fonksyonèl, nou kiltive B{16-OVA ak selil OT-I nan prezans KRIBB11 ak IFN. KRIBB11 inibit ekspresyon IFN-induced nan OVA-bound MHC-I (Done pwolonje Fig. 8a). Nan liy ak sa a, KRIBB11 tou siprime OT-I selil-medyatè efè sitotoksik sou B 16- OVA (Done pwolonje Fig. 8b). Pou pwolonje obsèvasyon nou yo nan timè adisyonèl, nou silans Hsf1 ak shHsf1 nan selil YUMM1.7 ak CT26. Silans Hsf1 te lakòz diminye ekspresyon MHC-I nan YUMM1.7 (Fig. 6h, i) ak selil CT26 (Done Pwolonje Fig. 8c) an repons a eksitasyon IFN. Nan selil YUMM1.7, silans HSF1 echwe pou pou afekte ekspresyon Gbp2 an repons a IFN (Fig. 6h), ki endike ke Gbp2 se pa yon jèn sib HSF1. Nan selil shHsf1 YUMM1.7, KRIBB11 echwe pou pou siprime ekspresyon IFN-stimulated MHC-I (Done pwolonje Fig. 8d). Done yo sijere ke HSF1 amelyore ekspresyon MHC-I an repons a IFN, ak Hsf1 se sib mekanik nan KRIBB11 kontwole MHC-I. Etandone ke HSF1 afekte ekspresyon MHC-I, nou te ipotèz ke HSF1 reglemante iminite anti-timè nan vivo. Pou teste ipotèz sa a, nou te vaksinen kontwòl ak selil timè shHsf1 YUMM1.7 nan sourit NSG ak C57BL/6. Nou te obsève ke silans HSF1 pasyèlman ralanti pwogresyon timè YUMM1.7 nan sourit NSG (Fig. 6j), sipòte ke Hsf1 te ede kenbe omeyostazi pwoteyin ak pwogresyon timè nan modèl la iminitè-defisi. Sepandan, silans Hsf1 dramatikman akselere kwasans timè YUMM1.7 nan sourit sovaj C57BL / 6 (figi 6k). Done yo endike ke Hsf1 ka etonan ankouraje yon pisan iminite anti-timè nan modèl iminitè-konpetan an. Pou sipòte sa, nou te detekte yon rediksyon nan pousantaj nan timè-enfiltre CD3+, Ki{67+, IFN +, ak TNF + T selil (figi 6l ak done pwolonje fig. 8e) nan timè yo shHsf1 YUMM1.7 kòm konpare ak kontwòl shFluc scramble. Anplis de sa, nou vaksinen selil shHsf1 CT26 nan sourit sovaj BALB/c. Yon fwa ankò, silans Hsf1 te lakòz kwasans timè CT26 amelyore (Done pwolonje Fig. 8f). Sa a te akonpaye pa yon rediksyon nan pousantaj yo nan timè-enfiltre CD3+, Ki{67+, IFN +, ak TNF + T selil (Done pwolonje Fig. 8g, h). Ansanm, done yo sijere ke aks GBP-HSF1 kondwi ekspresyon MHC-I ak iminite antitumoral. Pou konekte mekanikman Hsf1 ak LIMIT, nou fèmen bouch LIMIT nan selil A375. Silans LIMIT redwi aktivite transkripsyon HSF1 an repons a IFN, jan yo detèmine pa tès repòtè luciferase (HSE-luc) (Fig. 6m). Done yo sijere LIMIT kontribye nan aktivasyon HSF1 an repons a IFN. Pou teste yon patisipasyon potansyèl HSF1 nan endiksyon MHC-I ki te medyatè LIMIT, nou te ankouraje LIMIT atravè deklanchman CRISPR nan selil B16, nan prezans KRIBB11. Nou te obsève ke MHC-I upregulation, pwovoke pa LIMIT-aktivasyon, te anile pa yon inibitè HSF1 (Fig. 6n). Done yo sijere ke LIMIT ranfòse ekspresyon MHC-I nan yon fason ki depann de HSF1-. Finalman, nou analize yon lyen ant LIMIT, GBPs, ak HSF1 nan yon kontèks ekspresyon MHC-I, iminite timè, ak imunoterapi nan pasyan ki gen kansè. Analiz klinik te montre ke jèn siyal HSF1-korele ak ekspresyon MHC-I, enfiltrasyon CD8+ selil T, ak siviv pasyan (Done pwolonje Fig. 9a-c). Nan yon etid blokaj iminitè nan pasyan ki gen karsinom selil fondamantal34, analiz RNA-sekans yon sèl selil revele 2 grap timè; yon gwoup timè te pi sansib a tretman anti-PD-1 jan yon popilasyon timè ki te redwi anpil (Done Pwolonje Fig. 9d). Enteresan, gwoup timè ki sansib pou pòs iminitè sa a te eksprime pi wo nivo jèn siyal HSF1-yo ansanm ak machin jèn MHC-I (Done Pwolonje Fig. 9e). Anplis, nan yon etid blokaj iminitè nan pasyan ki gen melanoma35, analiz pwoteomik te demontre ke ekspresyon pwoteyin GBPs, jèn siyal HSF1, ak MHC-I te pi wo nan sekouris klinik pase sa yo ki pa reponn (Done pwolonje Fig. 9f). Anplis de sa, nou te obsève yon korelasyon pozitif ant GBP1 ak HSF 1-jenn siyal nan kansè imen (Done pwolonje Fig. 9g). Done yo sipòte ke LIMIT-GBP-HSF1 aks la ka aktive ekspresyon MHC-I, ak favorize iminite anti-timè (Done pwolonje Fig. 10).

