Modilasyon nan chemen siyal reseptè idrokarbon Aryl la enpak sou replikasyon viris Junín Pati 1

Résumé:

Viris Junín (JUNV), yon manm nan fanmi Arenaviridae, se ajan etyolojik lafyèv emorajik Ajantin, yon maladi endemik nan rejyon riral Ajantin ki manke chimyoterapi espesifik. Aryl hydrocarbone reseptè (AHR) eksprime nan plizyè tisi mamifè e li te endike kòm yon Capteur nan ligand ki soti nan sous varyab ak yon modulateur nan repons iminitè selil la.

Viris Junin se yon viris ki ra ki afekte sistèm iminitè imen an epi ki lakòz yon repons iminitè grav. Sepandan, iminite se pa sèlman estrateji ki echwe pou konbat viris Junin la.

Premyèman, pran ase repo ak dòmi enpòtan pou kenbe sistèm iminitè w an sante. Pandan dòmi, kò a degaje sibstans ki rele cytokines ki ede sistèm iminitè a reponn pi efikasman nan viris ak lòt menas ekstèn.

Dezyèmman, abitid manje an sante yo tou se kle nan amelyore iminite. Manje manje ki rich nan vitamin C ak D, tankou fwi Citrus ak dyondyon, ka ede ranfòse repons iminitè kò ou a.

Anplis de sa, fè egzèsis modere kapab tou amelyore iminite. Egzèsis apwopriye ka ogmante kantite globil blan nan kò a, kidonk amelyore kapasite sistèm iminitè a.

Finalman, yon bon eta mantal trè enpòtan tou pou sante sistèm iminitè a. Estrès ak enkyetid ka afekte repons iminitè kò a, kidonk li enpòtan pou w rete dekontrakte ak pozitif.

Nan ti bout tan, byenke viris Junin gen yon enpak sou sistèm iminitè a, lè nou amelyore fòm nou yo ak kenbe yon atitid pozitif, nou ka amelyore iminite nou yo ak efektivman anpeche epi reponn a atak viris. Soti nan pwennvi sa a, nou bezwen amelyore iminite nou an. Cistanche ka siyifikativman amelyore iminite, paske sann vyann gen yon varyete de eleman biyolojik aktif, tankou polisakarid, de dyondyon, Huang Li, elatriye. Konpozan sa yo ka ankouraje sistèm iminitè a Divès kalite selil nan sistèm nan, ogmante aktivite iminitè yo.

Klike sou sipleman cistanche deserticola

Enteresan, etid resan yo te sijere ke aktivasyon an oswa depresyon nan chemen an siyal AHR ka jwe yon wòl nan rezilta a nan divès enfeksyon viral imen. Nan rapò aktyèl la, yo te analize efè modulation famasi AHR sou enfeksyon JUNV nan vitro. Yon premye tès depistaj microarray te montre ke chemen AHR te twòp eksprime nan selil epatik ki enfekte ak JUNV.

An menm tan an, enfeksyon nan selil Vero ak Huh-7 ak tansyon JUNV IV4454 ak Candid#1 yo te siyifikativman anpeche nan yon fason ki depann de dòz pa tretman ak CH223191, yon antagonist AHR espesifik, jan yo detekte pa tès enfeksyon, reyèl. tan RT-PCR ak deteksyon imunofluoresan nan pwoteyin viral. Anplis de sa, wòl pro-viral AHR nan enfeksyon JUNV parèt endepandan de chemen IFN-I a. Konklizyon nou yo sipòte pèspektiv pwomès yo nan modulation nan famasi nan AHR kòm yon sib potansyèl pou kontwòl la nan AHF.

Mo kle:

Aryl idrokarbone reseptè; viris Junín; arenavirus; lafyèv emorajik Ajantin; lame sib terapetik.

1. Entwodiksyon

Kounye a, gen plis prèv ki montre ke reseptè idrokarbone aryl (AHR) se yon modulateur enpòtan nan repons iminitè lame a ak karakteristik sa a kontribye nan diferan rezilta klinik enfeksyon nan nivo endividyèl ak popilasyon an [1,2]. AHR se yon reseptè sitoplasmik ki eksprime omniprésente nan tisi mamifè, k ap travay kòm yon Capteur nan yon gran varyete ligand andojèn ak ekzojèn ak orijin diferan tankou polyan, rejim alimantè, mikrobyom, ak metabolis lame [3-5].

Vreman vre, li te fòtman sijere ke AHR gen yon gwo enpak sou entèraksyon ki genyen ant faktè anviwònman ak enfeksyon viral [1,2]. Yon fwa AHR rekonèt yon molekil ligand, li transloke nan nwayo a kote li eterodimerize ak translokatè nikleyè reseptè aryl idrokarbone a epi kontwole ekspresyon jèn metabolis ksenobiotik (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1).

