Imaging miltikolor nan pwoteyin ki obligatwa kalsyòm nan wòch ren imen pou elisid efè pwoteyin yo sou kwasans kristal.

edmund.chen@wecistanche.com

renmaladi wòch se yon maladi komen, ki afekte 1.7-14.8 pousan nan popilasyon an omwen yon fwa nan lavi a1,2. Nan jiska 50 pousan nan ka, maladi sa a repete nan lespas 5 ane apre premye epizòd la. Malgre enpòtans pwoblèm sante sa a, terapi prevantif pou fòmasyon wòch pa disponib. Konprann patojèn nanrenfòmasyon wòch se esansyèl diminye ensidan an ak repetition nanrenmaladi wòch3. Apeprè 80 pousan nanrenwòch yo se kalsyòm oksalat (CaOx) wòch4,5. Wòch CaOx te konpoze de ~ 90 pousan nan faz mineral, sa vle di, CaOx ki se plis kategori nan monoidrat kalsyòm oksalat [Ca (C2O4) · H2O] (COM) ak kalsyòm oksalat dihydrate [Ca (C2O4) · 2H2O] (COD), ak yon fraksyon relativman ti nan matyè òganik, ki te konsidere kòm Depatman Nefro-Uroloji, Lekòl gradye nan Syans Medikal, Nagoya City University, 1-Kawasumi, Mizuho-cho, Mizuho-Ku, Nagoya 467-8601, Japon . 2Institute for Advanced Co-Creation Studies, Osaka University, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japon. 3Graduate School of Engineering, Osaka University, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Japon. 4Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University, 1-5, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522, Japon. 5Depatman Syans Latè, Inivèsite Tohoku, 6‑3 Aza‑Aoba, Aramaki, Aoba‑ku, Sendai 980‑8578, Japon. 6National Museum of Nature and Science, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba 305-0005, Japon. 7 Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217-14, Hayashi-cho, Takamatsu, Kagawa 761-0395, Japon. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3-1-11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577-0849, Japon. 9Enstiti Jeni Lazè, Osaka University, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japon. *Imèl: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp

Mo kle:ren; pyè nan ren; maladi ren; ren; fizyoloji ren

CISTANCHE AP AMELIORE ENFÒK REN/RENAL

kòm matris pwoteyin6. Patojèn nanrenfòmasyon wòch gen ladan pwosesis milti-etap ki enplike entèraksyon konplèks ant eleman mineral ak matris pwoteyin7,8. Plis pase 100 espès pwoteyin yo te idantifye nanrenwòch 9–11. Pami yo, plizyè pwoteyin, patikilyèman kalsyòm-obligatwa pwoteyin, yo konnen yo jwe wòl esansyèl nan pwosesis fòmasyon wòch CaOx12-16. Efè espesifik pwoteyin sa yo te envestige entansif nan plizyè etap nan fòmasyon wòch la, ki gen ladan nikleyasyon kristal, kwasans kristal, agrégasyon kristal, ak adezyon kristal, ak anpil etid in vitro kristalizasyon17-19. Etid in vitro yo itil pou evalye efè pwoteyin espesifik sou etap espesifik nan fòmasyon wòch. Sepandan, nan anviwònman fòmasyon wòch reyèl, kantite pwoteyin travay ansanm, ak konpozisyon pipi nan konsantrasyon pwoteyin, ion kalsyòm, ak oksalat varye. Enkyetid sa a te motive nou mennen ankèt sou moun reyèlrenwòch yo jwenn efè reyèl nan pwoteyin sou kwasans kristal. Nan pifò etid anvan yo, idantifikasyon pwoteyin yo nanrenwòch yo te fèt ak espektroskopi mas apre kraze ak ekstraksyon9-11. Kidonk, enfòmasyon sou distribisyon an espasyal nan pwoteyin nan wòch la pèdi. Nan envestigasyon trè limite, idantifikasyon pwoteyin nanrenwòch yo te fèt ak seksyon tranch nan wòch ren nan ki kristal CaOx yo konplètman retire pa decalcifcation20,21. Apwòch sa a itil pou jwenn distribisyon yon pwoteyin nanrenwòch ki potansyèlman ede konprann efè pwoteyin espesifik sou fòmasyon wòch. Sepandan, yon gwo kantite enfòmasyon sou fòmasyon an wòch, anrejistre nanrenkristal wòch, se pèdi nan metòd sa a. Enpòtans enfòmasyon mineral nan pyè ren ki ka akeri pa idantifikasyon faz kristal ak klasifikasyon teksti kristal yo te fè lè l sèvi avèk seksyon tranch ak poli seksyon mens nanrenwòch ak mikwoskospi optik te montre pa plis pase 70 ane nan etid anvan22,23.