Diskisyon

Chinwa zèb cistanche plant-Antitumor

Moun gen 30,000-60,000 lncRNA. Sepandan, idantite yo ak fonksyon byolojik vas majorite nan lncRNA potansyèl sa yo rete mal konprann. Nan jaden byoloji kansè, lncRNA yo te lajman etidye nan modèl iminitè-defisi a, kite yon espas konesans nan lncRNAs nan yon kontèks sistèm iminitè a. Yo rapòte yon ti ponyen lncRNA yo afekte fonksyon selil iminitè36,37, pwogresyon kansè, ak efikasite chimyoterapi38,39. Sepandan, si wi ou non espesifik lncRNA yo patisipe nan iminite antitumoral ak repons iminoterapi rete san repons. Nan etid sa a, nou te idantifye ke LIMIT se yon lncRNA ki te reponn IFN ki te deja pa karakterize nan tou de selil imen ak sourit. LIMIT ka pwovoke ekspresyon MHC-I ak MHC-II, pwomouvwa repons iminitè timè T ki te medyatè ak amelyore efikasite iminoterapi. Kidonk, LIMIT se yon lncRNA imunogenik timè yo pa konnen. Chemen siyal IFN jwe yon wòl kle nan detèmine repons ki ka geri nan imunoterapi kansè40 atravè mekanis miltip19,20,41,42. Mitasyon jenetik nan jèn siyal IFN kontribye nan rezistans blokaj pòs nan pasyan ki gen kansè 43-48. Sepandan, siyal IFN ka pwovoke ekspresyon inhibitor PD-L149. Pakonsekan, li ideyal pou idantifye ak vize yon jèn kle siyal IFN ki oaza medyatè iminite anti-timè, olye ke levasyon iminitè timè. Nan liy ak nosyon sa a, nou demontre ke LIMIT medyatè MHC-I ak MHC-II regilasyon, men li pa afekte ekspresyon PD-L1 an repons a IFN. Kidonk, LIMIT ka yon pozisyon inik pou yon sib iminojèn pou iminoterapi kansè. Yo te pwopoze plizyè estrateji pou vize lncRNAs patojèn50. Sepandan, ki jan yo elve nivo lncRNAs benefisye rete difisil. Kòm lncRNAs ki aji cis fonksyone lokalman, ekspresyon fòse nan lncRNAs sa yo ka pa kapab lokalize jisteman51. Pandan ke lncRNAs trans-aji ka fonksyone atravè estrikti segondè espesifik, ekspresyon twòp nan lncRNA sa yo ka pa kapab jenere estrikti natirèl yo akòz manke chaperon RNA apwopriye52. Lè nou itilize yon estrateji aktivasyon CRISPR ki gide RNA22, nou dirèkteman aktive ekspresyon LIMIT nan selil timè yo nan modèl preklinik. Aktivasyon CRISPR LIMIT ki gide RNA ka kondi ekspresyon timè MHC-I ak potensye terapi blokaj pòs. Etandone ke pèt nan siyati jèn MHC-I ak IFN souvan rive nan timè imen, nou sijere ke deklanchman CRISPR nan lncRNAs benefisye, tankou LIMIT, ka sove ekspresyon timè MHC-I epi yo dwe yon potansyèl apwòch terapetik. Pandan n ap chèche mekanis ki LIMIT afekte iminite timè a, nou te elisid ke LIMIT vize GBP yo nan yon fason cis. GBP yo jwe yon wòl nan iminite natirèl26,53,54. Sourit ki manke tout gwoup Gbps manifeste move repons anti-Toxoplasma gondii55. Sepandan, anvan travay nou an, koneksyon mekanik ant LIMIT ak GBP yo, ak fonksyon byolojik GBP yo nan iminite timè ak iminoterapi yo te endetèmine. Nou te dekouvri ke GBP yo obligatwa pou ekspresyon MHC-I timè IFN-induit, efikasite nan touye selil CD8+ T, ak terapi efikas pòs. Done yo sijere ke GBP yo se jèn potansyèl sib pou ranfòse iminojenisite timè. Nou te dekouvri san atann ke GBP yo aktive HSF1 pou ankouraje ekspresyon jèn ki gen rapò ak MHC-I ak MHC-I. Aktivasyon HSF1 medyatè pa inibitè HSP90 korelasyon ak kontwòl timè nan modèl imunokonpetan. Sepandan, malgre plizyè esè klinik ak inibitè HSP90, okenn nan inibitè HSP90 evalye yo pa te apwouve pa FDA pou terapi kansè, jiskaprezan. Reyalite enèvan sa a ogmante posibilite ke inhibiteurs HSP90 ka prejidis pou iminite timè. Toksisite inibitè HSP90 sa yo ka ankouraje destriksyon plizyè pwoteyin kliyan HSP90, tankou RAF1 ak BCL2, ki ka kritik pou pwopagasyon selil T effector ak siviv59,60. Etandone ke GBP yo kominike ak HSP90 epi yo lage HSP90-dekoy HSF1, men yo pa chanje aktivite HSP90, done nou yo sijere ke vize GBP yo ka yon estrateji anvan yo pa apresye ak san danje pou aktive HSF1 pou iminoterapi kansè. An rezime, nou idantifye LIMIT kòm yon lncRNA iminojenik kansè ki pa konnen deja. Travay nou an sijere ke vize aks siyal LIMIT-GBP-HSF1 ka sove ekspresyon ak fonksyon MHC-I, ki prezante yon apwòch imunoterapi pwomèt kansè.