AHR kapab tou kominike avèk lòt faktè transkripsyon, tankou NF-kB, pou modile yon pakèt chemen siyal, ki gen ladan moun ki enplike nan repons iminitè a [6-8]. AHR ka modile ekspresyon jèn imunoregulatwa epi chanje chemen diferansyasyon selil dendritik enflamatwa ak selil T [9-11].

Dènye etid ki te fèt pa gwoup rechèch nou an te demontre ke deklanchman chemen siyal AHR jwe yon wòl pro-viral pandan Zika (ZIKV), deng (DENV), [12] ak sendwòm respiratwa egi grav coronavirus 2 (SARS-CoV{{). 4}}) enfeksyon [13]. Remake byen, li te konfime ke anpèchman AHR te mennen nan diminye replikasyon viral nan modèl viral sa yo, ki montre ke AHR reprezante yon estrateji antiviral pwomèt.

Viris Junín (JUNV) se yon viris jenom RNA segmented anvlòp ki soti nan fanmi Arenaviridae [14]. Chak segman RNA kode pou de pwoteyin nan direksyon opoze. Sou yon bò, gwo segman (L RNA) kode pou RNA-depandan RNA polymerase (L) ak pwoteyin matris la (Z).

Nan lòt men an, ti segman an (S RNA) kode pou nukleoprotein (NP) ak pou précurseur glycoprotein (GPC), ki koupe pa proteaz yo pou pwodui twa subunite (GP1, GP2, ak peptide siyal SSP) ki se. kenbe ansanm pou fòme konplèks glikoprotein [14].

JUNV se ajan etyolojik lafyèv emorajik Ajantin (AHF) [15], yon maladi andemik ki afekte popilasyon travayè riral yo nan rejyon imid Pampa nan Ajantin. Remake byen, yon karakteristik karakteristik AHF se pakèt sentòm klinik pasyan ki enfekte prezante yo. Maladi san sentòm oswa maladi grav, ak sentòm grip, rive nan 70-80 pousan nan enfeksyon yo. Sepandan, ka grav yo enplike konplikasyon emorajik ak newolojik ak yon to mòtalite ki sòti nan 20 a 30 pousan nan pasyan entène lopital [15].

Sa ki enpòtan, yon vaksen vivan atenue ki rele Candid#1 te pwouve yo trè efikas nan anpeche ka grav nan AHF [15,16]. Sepandan, tretman an sèlman ki disponib kont maladi a se administrasyon an nan plasma iminitè nan pasyan konvalesans; yon terapi ki te montre diminye kantite ka fatal sèlman si yo administre nan 8 jou apre aparisyon premye sentòm yo [17].

Menm si nan dènye ane yo plizyè prèv yo te rasanble sou efè AHR pandan enfeksyon, toujou pa gen okenn prèv klè sou wòl li pandan enfeksyon arenavirus [2].

Kòm popilasyon riral la toujou ekspoze a ligand AHR, tankou polyan ki soti nan endistri agrikòl la tankou agrochimik, pestisid, ak sous-pwodwi konbisyon gaz fosil [18], nou evalye nan travay sa a enpak nan modilasyon famasi AHR in vitro sou la. repons selilè a enfeksyon JUNV ak itilizasyon potansyèl AHR kòm yon sib kandida pou entèvansyon terapetik nan maladi AHF.

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Liy selilè

Liy selilè sa yo te itilize: Huh-7 (JCRB Cell Bank #0403) ak HepG-2 ATCC HB8065, de liy selil kansè imen ki sòti nan epatosit; Vero ATCC CCL-81, yon liy selil epitelyal ren ki sòti nan makak. Chak liy selil yo te kiltive nan Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) konplete ak 5 pousan serom ti towo bèf tibebe ki fèk fèt (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ak konplete ak 50 µg/mL gentamicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1 mM piruvat sodyòm (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 2 mM L-glutamin (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), ak tampon ak HCl/NaHCO3. Liy selil yo te kiltive epi konsève nan 37 ◦C ak yon atmosfè 5 pousan CO2.

2.2. Tansyon Viral

Yo te itilize tansyon viral sa yo: souch IV4454 natirèlman atténué ki te jwenn nan yon ka grav imen AHF [19] ak souch Candid#1 ki te atenue vaksen an [20]. Selil Vero yo te itilize tou de pou jenerasyon viris stock ak pou titrasyon viris atravè tès plak estanda.

Tout travay ak ajan enfektye yo te fè nan enstalasyon Nivo Biosekirite 2 epi yo te apwouve pa Biwo Sante Anviwònman ak Sekirite nan Lekòl Syans, University of Buenos Aires. Tout pèsonèl ki enplike nan pwosedi enfeksyon yo te pran vaksen ak Candid-1 Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. JI Maiztegui (Pergamino, Buenos Aires, Ajantin) te bay.