Absans analiz la pou evalye distribisyon pwoteyin ak kristal CaOx primitif nanrenwòch te yon obstak konsiderab pou konprann fòmasyon wòch la. Evalyasyon kowòdone distribisyon pwoteyin ak faz kristal / mòfoloji ka bay enfòmasyon enpòtan sou istwa fòmasyon wòch la. Yo te itilize tach imunofluoresan miltip (multi-IF tach) pou montre distribisyon de oswa plis pwoteyin nan plizyè kalite tisi mou echantiyon byolojik24. Aplikasyon teknik la nan tisi zo yo, ki konpoze de kristal fosfat kalsyòm ki mouye, yo bay tou apèsi enpòtan sou règleman dinamik nan omeyostaz mineral zo25. Sepandan, sa a pa te itilize pou envestigerenwòch ki konpoze de kristal dans ak difisil, byenke yo te itilize yon sèl tach imunofluoresan pou montre distribisyon an nan yon pwoteyin espesifik nan dekalsifye.renwòch ki pa kenbe enfòmasyon mineral20,21. Etid sa a te envestige kondisyon ki pèmèt tach milti-IF nanrenechantiyon wòch yo kenbe enfòmasyon orijinal mineral yo. Nou te envestige distribisyon twa pwoteyin diferan, osteopontin (OPN),renfragman prothrombin 1 (RPTF-1), ak calgranulin A (Cal-A), nan seksyon mens nan wòch CaOx. Pwoteyin sa yo komen nan pifò wòch CaOx epi yo konnen yo kòm pwoteyin obligatwa kalsyòm ki kapab afekte fòmasyon wòch CaOx26–28. Dapre sa nou konnen, sa a se premye etid kote plizyè pwoteyin matris yo kovizyalize nan yonrenwòch. Nou plis entèprete diferan efè in vivo nan chak pwoteyin sou kwasans kristal CaOx ki baze sou distribisyon yo, pwopriyete fizikochimik, ak chanjman konplèks anviwònman fizik chak pwoteyin pandan fòmasyon wòch CaOx.

CISTANCHE AP AMELIORE DYALIZ REN/REN

Rezilta yo

Ki baze sou obsèvasyon mikwoskopik makonnen ak analiz FT-IR, domèn nanrenechantiyon wòch yo te klase nan twa kalite tèkstur ki konsistan avèk sa yo rapòte nan Schubert ak Brien23: teksti iregilye ki konpoze de kristal COD euhedral (Tip 1, refere yo kòm total COD euhedral; Fig. 1c), teksti mozayik ki konpoze de iregilye COM oryante. kristal (Type 2, refere yo kòm mozayik COM; Fig. 1f), ak konsantrik laminated COM kristal (Tip 3, refere yo kòm konsantrik COM; Fig. 1i). Pifò nan echantiyon wòch yo obsève CaOx fèt nan twa tèkstur sa yo (Tablo 1). Multi-IF tach pwotokòl itilize pou echantiyon byolojik te aplike nan analiz la nan seksyon mens nanrenechantiyon wòch prepare pa yon metòd jewolojik tipik. Pou aplikasyon an, kondisyon gravure nan seksyon mens la anvan tach la te ajiste epi li te jwenn ke vizyalizasyon an te sèlman siksè lè seksyon an poli mens te yon ti kras grave (ak yon pH 6.0 solisyon citrate pou 1 min). ) anvan pwosesis la tach tipik. Tach milti-IF pèmèt kovizyalizasyon twa pwoteyin nan diferan koulè (OPN: Green, RPTF-1: Blue, ak, Cal-A: Wouj) nan twa diferan teksti wòch yo.