Metòd

Eksperyans sou bèt

NSG fi sis a uit semèn (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, # Stock 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, # Stock 000664), BALB/c (BALB). /cJ, Stock# 000651), ak OT-1 (C57BL/{6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) yo te jwenn sourit nan Jackson Laboratory. Tout sourit yo te kenbe nan kondisyon san patojèn. Chanm bèt la gen yon tanperati kontwole (18-23 degre ), imidite (40-60%), ak yon sik 12 limyè/12 fè nwa. YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2.5 × 106), ak B16 (1 × 105) selil yo te enjekte anba lar nan bò dwat sourit yo. Pou tretman anti-PD-L1 nan modèl MC38, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) ak antikò kontwòl (InVivoMAb, LTF-2) yo te administre intraperitoneally nan jou 6, 9, ak 12 apre inokulasyon timè. Pou tretman anti-PD-L1 nan modèl B16, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) ak antikò kontwòl (InVivoMAb, LTF-2) yo te administre intraperitoneally nan jou 0, 3, 6, 9, 12 ak 15 apre inokulasyon timè. Dyamèt timè yo te mezire lè l sèvi avèk konpa. Volim timè yo te kalkile pa Longè × Lajè × Lajè / 2. Etid sou bèt yo te fèt anba apwobasyon Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan University of Michigan (PRO00008278). Etid la konfòme ak tout règleman etik ki enpòtan konsènan rechèch sou bèt. Nan okenn nan eksperyans yo, gwosè timè xenograft pa t depase 2 cm nan nenpòt dimansyon, e pa gen okenn bèt ki te gen gwo distenksyon nan vant (pi gran pase oswa egal a 10% ogmantasyon pwa kò orijinal la). Gwosè echantiyon an te chwazi ki baze sou done preliminè. Apre inokulasyon timè, sourit yo te owaza epi yo te asiyen nan diferan gwoup pou tretman.

Reyaktif

KRIBB11 ak 17-AAG yo te achte nan men Cayman Chemical. MG-132, Puromycin, ak Luperox te soti nan Sigma-Aldrich. IFN moun recombinant (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL), ak IFN sourit (485-MI) te soti nan R&D.

Plasmid

Pou jenere HSE-LUC, sekans ADN ki koresponn ak eleman chok chalè (HSE) yo te sentèz, rkwit, ak ligasyon nan yon plasmid PGL3-debaz (Promega). FLAG-HSF1 se te yon kado Stuart Calderwood (Addgene #32537). Pou ekspresyon fòse GBP1, GBP2, GBP5 ak sourit Gbp2 imen, yo te PCR anplifye sekans kodaj respektif nan cDNA ki te pwodwi nan selil IFN A375 pretrete oswa selil B16 epi imedyatman mete nan plasmid PCI-Flag. Plasmid PCI-Flag te prepare lè w mete sekans Kozak sa a plis tag Flag plis 5 × sekans Glycine nan plasmid PCI-neo (Promega) ant NheI ak XhoI. Pou kraze moun LIMIT ak sourit LIMIT, shRNA yo te fèt epi antre nan plasmid PLKO.1 (Addgene #10879). shRNA ki vize luciferase koukouy (shFluc) te sèvi kòm yon kontwòl negatif. Pou vize rejyon pwomotè Limit pou aktivasyon CRISPR, sgRNAs (sgLimit) yo te fèt epi mete nan plasmid phU6- sgRNA (Addgene #53188). SgRNA ki pa vize a (sgNT) te sèvi kòm yon kontwòl negatif. Pou efase sit obligatwa STAT1/IRF1 nan pwomotè LIMIT la, yo te fèt sgRNA pè (psgLIMIT) epi mete yo nan plasmid PX459 (Addgene #48139). Pou frape sourit Hsf1 ak Gbp2, shRNA yo te fèt epi yo te mete nan plasmid PLKO.1 (Addgene #10879). Pou frape GBP1-5, sgRNA te fèt epi mete nan plasmid PX459 (Addgene #48139). Sekans sib yo ki nan lis nan Tablo Siplemantè 7. Sekans premye yo ki nan lis nan Tablo Siplemantè 8.