2.3. Analiz Microarray

Yon total de 5 × 105 selil HepG2 yo te simen nan flakon kilti 25 cm2 epi yo te enfekte ak JUNV IV4454 nan yon miltiplisite enfeksyon (MOI) nan 1 oswa mock-enfekte. RNA te ekstrè ak pirifye lè l sèvi avèk RNAeasy (Qiagen, Hilden, Almay) nan 24 ak 48 èdtan apre enfeksyon (pi). Konsantrasyon RNA yo te mezire lè l sèvi avèk Nanodrop. Pwofil ekspresyon jèn selil HepG2 yo te karakterize lè l sèvi avèk analiz microarray (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips) pou idantifye jèn lame ki kontwole transkripsyon pa enfeksyon.

Yo te kalkile kantite total jèn lame yo siyifikativman kontwole pa enfeksyon pou chak moman lè yo te idantifye jèn ki te montre, omwen, yon chanjman 1.6-pliye nan ekspresyon ak yon pwobabilite 95 pousan pou yo te eksprime diferan (p {{ 3}}.05).

Lojisyèl WebGestalt la (http://www.webgestalt.org, jwenn aksè nan dat 3 Jiyè 2020), ki anplwaye baz done Wikipathways yo te itilize pou Ontoloji Gene ak analiz sou reprezantasyon chemen an. Repwodwi eksperyans yo te fè nan diferan jou (n=3 eksperyans endepandan pou chak kondisyon).

2.4. Ti Konpoze Molekil

Sentetik AHR-espesifik antagonist konpetitif CH223191, 1-Methyl-N-[{2-methyl4-[2-({2-methyl phenyl)diazenyl]phenyl]{ {9}}H-pyrazole-5-carboxamide (Tocris Bioscience, Bristol, Wayòm Ini), yo te solubilize nan dimethyl sulfoxide (DMSO) epi yo te itilize nan yon konsantrasyon 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, ak 80 µM.

Metabolit triptofan L-kynurenine, (2S)-2-Amino-4-({2-aminofenil)-4-oxobutanoic asid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) te solubilize nan DMSO epi yo itilize nan yon konsantrasyon 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, ak 320 µM.

Tout tretman yo te fèt nan absans limyè, paske konpoze yo prezante fotosansibilite.

2.5. Selil Viabilite Essays

Pou detèminasyon viabilite selil Huh-7 ak monokouch selil Vero yo te grandi nan plak 96 byen pou 24 èdtan nan MEM 5 pousan NBCS. Monokouch selilè nan 90 pousan konfluyans yo te trete ak diferan konsantrasyon CH223191 (1.25 µM a 80 µM) ak kynurenine (5 µM a 320 µM) pou 72 èdtan. Mock te trete ak menm konsantrasyon nan DMSO kòm dòz ki pi wo nan tretman ligand epi li te konsidere kòm 100 pousan nan viabilite selil.

Tout tretman yo te fèt an kat fwa. Vitabilite selil yo te evalye pa 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromur (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tès. Yo te mezire absorpsyon nan 570 nm nan yon lektè mikroplak FLUOstar OPTIMA. Pousantaj viabilite selil yo te detèmine lè yo relativize rezilta absorpsyon tretman yo lè l sèvi avèk valè absòbe Mock.

Anplis de sa, yo te etidye kapasite kwasans ak mòfoloji selil trete anba yon mikwoskòp limyè. Yo te pran foto nan 72 èdtan ak yon mikwoskòp Nikon Eclipse TS100; agrandisman: 100×; NA: 0.25.

2.6. Tretman ak Enfeksyon Viral

Vero ak Huh{{0}} monokouch selil yo te pretrete ak CH223191 ak kynurenine dilye nan MEM 1.5 pousan NBCS pou 1 èdtan oswa 24 èdtan, respektivman, nan 37 ◦C. CH223191 te itilize nan konsantrasyon ki varye ant 1.25 ak 20 µM, pandan y ap kynurenine te itilize nan konsantrasyon ki varye ant 5 ak 80 µM. Lè sa a, enfeksyon viral yo te fèt ak swa IV4454 oswa Candid #1 souch nan yon MOI nan 0.5. Apre 1 èdtan, yo te retire inokula yo epi selil yo te ekspoze a tou de konpoze pou 48 èdtan nan konsantrasyon mansyone yo. Nan 48 h pi supernatant yo te kolekte pou tès plak ak monokouch selil yo te trete pou swa imunofluoresans endirèk oswa RT-qPCR.