Nou te jwenn ke chak pwoteyin te montre yon modèl distribisyon karakteristik depann sou kote li yo nan COM ak COD. Yo te jwenn total COD euhedral nan 7 echantiyon sou 15 echantiyon (Tablo 1). Te euhedral COD total yo te prezan sitou sou periferik CaOxrenwòch (figi 1a–c). Yo konnen ke kristal COD sa yo gen yon fòm bipiramid tetragonal ki konpoze de figi29. Anpil nan bipiramid COD yo gen tou {110} figi sou pwent tou de piramid yo (Fig. 2b ak Figi Siplemantè S1). Yon imaj tach milti-IF nan kristal COD yo montre nan Fig. 2a, ak OPN detanzantan prezante sou figi {110} COD, jan yo montre nan flèch blan nan Fig. 2c. Figi sa a se menm figi pwent bipyramid la ki pa parèt nan COD tipik nan kwasans kristal vitro29. RPTF-1 parèt tankou yon kouch paralèl sou figi a, ak entèval µm-echèl, jan flèch jòn nan Fig. 2d montre. Figi kristal sa a se karakteristik kwasans COD tipik29. Cal-A te prezan deyò nan kristal COD yo, ki pa montre okenn adsorption preferansyèl sou figi espesifik (figi 2e). Modèl distribisyon menm yo te wè nan lòt echantiyon wòch (Siplemantè Fig. S2). Mozayik COM teksti se teksti ki pi komen nan wòch CaOx (figi 1d-f). Teksti sa a te obsève nan 12 echantiyon sou 15 (Tablo 1). Multi-IF tach nan mozayik COM la montre nan Fig. 3a, b. OPN ak RPTF -1 te prezan nan tout kristal COM yo (figi 3c, d). Kontrèman, Cal-A te prezan sèlman sou fwontyè grenn yo (sa vle di, sou sifas grenn COM yo) (Fig. 3e). Nou analize plis pwofil entansite liy pwoteyin yo, jan yo montre nan Fig. 3a, pou evalye chak modèl distribisyon pwoteyin an detay (liy jòn sou Fig. 4a). OPN ak RPTF-1 te montre entansite ki pi wo nan zòn kristal la, tandiske Cal-A te montre entansite pi ba nan zòn nan.

zòn kristal (figi 4b). Yo te obsève gwo entansite Cal-A sèlman sou fwontyè kristal yo. Distribisyon pwoteyin sa yo te wè nan anpil echantiyon, byenke gwosè ak fòm grenn COM yo te diferan (figi siplemantè S3). Te konsantrik COM se tou yon teksti tipik nan wòch CaOx (figi 1g-i). Nou jwenn teksti sa a nan 10 echantiyon sou 15 (Tablo 1). OPN, RPTF -1, ak Cal-A te distribye nan kouch konsantrik (figi 5a). OPN ak RPTF-1 te prezan kòm kouch konstan ak regilye nan tout kristal COM yo, ki fè yon entèval µm-echèl (Fig. 5b, c). Nan contrast, distribisyon an Cal-A te konpoze de kouch iregilye ak relativman lajè-entèval ki sitiye nan sifas la deyò nan wòch la (figi 5d). Obsèvasyon SEM te montre yon kouch espas ki toupre chak kouch Cal-A (Fig. 6a, b). Tou de sifas ki te kreye espas espas yo te okipe ak ti depo ki te klèman diferan de gwo kristal COM ki konpoze COM konsantrik la (figi 6c, d). Te liy entansite pwofil pwoteyin sa yo nan COM konsantrik la te montre Spikes nan chak pwofil pwoteyin (figi 4c, d). Pwofil OPN ak RPTF -1 yo te menm jan an (sa vle di, 5.58±2.70 µm / kouch OPN ak 5.99±2.56 µm / kouch RPTF -1) (Tablo Siplemantè S1). Sepandan, kouch Cal-A yo te gen yon entèval diferan (sa vle di, 23.17±18.57 µm/kouch) pase OPN ak RPTF-1. Modèl distribisyon menm jan ak entèval yo te wè nan pifò lòt echantiyon 9 yo, byenke kouch Cal-A pa te wè nan kèk echantiyon (Siplemantè Figi S4 ak Tablo S1).