Kilti Selil

Liy selil melanom imen A375 (CRL-1619), liy selil melanom sourit, B16-F0 (CRL-6322) ak YUMM1.7 (CRL-3362 ), liy selil kansè kolon sourit CT26 (CRL-2638), ak 293T (CRL-3216) yo te achte nan men American Type Culture Collection (ATCC). Liy selil kansè kolon sourit MC38 te itilize deja nan laboratwa Zou23,48. Selil B16- OVA yo te etabli jan yo te rapòte deja42. A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO, ak liy selil efase pwomotè A375 LIMIT yo te pwodwi nan etid sa a. Tout liy selil yo te teste pou kontaminasyon mycoplasma regilyèman epi konfime negatif pou mycoplasma. Selil yo te kiltive nan mwayen RMPI (Gibco #11875) complétée ak 10% FBS, eksepte selil A375 ak 293T, lèt 2 liy yo te kiltive nan DMEM (Gibco #11965) complétée ak 10% FBS. Tout selil yo te kenbe nan 37 degre ak 5% CO2. Pou chòk chalè, selil yo te mete nan yon enkibatè a 43 degre ak 5% CO2 pou 2 èdtan. Pou jenere liy selil knockdown, patikil lentiviral yo te pwodwi pa transfeksyon nan plasmid PLKO.1 shRNA ak psPAX2 (Addgene #12260) ak pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) nan selil 293T, epi imedyatman transdui nan timè. selil ak polybrene (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) lannwit lan. 48 èdtan apre transfeksyon, selil yo te chwazi ak puromicin (1-2 ug/ml) pou yon lòt 2 semèn. Pou etabli liy selil knock-out, PX459- plasmid sgRNA yo te transfekte nan selil timè yo pou 2 jou epi yo te chwazi pa puromicin ({1-2 ug/ml) pou yon lòt 2 jou. Lè sa a, selil yo te seri dilye epi simen nan 96 plak byen. Apre 2-3 semèn, koloni sèl selil yo te disosye ak re-plake nan 6 plak byen. Lè selil konfluans, mwatye nan selil yo te rekòlte ak valide pou efikasite knock-out (KO) atravè Western blotting. Pou aplike sistèm aktivasyon CRISPR pou aktive Limit sourit, yo te transfekte phU6-sgRNA ansanm ak SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) nan selil B16. Tout transfèksyon yo te fèt ak lipofectamine 2000 (Thermofisher) nan yon rapò 1 ug plasmid: 2 ul transfèksyon regent. Dòz transfèksyon an te detèmine pa titrasyon.

Esè aktivite lisiferaz

Selil A375 yo te transfekte ak HSE-LUC ak PRL-SV40P (Addgene #27163) pou 24 èdtan, ansanm ak PCI-neo (vektè) oswa GBP1, GBP2 pou 48 èdtan. Selil A375 shFluc oswa A375 shLIMIT yo te transfekte ak HSE-LUC ak PRL-SV40P (Addgene #27163) pou 24 èdtan epi yo te trete ak IFN pou yon lòt 48 èdtan. Aktivite luciferase pou luciferase koukouy (HSE-LUC) ak renilla luciferase (PRL-SV40P) te mezire ak Doub-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Aktivite luciferase relatif koukouy te nòmalize ak aktivite luciferase renilla.

Tach sifas ak analiz sikometri koule (FACS)

Selil yo te trypsinize epi lave ak tanpon MACS (PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA). Yo te fè tach sifas lè yo ajoute antikò sa yo nan sispansyon selil la nan 50 ul tanpon MACS: anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anti-OVA-H{2-Kb (eBio25-D1.16, eBiosyans), ak anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Apre enkubasyon pou 30 minit, selil yo te lave ak tanpon MACS epi analize yo sou yon sitomèt koule BD Fortessa.

Kantite PCR (qPCR) analiz

Total RNA te izole nan selil yo pa pirifikasyon kolòn (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) ak tretman DNase. cDNA te sentèz lè l sèvi avèk RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) ak primè hexamer o aza. Yo te fè PCR quantitative (qPCR) sou cDNA lè l sèvi avèk Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) sou yon Sistèm PCR an tan reyèl StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). Ekspresyon jèn yo te mezire lè l sèvi avèk premye ki nan lis Tablo Siplemantè 8. Chanjman pliye nan ekspresyon mRNA yo te kalkile pa metòd ΔΔCt lè l sèvi avèk ACTB kòm yon kontwòl andojèn. Rezilta yo eksprime kòm chanjman pli pa nòmalize nan kontwòl yo.

Nò bloke

Yo te fè analiz Northern blot ak 10 ug total de RNAs ki te prepare nan selil A375 ki te deja trete IFN, IFN ak TNF. RNA yo te rezoud pa elektwoforèz jèl agarose denaturasyon (Ambion) epi yo transfere nan manbràn Hybond-XL (GE Healthcare). LIMIT te detekte lè l sèvi avèk sond ADN ki make digoxin ak DIG Northern Starter Kit (Roche). Sekans sond ki vize LIMIT yo endike nan Tablo Siplemantè 7.

Rapid anplifikasyon nan fen cDNA (RACE)

Yo te fè RACE pou idantifye pwent cDNA LIMIT imen oswa Limit sourit ak SMARTer RACE cDNA Anplifikasyon Twous (Clontech). Prensip yo pou RACE yo ki nan lis nan Tablo Siplemantè 8.