2.7. Imunofluoresans endirèk

Huh -7 monokouch trete ak CH223191 oswa kynurenine ak enfekte ak JUNV jan mansyone pi wo a yo te fiks nan 48 h pi ak metanol pou 10 min nan -20 ◦C, lave twa fwa ak PBS, epi estoke nan PBS fre nan 4 ◦C. jiskaske pwosesis la.

Yo te itilize antikò sa yo: antikò monoklonal anti-NP sourit prensipal (1:200) (NA05-AG12) [21] ak antikò segondè Alexa Fluor 488 konjige anti-sourit kabrit (1:200) (A{{{ 10}}) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Nwayo selil yo te tache ak 40,6-diamidino-2- phenylindole (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Done mikwoskòp ak fotografi yo te jwenn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan Olympus IX71 ak yon kamera QImaging Exi-Aqua tache (gwosè piksèl: 6.45 µm; zòn fotodetektè: 1392 × 1040 piksèl2).

Kantifikasyon done fluoresans yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl Fiji (vèsyon 1.53v) (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Kantifikasyon manyèl nwayo DAPI-tache ak selil NP-pozitif yo te fèt manyèlman atravè Plugin kontwa selil ki enkli nan lojisyèl Fiji a (vèsyon 1.53v). Selil yo te konsidere kòm pozitif si tach antijèn viral NP ta ka detekte. Pousantaj selil NP-pozitif yo te eksprime kòm rapò ant selil NP-pozitif ak selil total nan chak jaden epi apre yo te detèmine ak prezante pousantaj mwayèn.

Entansite fliyoresans selil NP-pozitif yo te jwenn nan mezire valè gri vle di nan selil endividyèl yo ak soustraksyon fliyoresans background. Fokis viral yo te delimite pa konsidere gwoup selil NP-pozitif ki te antoure pa selil NP-negatif. Fokis viral yo te konte sou 3 imaj diferan ki soti nan 3 diferan jaden chwazi owaza ak gwosè mwayèn fokis yo te detèmine pa kantite selil ki te fòme yo.

2.8. Deteksyon asid nikleik viral

Te fè ekstraksyon asid nikleik soti nan monokouch selil ki enfekte lè l sèvi avèk Highway ADN/ARN PuriPrep-VIRUS kit K1501 (Inbio Highway, Buenos Aires, Ajantin), dapre enstriksyon manifakti a. JUNV RNA chaj viral ak kantite transkripsyon selilè te pote soti pa RT-qPCR. Transkripsyon ranvèse te fèt lè l sèvi avèk primè o aza ak Moloney murin lesemi viris ranvèse transcriptase (M-MLV RT).

Pou anplifikasyon fragman, yo te itilize primè sa yo: JUNV-np (Anvan: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30, Reverse: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (Anvan: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30; Ranvèse: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( Anvwa: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30; Ranvèse: 50 -ATGGTTAGCCCATAGATGGG-30 ), -actin (Anvan: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17} }}; Ranvèse: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30 ). Detay sik PCR yo te jan sa a: premye denaturalizasyon 2 min nan 95 ◦C; 45 sik anplifikasyon ki gen 30 sec a 95 ◦C, 1 min a 58 ◦C, ak 1 min a 72 ◦C; yon sik final 5 min nan 72 ◦C; finalman, koub k ap fonn yo te fèt. Yo te fè deteksyon lè l sèvi avèk ekipman MyiQ2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Rezilta yo te rapòte kòm 2−∆∆Ct (chanjman pliye) epi yo te nòmalize lè l sèvi avèk -aktin kòm yon jèn antretyen.

2.9. Plak Assay

Rendeman viral yo te detèmine pa tès plak estanda. Supernatant selil yo te kolekte epi dilusyon seri yo te prepare pou enfekte monokouch selil Vero pou 1 èdtan nan 37 ◦C. Apre adsorption viral, yo te retire inokula yo, yo te ajoute MEM 5 pousan NBCS ak 0.7 pousan methylcellulose epi selil yo te enkube pou 1 semèn nan 37 ◦C nan yon enkibatè 5 pousan CO2. Apre sa, monokouch selil yo te fiks ak 10 pousan fòmaldeyid, lave, ak tache ak kristal vyolèt. Yo te kalkile tit viral apre kantite inite ki fòme plak (PFU).

2.10. Analiz estatistik

Yo te fè analiz estatistik Microarray lè l sèvi avèk lojisyèl WebGestalt (http://www.webgestalt.org/, jwenn aksè nan dat 3 Jiyè 2020). Done yo dekri kòm mwayen ± SD One-Way ANOVA ak tès post hoc Dunnett pa GraphPad Prism 8 (vèsyon 8.0.1) pou Windows 11 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) te fèt pou evalye siyifikasyon estatistik. p Mwens pase oswa egal a 0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan.

For more information:1950477648nn@gmail.com