Nan etid sa a, pwopòsyon twa tèkstur yo nan wòch CaOx ak distribisyon twa pwoteyin yo nan twa teksti yo pa te gen okenn relasyon klè ak laj ak sèks ansyen wòch la, byenke kantite wòch envestige yo pa t ase pou analiz korelasyon. . Yo konnen OPN, RPTF-1, ak Cal-A yo prezan nan wòch CaOx ki baze sou deteksyon nan ekstrè yo nan poud wòch ak elektwoliz9-11. Mikwo-echèl distribisyon OPN nan dekalsifikasyon wòch CaOx ak teknik imunositochimik te montre distribisyon OPN nan lamèl konsantrik nan wòch CaOx21,30. Metòd prezan an byen parèt byen klè kote twa pwoteyin diferan nan "kouch òganik" yo te konsidere anvan (figi 7a, b). Modèl distribisyon OPN nou montre nan etid prezan an nan COM konsantrik la konsistan avèk obsèvasyon anvan yo. Nou te jwenn plis ke modèl distribisyon RPTF-1 nan COM konsantrik la se prèske menm jan ak sa yo ki nan OPN, tandiske distribisyon an nan RPTF-1 nan kristal COD diferan de sa yo ki nan OPN. Kontrèman, modèl distribisyon Cal-A a konplètman diferan de lòt de pwoteyin yo. Tese diferan mikwo-echèl distribisyon OPN, RPTF-1, ak Cal-A anrejistre istwa fòmasyon wòch CaOx.

Diskisyon

Prensipal faktè kontwòl nan enkòporasyon pwoteyin nan kristal.Tou de OPN ak RPTF {{0}} te prezan nan kristal COD euhedral, grenn COM mozayik, ak COM konsantrik (figi 2a, 3a, ak 5a). Konklizyon sa a konfime ke pwoteyin sa yo enkòpore nan tou de kristal COD ak COM. Cal-A te prezan nan deyò kristal COD euhedral ak alantou grenn COM mozayik (figi 2e ak 3e). Nan ka konsantrik COM la, yon espas espas anjeneral yo jwenn alantou kouch Cal-A yo sijere ke kouch Cal-A yo pa enkli nan kristal yo men distribye sou sifas kristal yo (figi 5d ak 6a–d). Distribisyon sa yo endike ke OPN ak RPTF-1 yo gen tandans enkòpore nan kristal CaOx, tandiske Cal-A pa enkòpore. Te adsorption pwoteyin ak enkòporasyon nan kristal CaOx yo teyorikman enfliyanse pa fòs la obligatwa nan chenn bò asid amine yo ak lòt pwopriyete espesifik nan pwoteyin respektif tankou elektwostatik chaj negatif31,32. Chaj nèt la endike ke OPN ak RPTF-1 gen plis chaj negatif pase Cal-A, ak pwen izoelektrik OPN, RPTF-1, ak Cal-A nan 3.5, 2.5-3.{{28} }, ak 6.5–7.0, respektivman33–35. Yo konnen ke OPN, RPTF-1, ak Cal-A gen domèn kalsyòm ki konekte36–38. Domèn sa yo ka travay anplis kòm sit obligatwa lokal nan sifas kristal k ap grandi yo. Domèn ki gen kalsyòm OPN, RPTF-1 ak Cal-A ka mare 10, 7, ak 2 iyon kalsyòm, respektivman36–38. Se konsa, esansyèl ak lokal afinite nan pwoteyin sa yo nan Ca ki chaje pozitivman sou sifas CaOx lakòz diferan efikasite enkòporasyon pwoteyin sa yo nan CaOx, Crystal kwasans monte nan enkòpore inite kwasans nan etap ak sit kink ki parèt sou sifas kristal39,40. . Konpatibilite ki genyen dimansyon pyebwa ant pwoteyin ak sifas kristal k ap grandi ta detèmine

CISTANCHE AP AMELIORE DOULÈ REN/REN

limit la nan enkòporasyon pwoteyin nan sifas la kristal. Pwoteyin ki gen yon gwo kapasite obligatwa nan sit k ap grandi yo ak etap yo gen tandans yo dwe enkòpore nan kristal la ap grandi pi efikasman41–43. Kounye a, distribisyon yo rapòte ak afinite kalsyòm twa pwoteyin yo sijere ke gwo afinite OPN ak RPTF -1 fasilite lyezon ak enkòporasyon nan kristal COD ak COM. Kontrèman, Cal-A, ki gen yon pi ba afinite, sèlman respekte sifas kristal la men li pa enkòpore nan kristal la. Yon etid anvan ki te montre pi gwo pousantaj enkòporasyon peptide nan COM pa plis peptides fosforilasyon sipòte eksplikasyon sa a43. Diskisyon sa yo ta pèmèt nou predi distribisyon anpil lòt pwoteyin ki baze sou pwopriyete kalsyòm-obligatwa yo.