Klonaj tout longè LIMIT

Apre w fin jwenn sekans fen cDNA yo, LIMIT tout longè yo te PCR anplifye epi mete nan plasmid PCI-neo ant XhoI ak NotI. Premye klonaj pou LIMIT imen ak Limit sourit yo endike nan Tablo Siplemantè 8.

Fraksyon selilè pou RT-PCR

Selil A375 IFN pretrete yo te kolekte nan plak 15 cm pa grate epi lave yon fwa ak PBS frèt. Selil yo te granules pa santrifujasyon nan 700 g pou 5 minit epi liz ak tanpon liz ipotonik (10 mM Tris (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.3% (vol/vol) NP{{ 12}}, 10% (vol/vol) gliserin) pou kolekte fraksyon sitoplasmik la. Sitoplasmik RNA te jwenn nan presipitasyon etanòl lannwit lan nan -20 degre, ki te swiv pa re-ekstraksyon lè l sèvi avèk reyaktif TRIZOL. Granules nikleyè ki rete a te lave twa fwa ak tanpon lysis hypotonic, ki te swiv pa fè ekstraksyon ak réactif TRIZOL selon enstriksyon manifakti a. RNAs izole nan fraksyon nikleyè oswa sitoplasmik yo te transkri anvè ak RT-PCR pou LIMIT ak primè ki endike yo. ACTB ki pa splis oswa ki gen matirite yo te itilize kòm kontwòl pou RNA nikleyè oswa sitoplasmik. Prensip yo pou ACTB yo ki nan lis nan Tablo Siplemantè 8.

Lwès blotting

Selil yo te lave nan PBS frèt ak lysed nan 1 × RIPA lysis tanpon (Pierce) ak 1 × inibitè proteaz (Pierce). Lysates yo te enkube sou glas pou 10 minit epi netwaye pa santrifugasyon nan 15,000g pou 15 minit. Konsantrasyon pwoteyin yo te mezire lè l sèvi avèk yon twous tès pwoteyin BCA (Thermo Fisher). Trant mikrogram pwoteyin te melanje ak echantiyon tanpon (Thermo Fisher) ak -ME ak denatire nan 95 degre pou 5 minit. Echantiyon an te separe pa SDS-PAGE epi transfere nan yon manbràn Nitrocellulose (Bio-Rad). Manbràn yo te bloke ak 5% w / v lèt sèk ki pa gen anpil grès ak enkubasyon ak antikò prensipal lannwit lan nan 4 degre ak HRP-konjige antikò segondè (CST) pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Siyal la te detekte lè l sèvi avèk Clarity and Clarity Max Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad) epi yo te kaptire lè l sèvi avèk ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Antikò yo te jan sa a: anti-moun GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1: 500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1: 1,000), anti-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1: 1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1: 1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1: 1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1: 1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1: 1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1: 1 ,000), anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000), ak anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5,000). Pou moun MHC-I Western blotting, total selil lysates yo te denatire nan tanpon echantiyon an san yo pa -ME (ki pa diminye) pou kenbe pon yo disulfide ak konfòmasyon nan pwoteyin yo dwe detekte pa anti-HLA-ABC antikò (W6/32). , Novus Biologicals, 64775, 1: 1,000).

Ko-iminopresipasyon (Ko-IP)

Selil yo te kolekte ak IP lysis tanpon (Pierce, 87787) plis inibitè proteaz. Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine ak yon twous tès pwoteyin BCA. 200-500 echantiyon pwoteyin ug yo te ajoute nan 1-3 antikò prensipal ug anti-HSP90 (Proteintech, 13171) oswa anti-HSF1 (CST, 12972), epi yo te enkube ak dou balanse nan 4 degre lannwit lan. Lè sa a, echantiyon yo te plis enkubasyon ak 20 ul Pwoteyin A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc-2003) pou 2 èdtan nan 4 degre; epi santrifuje nan 7500 ×g pou 30 segonn nan 4 degre. Granules selil yo te lave 4 fwa ak IP lysis tanpon, resuspended ak 40 ul 2 × echantiyon tanpon ak -ME, ak chofe pou 5 minit nan 95 degre. Echantiyon pwoteyin denatire yo te analize pa Western blot. Pou Flag IP, lysates selil yo te enkube ak 20 ul EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) epi lave, denatire, epi analize jan sa dekri pi wo a.

Tach imunofluoresan

Selil A375 ki te monte sou kouvèti yo te trete ak IFN pou 24 èdtan. Apre yo fin lave 2 fwa ak PBS, selil yo te fiks ak 4% PFA pou 15 minit epi lave 2 fwa ak PBS pou 5 minit chak. Lè sa a, selil yo te pèmeabilize ak 0.5% triton x-100 nan PBS pou 10 minit epi rense 2 fwa ak PBS pou 5 minit chak. Antijèn yo te bloke ak 10% serom kabrit nòmal nan PBS pou 30 minit. Lè sa a, antikò prensipal yo te ajoute nan dilusyon 1:50 nan antikò sourit anti-moun GBP1-5 (Santa Cruz, 166960) oswa lapen anti-moun antikò HSP90 (CST, 4877), epi enkubate nan 4 degre lannwit lan. Apre sa, selil yo te lave ak enkubasyon ak dilusyon 1:500 Qdot 605 ki make antikò kabrit segondè anti-sourit (Thermo Fisher, Q11002) oswa AF488-antikò segondè kabrit anti-lapen ki make (Thermo Fisher, A11034), ak Lè sa a, monte sou glisad vè ak reyaktif ProLong Gold ki gen DAPI. Imaj fluoresans konfokal yo te kolekte lè l sèvi avèk yon objektif imèsyon lwil oliv 63X (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM konfokal).

Chromatin imunopresipitasyon (ChIP)

ChIP yo te fèt ak kromatin relye soti nan selil A375 trete IFN ak swa HSF1 antikò (CST, 12972) oswa nòmal lapen IgG (CST, 2729), lè l sèvi avèk Senp ChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Twous (Pèl mayetik) (CST, 9005). ADN anrichi a te quantifye pa PCR an tan reyèl lè l sèvi avèk primè yo ki nan lis nan Tablo Siplemantè 8. Kantite ADN imunoprecipitated nan chak echantiyon te reprezante kòm yon siyal parapò ak kantite total chromatin antre, ki ekivalan a 1.

Izolasyon selil OT-I ak ko-kilti ak selil timè OVA+

C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) sourit (JAX stock #003831) yo te achte nan men Jackson Laboratory. Larat la te omojeneize, epi selil sèl yo te sispann nan 2 ml Red Blood Cell Lysis Buffer (Sigma-Aldrich) pou 1 minit. Splenosit yo te granules, lave, epi repoze nan 2 × 106 selil pou chak ml nan mwayen kilti RPMI ki gen 1 ug/ml OVA257-264 peptide, 5 ug/ml sourit recombinant IL-2, ak 40 μM { {15}} mercaptoethanol. Selil yo te enkube a 37 degre pou 5 jou. Pou etabli ko-kilti OT-I ak OVA+ selil timè yo, yo te kolekte splenosit apre 5-aktivasyon jou. Selil OT-I yo te pirifye lè l sèvi avèk EasySep sourit CD8+ T Cell Isolation Kit (Stemcell). Selil B16-OVA yo te simen lannwit lan. Lè sa a, selil OT-I yo te ajoute nan kilti a nan diferan rapò. Tout selil yo te kolekte pa trypsinization ak analize pa flow cytometry (FACS).

Selil dendritik mwèl zo yo (BMDC) ak makrofaj (BMDM)

Te mwèl zo izole nan femur sourit C57BL / 6 ak kiltive nan medya konplè RPMI1640 ak 20 ng / ml GM-CSF (R & D). Selil yo te enkube nan 37 degre ak 5% CO2. Yon lòt 10 ml mwayen ak 20 ng/ml GM-CSF te ajoute nan jou 3. Nan jou 7, selil ki pa aderan ak ki lach aderan nan supernatant kilti a te rekòlte pa lave dou ak PBS, epi yo konsidere kòm BMDCs. Selil aderan yo te konsidere kòm BMDM.

Profilage selil iminitè intratumoral

Pou evalye selil T intratumoral yo ak ekspresyon cytokine efèktè selil T yo, yo te prepare sispansyon yon sèl selil nan tisi timè fre lè yo pase fizikman nan 100 μm selil selil yo. Selil iminitè yo te anrichi pa santrifujasyon gradyan dansite. Pou tach cytokine, selil iminitè intratumoral yo te enkube nan mwayen kilti RPMI ki gen PMA (5 ng/ml), ionomycin (500 ng/ml), brefeldin A (1: 1, 000), ak Monessen (1: 1). ,000) nan 37 degre pou 4 èdtan. 2-3 ul nan Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 ({145-2C11, BD). Biosciences), anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences), ak anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) antikò yo te ajoute pou 20 minit pou tach sifas yo. Lè sa a, selil yo te lave ak resuspended nan 1 ml nan frèch prepare solisyon Fix / Perm (BD Biosciences) nan 4 degre lannwit lan. Apre yo fin lave ak tanpon Perm/Wash (BD Biosciences), selil yo te tache ak 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP{6-XT22, BD Biosciences), ak anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) pou 30 minit, lave, epi fikse nan fòmaldeyid 4% (Sigma Aldrich). Tout echantiyon yo te li sou yon sitomèt LSR Fortessa epi yo te analize ak lojisyèl FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Kalkil nòt siyati

Nou itilize ekspresyon jèn nòmal pou defini siyati sa yo: CD8+ enfiltrasyon selil T (CD8A, CD8B, PRF1, ak GZMB), ekspresyon MHC-I (HLA-A, HLA-B, ak HLA-C) , ak siyal HSF1 (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5, ak HSP90B1).

Analiz estatistik

Pou eksperyans ki baze sou selil yo, yo te fè triple byolojik nan chak eksperyans sèl an jeneral, sòf si yo di otreman. Pou etid sou bèt yo, yo te anplwaye pa mwens pase 5 replike pou chak gwoup. Bèt yo te randomized nan diferan gwoup apre inokulasyon selil timè. Envestigatè yo pa te avèg nan alokasyon pandan eksperyans ak evalyasyon rezilta yo. Done yo montre kòm valè mwayèn ak derivasyon estanda. Analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Yo te itilize tès t de 2-kot pou konpare gwoup tretman ak gwoup kontwòl; Metòd Kaplan-Meier te estime fonksyon siviv e yo te itilize tès log-rank pou kalkile diferans estatistik yo.