In vivo absòpsyon selektif ak efè inhibition nan OPN ak RPTF-1 sou kwasans kristal CaOx.Te euhedral COD kristal ki prezan majorite sou periferik wòch CaOx yo te konsidere yo grandi ak yon teksti laminated karakteristik nan ki sa yo rele "kouch matyè òganik la" ak "kouch mineral" altène youn ak lòt pandan kwasans kristal44,45. Malgre ke rezon egzak ki kache chanjman kouch la rete klè, eksplikasyon potansyèl yo enkli chanjman anviwònman an nan lame imen an,renfizyoloji ak chanjman byochimik pipi, ak mekanis fidbak sinetik ki fòme estrikti dekoupaj an zòn osilatif yo jwenn nan mineral8. Rezilta prezan yo montre ke OPN ak RPTF-1 konstwi teksti laminated ki koresponn ak {110} ak {101} figi COD yo kòm pwoteyin intrakristalin, respektivman, tandiske Cal-A pa enkli nan teksti laminated la (Fig. 2c). –e). Sa a nan vivo evidans, dezyem prèv sifas sélectif adsorption/incorporation de protéines sou/nanrenkristal wòch endike ke distribisyon yo nan pwoteyin yo pa idantik ak tradisyonèl "kouch nan matyè òganik" obsève pa mikwoskòp optik (figi 7a). Chien et al te rapòte prèv nan vitro sou adsorption selektif OPN sou kristal COD. (2009 ak 2018)46,47. Dapre rapò sa yo, OPN mare nan figi tipik kristalografi {110} nan COD ak enkòpore nan faz mineral la, yo ki konsistan avèk rezilta nou yo (Fig. 7b). Te sifas selektif adsorption / enkòporasyon pwobableman a soti nan kapasite nan kalsyòm-obligatwa nan chak pwoteyin ak / oswa diferan konpatibilite molekilè ant gwoup yo fonksyonèl sou molekil pwoteyin yo ak aranjman an nan iyon lasi sou chak sifas kristal.

Pifò pwoteyin yo rapòte anpeche kwasans kristal CaOx pandan fòmasyon wòch48,49. Anpèchman kwasans kristal pa peptides konsidere kòm atravè etap pinning ak/oswa blokaj kink41-43. Nan etid anvan yo nan vitro, OPN ak RPTF -1 yo konnen yo dwe inibitè nan kwasans kristal CaOx48,49. Sepandan, limit la nan anpèchman nanrenfòmasyon wòch rete klè.

Obsèvasyon prezan yo montre ke pifò kristal COD wòch nan ren yo gen yon abitid kristal tipik ak figi {101} (figi 2b). Sifas kristal ki gen to kwasans relativman dousman yo jeneralman byen devlope40. Finansman sa a endike to kwasans figi COD ralanti konpare ak lòt sifas yo (egzanp, {110}). Yo te jwenn adsorption preferansyèl nan RPTF -1 ki potansyèlman ralanti kwasans kristal pa enkòpore nan COD kòm yon estrikti laminated ansanm ak figi {101} (Fig. 2d). Nan lòt men an, nou te jwenn figi {110} kòm estrikti laminated OPN andedan kristal COD la (figi 2c). Te {110} figi parèt kòm estrikti nan laminated OPN yo pi devlope pase {110} figi yo nan OPN-gratis kristal COD yo te jwenn nan etid vitro46. Te {110} figi COD ak adsorption preferansyèl nan OPN se pa figi kristal ki parèt sou COD nan abitid kristal tipik la47. Kidonk, absòpsyon OPN sou {110} ta ekstrèmman ralanti to kwasans sifas relatif la, ak ralantisman an te ase ralanti pou parèt figi {110} yo. Aparisyon nan figi yo {110}, nan lòt mo, chanje abitid la kristal jeneral nan anpil echantiyon nan pyè ren. Kristal COM parèt swa kòm yon teksti mozayik oswa teksti konsantrik (figi 3a ak 5a). Tou de OPN ak RPTF-1 yo prezan omojèn nan grenn COM nan teksti mozayik la (figi 3c, d). Kidonk, efè pwoteyin sa yo sou to kwasans sa a ki kalite COM pa klè. Nan konsantrik COM, kristal ki tankou lat ki aliyen radial soti nan sant la nan deyò a50. Figi kristal ki sanble ak kristal yo pa klè, men sifas ekstèn COM esferik ki ekspoze a pipi ta dwe gen menm figi kristalografik yo. Rezilta prezan yo montre klèman ke OPN ak RPTF-1 gen menm pwofil liy distribisyon kote yo distribye detanzantan nan COM konsantrik la kòm apeprè 4 a 6 µm-echèl kouch entèval (figi 4c, d, 5b, c, ak Tablo siplemantè S1). Sa a endike ke OPN ak RPTF-1 gen yon diferans neglijab nan adsorption ak enkòporasyon sou figi kristal espesifik COM ekspoze a pipi. Travay anvan yo in vitro te montre ke OPN gen efè inhibition sou kwasans COM nan {100}, {121}, ak {010} figi 51. Lè yo konsidere efè inhibition sa a, rezilta prezan an endike ke kwasans lan konsantrik COM te anpeche pa OPN. epi pètèt pa RPTF-1 kòm RPTF-1 gen yon kapasite ki sanble kalsyòm-obligatwa e konsa gen menm efikasite enkòporasyon ak COM.

Figi 7. Chema distribisyon pwoteyin nan twa gwo teksti nan CaOx. (a) Pwoteyin distribisyon matris konsidere nan etid anvan yo (koulè blan: faz mineral koulè nwa: matyè òganik). (b) Distribisyon espesifik pwoteyin yo jwenn nan etid la (vèt: osteopontin (OPN), ble: fragman prothrombin renal 1 (RPTF-1), ak wouj: calgranulin A (Cal-A). Type1 idiomorphic COD, Type2 mozayik COM, ak Type3 konsantrik laminated COM.

Efè inhibitor in vivo nan Cal-A sou kwasans kristal CaOx.Adsorption Cal-A sou figi kristal espesifik nan tou de kristal COM ak COD pa te wè nan rezilta prezan an (figi 2a ak 3a). Cal-A gen yon pi ba kapasite kalsyòm-obligatwa pase OPN ak RPTF -1 e li te prezan nan deyò a nan kristal COD euhedral ak alantou grenn COM mozayik san yo pa estrikti laminated (figi 2a, e, ak 3a, e). Sepandan, Cal-A yo konnen tou pou anpeche kwasans kristal CaOx nan etid vitro28. Se konsa, Cal-A te ka travay kòm yon molekil surfactant ki afekte mòfoloji ak pousantaj kwasans kristal san yo pa enkòpore nan kristal la39,40,52. Anba kondisyon pipi regilye (sa vle di, san konsantrasyon iregilye segondè Cal-A), Cal-A ka gen yon efè inhibition pi ba pase OPN ak RPTF-1 sou kwasans kristal COM ak COD depi OPN ak RPTF{{17} } anpeche devlopman etap sou fas kristal yo atravè pinning ak/oswa bloke pa enkòporasyon nan kristal. Se poutèt sa, kapasite kalsyòm-obligatwa nan pwoteyin nan pyè ren ta ede evalye limit efè inhibition yo sou kwasans CaOx Nan COM konsantrik, Cal-A te montre kouch ki pa peryodik ki te gen distans ki soti nan 20 a 50 µm (figi 4c, d). , 5d, ak Tablo Siplemantè S1). Yo te idantifye Cal-A nan pipi moun k ap fòme wòch28. Se konsa, fluctuations nan konsantrasyon li nan pipi ta dwe natirèlman rive. Sepandan, akòz pi ba afinite li nan iyon kalsyòm, ti fluctuations nan konsantrasyon Cal-A ta ka pa anrejistre nan teksti COM la. Cal-A se elimine nan pipi ki pa detanzantan kòm pwoteyin anti-enfamatwa an repons a enfamasyon53,54. Se konsa, kouch ki pa peryodik Cal-A yo ka anrejistre okazyonèl konsantrasyon segondè nan Cal-A nan pipi akòz chanjman iregilye nan anviwònman an, tankou enfeksyon, blesi, ak senyen. Efè inhibition li sou kwasans COM ta depann anpil de konsantrasyon li alantou kristal k ap grandi kòm plizyè peptides gen depandans sa yo sou kwasans kristal kalsit la. Cal-A ka fèb ralanti kwasans COM pa an pati okipe sifas k ap grandi a lè konsantrasyon li alantou kristal la ba paske pwoteyin nan pa gen tandans yo dwe enkòpore nan CaOx. Nan COM konsantrik, kouch espas ki antoure pa ti depo yo te jwenn pa obsèvasyon SEM prezante kote prèske idantik ak kouch Cal-A yo jwenn pa imaj milti-IF (Fig. 6a-d). Se poutèt sa, lè kouch Cal-A a vin epè akòz konsantrasyon iregilyèman segondè li yo pa kèk chanjman byolojik, Cal-A ka travay kòm yon inibitè ki pisan nan kwasans CaOx pa lajman okipe sifas la k ap grandi. Enflamasyon, ki se yon deklanche nan sekresyon Cal-A, ka afekte tou yon etap diferan nan fòmasyon wòch la paske yo te jwenn yon kalite globil blan (sa vle di, makrofaj) ki gen pwomosyon ak efè inhibition sou fòmasyon wòch ren yo te jwenn nan eksperyans lè l sèvi avèk. yon sourit modèl wòch ren16.