Done disponiblite

Done RNA-seq (GSE99299) ak done sèl selil trete (GSE123814) yo te jwenn nan Gene Expression Omnibus (GEO). Done MS proteomik (PXD006003) yo te jwenn nan depo PRIDE. Ansanm done kansè TCGA yo te jwenn nan UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/). Done RNA-seq ak enfòmasyon klinik pou esè klinik ICB yo te bay otè respektif korespondan yo. Tout done anvan tout koreksyon ki sipòte rezilta etid sa a disponib nan men otè ki koresponn lan sou demann. Done sous yo bay nan papye sa a.

Disponibilite kòd

Tout analiz yo itilize nan etid sa a te fèt apre manyèl Prism Graphpad vèsyon 8.0 ak sit entènèt la sou entènèt nan http://xena.ucsc.edu/. Pa gen okenn nouvo kòd oswa algoritm yo te devlope pandan etid sa a.

Done pwolonje

Done pwolonje Fig. 1:

LIMIT gen rapò ak jèn iminitè efèktè atravè plizyè kalite kansè.

Done pwolonje Fig. 2:

Lok jenetik ak sekans LIMIT imen ak Limit sourit.

Done pwolonje Fig. 3: LIMIT ogmante ekspresyon MHC-1

Done pwolonje Fig. 5:

LIMIT ogmante ekspresyon MHC-1 ki chaje ak antijèn an vivo.

Done pwolonje Fig. 6:

LIMIT cis-aktive GBP pou ranfòse MHC-1 ak iminite timè.

Done pwolonje Fig. 7:

GBP yo aktive HSF1 pou ankouraje ekspresyon MHC-I.

Done pwolonje Fig. 8:

HSF1 kondwi ekspresyon MHC-I ak iminite timè.

Done pwolonje Fig. 9:

Jèn siyal HSF1 ki gen rapò ak MHC-I ak iminite timè.

Done pwolonje Fig. 10: Scheme ki montre kijan aks LIMIT-GBP-HSF1 afekte MHC-I ak iminite timè.

Materyèl siplemantè

Ale nan vèsyon Entènèt la sou PubMed Central pou jwenn materyèl siplemantè.

Rekonesans

Nou remèsye manm laboratwa Zou yo pou opinyon entelektyèl yo. Travay sa a te sipòte an pati pa sibvansyon rechèch ki soti nan US NIH/NCI R01 sibvansyon (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ), ak (CA216919, CA213566, CA120458H) ak Inivèsite a (MC) nan Michigan Rogel Cancer Center Grant (CA46592).