Aplikasyon posib nan milti-IF D nan fòmasyon jeneral wòch ren.Travay prezan elaji aplikasyon milti-IF D nan pwoteyin nan echantiyon biomineral ki pi difisil, sa vle di, pyè nan ren. Nukleasyon kristal, kwasans kristal, rasanbleman kristal, ak adezyon kristal yo te konsidere kòm etap enpòtan nan fòmasyon wòch ren. OPN, RPTF-1, ak Cal-A yo rapòte kòm inibitè nan nikleyasyon, kwasans, ak agrégation nan CaOx pa etid in vitro48,49. Te prezan aplikasyon elaji nan milti-IF D bay prèv in vivo nan efè a inhibition nan kwasans CaOx pa pwoteyin ki te enplike nan syans yo anvan an vitro. Envestigasyon sou efè pwoteyin nan chak etap yo te fèt pa etid in vivo sou sourit ak kantite etid in vitro14,15,26. Pou egzanp, yon wòl renoprotective kritik nan OPN kòm yon inibitè nan fòmasyon kristal ak yon inibitè nan adezyon kristal yo te rapòte ki baze sou eksperyans in vivo nan sourit26 Lè nou konsidere ke, pwomosyon nan adezyon kristal nan selil epitelyal tubulaires pa OPN ak amelyorasyon nan wòch CaOx. fòmasyon yo te rapòte ki baze sou eksperyans ki pi resan an vivo lè l sèvi avèk sourit OPN-knockout14,15. Yon mòfoloji kristal konplètman diferan yo te jwenn nan pyè ren yon sourit OPN-knockout sipòte tou efè OPN nan plizyè etap fòmasyon wòch ren. Metòd vizyalizasyon prezan an ta itil nan evalye efè pwoteyin nan syans vitro sa yo sou sourit e menm itil nan evalye diferan etap fòmasyon wòch ren moun. Roman analiz sa a ta pèmèt nou entèprete yo in vivo efè diferan pwoteyin sou fòmasyon wòch CaOx ki ka louvri yon wout pou egzamen patolojik la ak medikaman pèsonalize pou jere maladi wòch ren moun.

Metòd

Deklarasyon etik. Pwojè rechèch ki prezante nan papye sa a te apwouve pa Komisyon Konsèy la revizyon enstitisyonèl nan lekòl la gradye nan medsin, Nagoya City University. Tout metòd yo te fèt an akò ak direktiv ki enpòtan yo ak règleman yo. Yo te jwenn konsantman enfòme alekri nan men tout matyè yo dapre pwosedi ki te apwouve pa komite etik la.

Koleksyon wòch ak preparasyon nan seksyon wòch. Pyè ren yo te kolekte nan pasyan yo epi yo te analize nan inivèsite vil Nagoya nan Japon. Yo te chwazi kenz echantiyon wòch ren CaOx nan plizyè milye koleksyon wòch ren imen nou yo ki baze sou enfòmasyon espèktroskopi enfrawouj (IR) ak seksyon mens yo te prepare. Yo te estime konpozisyon mineralojik wòch la ak analiz IR. Yo te aplike yon metodoloji seksyon mens petrolojik, ki te fèt orijinèlman pou envestigasyon jewolojik, nan envestigasyon wòch ren sa a55. Echantiyon wòch ren yo te antyèman entegre nan résine epoksidik ak koupe. Seksyon kwa a te mouye ak abrazif (SiC ak Al2O3), ak Lè sa a, figi poli a te respekte yon glise vè lè l sèvi avèk résine epoksidik. Yo te fè yon dezyèm koupe pou fè yon echantiyon epesè 1-mm paralèl ak glisad vè a. Lè sa a, echantiyon an te poli desann nan yon epesè nan 20-30 µm epi fini ak poli a pa sispansyon dyaman.

Mikwoskopi polarize ak Fourier transfòme espektrofotometri enfrawouj.Karakteristik optik chak kristal ki konpoze pyè ren yo te obsève pa mikwoskòp polarize ak seksyon fragman wòch 20-30 µm epè. Endèks sifas chak avyon COD te detèmine lè w konpare obsèvasyon an ak fòm kristal COD tipik ki kalkile pa VESTA56. Ki baze sou karakteristik optik yo, kristal yo te klase, Lè sa a, analize ak yon Fourier transfòme espektrofotomèt enfrawouj (FT/IR6100, JASCO). Ranje nimewo onn mezi a te 7800–350 cm-1. Tout mezi yo te fèt nan tanperati anbyen. Yo te fikse gwosè plas mezi a nan 20 × 20 µm2. Faz kristal yo te idantifye baze sou spectre IR yo jwenn ak baz done RRUFF la.

Tach imunofluoresan miltikolor nan matris pwoteyin lan.Te seksyon wòch yo itilize pou analiz faz mineral yo te itilize tou pou analiz distribisyon pwoteyin ak tach Multi-IF. Seksyon mens yo te trete ak yon solisyon sitrat (pH 6.0) pou 1 minit pou yon grave grave. Yo te lave seksyon an ak saline tampon fosfat (PBS), apresa bloke pou 60 min nan 1 pousan albumin serik bovin nan saline tampon fosfat ak Tween 20 (PBST). Apre bloke a, yo te enkube seksyon an ak antikò prensipal lannwit lan nan tanperati anbyen. Antikò prensipal yo te itilize yo se sourit monoklonal anti-kalgranulin A (1:100 dilution, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), lapen poliklonal anti-osteopontin (1:100 dilution, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ), ak mouton monoklonal anti-moun prothrombin Fragman 1 (1:500 dilution, Cedarlane Ontario, Kanada, CL20111AP). Lè sa a, seksyon an te lave 3 fwa ak PBS pou 10 minit anvan enkubasyon ak antikò segondè konjige fliyoresan pou 1 èdtan, pwoteje kont limyè. Antikò segondè konjige fluorescent yo te itilize yo te anti-Lapen IgG (H plis L) Cross-Adsorbed konjige ak Alexa Fluor 488, anti-Mouse IgG (H plis L) Cross-Adsorbed konjige ak Alexa Fluor 546, ak anti-Sheep IgG (H). plis L) Cross Adsorbed konjige ak Alexa Fluor 647. Afer vaste 3 fwa lave ak PBS pou 10 min, fluoresans te detekte lè l sèvi avèk yon konfokal Auto-Fluorescence Microscopy (Nikon A1R). Eksitasyon ak longèdonn emisyon kolekte enkli eksitasyon 487 nm (emisyon kolekte ant 500 ak 550 nm), eksitasyon 561 nm (emisyon kolekte ant 570 ak 620 nm), ak 639 nm (emisyon kolekte ant 663 ak 738 nm) pou OPN, RPTF 46}}, ak Cal-A, respektivman. Oto-fluoresans (AF) te obsève nan yon pati nan echantiyon yo, men entansite siyal la te byen lwen pi ba pase siyal pwoteyin yo diskite nan etid sa a. Yo te evalye tou obligatwa nan antikò ki pa espesifik nan pwoteyin sib yo. Absans siyal IF ki soti nan antikò ki pa espesifik yo te konfime. Tès kontwòl negatif yo te fèt pou evalye absans siyal fo-pozitif (figi siplemantè S5). Pou tach antikò, yo te itilize kontwòl izotip pou detekte nenpòt ki obligatwa ki pa espesifik. Espesyalman, antikò prensipal yo te itilize pou kontwòl yo te lapen (DA1E) mAb IgG XP izotip kontwòl (1:100 dilution Cell Signaling), sourit (G3A1) mAb IgG1 izotip kontwòl (1:100 dilution Cell Signaling), ak mouton mAb IgG izotip (1). :100 dilution Novus) lè l sèvi avèk menm antikò segondè ki gen etikèt fluorescent kòm pi wo a. Te liy pwofil yo te konstwi ak ImageJ, ki montre pwen kontras ki pi wo ak pi ba a kòm 100 pousan ak 0 pousan, respektivman, pou chak pwoteyin.