Referans

1. Zou W, Wolchok JD & Chen L PD-L1 (B7-H1) ak PD-1 blokaj chemen pou terapi kansè: Mekanis, biomake repons, ak konbinezon. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigens nan imunoterapi kansè. Syans 348, 69–74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Garcia-Lora A, Algarra I & Garrido F MHC klas I antijèn, siveyans iminitè, ak chape iminitè timè. J Cell Physiol 195, 346-355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Festenstein H & Garrido F MHC antijèn ak maliyans. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM & van Hall T Bezwen ijan pou refè MHC klas I nan kansè pou iminoterapi efikas. Curr Opin Immunol 39, 44-51, doi:10.1016/ j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC et al. Yon atlas RNAs long moun ki pa kode ak pwent 5' egzat. Nature 543, 199- 204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS Long ki pa kodaj RNAs: apèsi sou fonksyon. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Evolisyon ak fonksyon RNA ki pa kode lontan. Selil 136, 629– 641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​Long noncoding RNAs: sipriz fonksyonèl soti nan mond lan RNA. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT Long noncoding RNAs: sot pase, prezan, ak lavni. Jenetik 193, 651-669, doi:10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY Long noncoding RNAs nan pwogramasyon selilè ak repwogram. Cell Stem Cell 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Wòl émergentes lncRNAs nan kansè. Nat Med 21, 1253–1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A et al. Anòt referans GENCODE pou jenom imen ak sourit. Asid Nukleik Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N et al. Evolisyon timè ak mikro-anviwònman pandan imunoterapi ak Nivolumab. Selil 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W et al. Karakteristik jenomik ak transkriptomik repons nan terapi Anti-PD-1 nan melanom metastatik. Selil 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM et al. Genomic korelasyon nan repons a CTLA-4 blokaj nan melanom metastatik. Syans 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T et al. Mitasyon Somatic ak Omoloji Neoepitope nan Melanom Trete ak CTLA-4 Blockade. Cancer Immunol Res 5, 84-91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. Analiz sistematik yon siyati roman lncRNA ki asosye kòm biomarker prognostik pou karsinom epatoselilè. Kansè Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH et al. Demonstrasyon yon sistèm siveyans timè entèferon gama-depandan nan sourit imunokonpetan. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Fruh K & Yang Y Antigen prezantasyon pa MHC klas I ak règleman li yo pa interferon-gama. Curr Opin Immunol 11, 76-81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H et al. B7-H1 ki asosye ak timè fè pwomosyon apoptoz selil T: yon mekanis potansyèl pou evazyon iminitè. Nat Med 8, 793-800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P et al. Aktivasyon jèn ki gide RNA pa faktè transkripsyon ki baze sou CRISPR-Cas9-. Metòd Nat 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H et al. Ekspresyon lame a nan PD-L1 detèmine efikasite nan PD-L1 chemen bloke-medyatè regression timè. J Clin Invest 128, 1708, doi:10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Solèy Q, Hao Q & Prasanth KV Nikleyè Long Noncoding RNAs: Regilatè kle nan ekspresyon jèn. Tandans Genet 34, 142-157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH entèferon endiksyon nan pwoteyin fibroblast ak aktivite obligatwa guanylate. J Biol Chem 258, 7746-7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH et al. Pwoteyin guanilat-obligatwa entèferon-induit nan deklanchman inflammasome ak defans lame. Nat Immunol 17, 481-489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X et al. PROMO: deteksyon eleman regilasyon transkripsyon li te ye lè l sèvi avèk rechèch ki adapte espès yo. Bioinformatics 18, 333-334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Consortium, EP Yon ansiklopedi entegre eleman ADN nan genòm imen an. Nati 489, 57-74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Gadyen Proteostaz nan kansè. Tandans selil Biol 26, 17-28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Ti molekil aktivatè nan repons chok chalè: pwopriyete chimik, sib molekilè, ak pwomès ki ka geri ou. Chem Res Toxicol 25, 2036-2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Represyon nan chok chalè transcription faktè HSF1 aktivasyon pa HSP90 (HSP90 konplèks) ki fòme yon konplèks estrès-sansib ak HSF1. Selil 94, 471–480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Règleman faktè mamifè chòk chalè 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 ak chaperoning kansè. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE et al. Ranplasman klonal selil T espesifik timè yo apre blokaj PD-1. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M et al. Pwoteomik nan repons Melanoma nan imunoterapi revele depandans mitokondriyo. Selil 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA Long ki pa kode RNAs nan règleman an nan repons iminitè a. Tandans Immunol 35, 408-419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Long RNAs ki pa kode nan Règleman repons iminitè a ak iminite ki antrene. Front Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM & Chang HY Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Selil kansè 29, 452-463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Solèy TT et al. LncRNA GClnc1 Ankouraje Kanserojèn gastric epi li ka aji kòm yon echafodaj modilè nan konplèks WDR5 ak KAT2A pou presize Modifikasyon Modifikasyon Histone. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas A Prensipal, Adaptatif, ak Rezistans Akeri nan Imunoterapi Kansè. Selil 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D et al. Silansman epijenetik nan chemokines TH1-tip fòme iminite timè ak imunoterapi. Nati 527, 249-253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W et al. Selil T CD8(+) kontwole ferroptoz timè pandan imunoterapi kansè. Nature 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J et al. Pèt Jèn chemen IFN-gamma nan selil timè yo kòm yon mekanis rezistans nan terapi anti-CTLA-4. Selil 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM et al. Mitasyon ki asosye ak rezistans akeri nan blokaj PD-1 nan melanom. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT et al. Tès CRISPR in vivo idantifye Ptpn2 kòm yon sib iminoterapi kansè. Nature 547, 413-418, doi:10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS et al. Rezistans prensipal nan blokaj PD-1 medyatè pa mitasyon JAK1/2. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A et al. Rezistans IFNgamma akeri afekte iminite anti-timè epi li bay blesi melanom ki reziste selil T. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J et al. Mitasyon chofè epijenetik nan ARID1A fòme fenotip iminitè kansè ak imunoterapi. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL et al. Siyal Interferon timè kontwole yon pwogram rezistans miltijenik pou bloke iminitè yo. Selil 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD & Spector DL ​​terapetik vize nan Long ki pa kodaj RNAs nan kansè. Tandans Mol Med 24, 257-277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Règleman ekspresyon jèn pa RNA ki pa kode depi lontan ki aji ak cis. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Defi ak pèspektiv pou byoloji estriktirèl nan lncRNAs-egzanp nan Xist lncRNA A-repete. J Mol Cell Biol 11, 845-859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR et al. GBP5 ankouraje NLRP3 inflammasome asanble ak iminite nan mamifè yo. Syans 336, 481-485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD Interferon-induced guanylate-obligatwa pwoteyin: Gadyen defans lame nan sante ak maladi. J Exp Med 216, 482-500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M et al. Yon gwoup p65 GTPases entèferon-gamma-induire jwe yon wòl enpòtan nan defans lame kont Toxoplasma gondii. Iminite 37, 302-313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM et al. Anpèchman HSP90 amelyore imunoterapi kansè nan ogmante jèn repons entèferon yo. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF Vize Pwoteyin Chòk Chalè 90 (HSP90) kòm yon estrateji konplemantè nan blokaj iminitè yo pou terapi kansè. Cancer Immunol Res 3, 583-589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A et al. Evalyasyon klinik ak Biomarker Profilage nan Hsp90 Inhibiteurs. Metòd Mol Biol 1709, 423-441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J et al. Bcl-2 twòp ekspresyon amelyore siviv selil T espesifik timè yo. Kansè Res 65, 2001– 2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H et al. Raf-1 obligatwa pou pwodiksyon IL2 selil T. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]