Nano lèt Pwoteyin-Mucilaj konplèks: Karakterizasyon ak efè antikansè Pati 2
Mar 19, 2022
Pou plis enfòmasyon, kontaktetina.xiang@wecistanche.com
Klike sou lyen an pou w aprann pati 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html
3. Materyèl ak Metòd
3.1. Materyèl
Plantago ovata (subgoal) kale ak fwi matrité Ziziphus Spina-Christi(Nabeq) yo te achte nan men Giza, peyi Lejip; Lèt pwoteyin konsantre (MP, 81.3 pousan pwoteyin) te achte nan konpayi Fonterra (Auckland, New Zeland). Pwoteyin kazein ak laktoserom nan MPC yo se lajman nan fòm micellar natif natal yo ak menm jan ak sa yo jwenn nan lèt. Tout pwodwi chimik yo te itilize yo te nan pite analyse.
3.2.Preparasyon Isabgol Husk Mucilage (IHM) ak Nabeg Mucilage (NabM)
Isabgol husk mucilage (IHM) ak Nabeq mucilage (NabM) yo te prepare dapre metòd ki dekri pa El-Maksoud et al. [5]. Yon ti tan, yo te prepare yon sispansyon nan isabgol kals pa fonn 1.2 g nan 100 mL dlo distile ak pirifye ak solisyon asetòn. Jèl ki te lakòz yo te estoke nan frijidè a (4-5 degre) jiskaske yo itilize.
Pou NabM, fwi Nabeq ki mi yo te byen lave ak dlo tiyo pou retire pousyè tè. Fwi fre yo te separe ak grenn yo epi melanje ak dlo distile nan yon rapò 1:10 (w/v) apre yo fin koupe an ti moso. Melanj lan te melanje lè l sèvi avèk yon blenndè laboratwa (Toshiba Mixie, Japon) epi li te pèmèt yo kanpe pou 12 èdtan nan frijidè a.
Lè sa a, ekstrè mucilaginous la santrifuje nan 2000 rpm pou 30 min epi filtre atravè yon twal muselin. Mizilaj ki ka fonn gluan ki te lakòz yo te presipite ak asetòn. Mizilaj brit yo te jwenn yo te estoke nan frijidè a jiskaske yo itilize.
Pou rezon analyse, yo te cheche mucilaj la nan yon fou lè a 40 degre ak tè lè l sèvi avèk moulen boul MM400 (Retsch, Almay). Yo te mezire konpozisyon chimik psyllium husk mucilage poud (PHMP) ak Nabeq mucilage poud (NabMP). Imidite, pwoteyin, grès, sann, fib brit, ak total idrat kabòn yo te 8.49, 0.34,0.21,2.13,1.53, and87.44 pousan pou PHMP ak 9.18,4.72,2.05,2.69,1.70, and78.26 pousan pou NabMP. , respektivman. Poud ki te lakòz yo te estoke nan yon tanperati fre (4-5 degre) jiskaske plis analiz.
Klike pou w aprann plis enfòmasyon
3.3. Preparasyon nan lèt pwoteyin-mucilaj konplèks (MPMC)
Konplèks pwoteyin lèt (MP) ak IHM ak NabM te prepare dapre Morr et al. ak kèk modifikasyon [44]. Konsantre pwoteyin lèt te rekonstitye nan dlo distile (10 pousan). Te koloyid pwoteyin lèt ki te lakòz yo melanje ak IHM ak NabM nan yon rapò 1:3 (o/o). Yo te ajiste pH melanj lan a 10 epi kite l kanpe pou 10 min. Apre sa, pH la te bese a 3.5 lè l sèvi avèk 0.1 N HCl epi kite pou yon lòt 10 min. Lè sa a, pH la te ajiste nan pH 4.6 lè l sèvi avèk 0.5 M NaOH pou kolekte MPMC pa filtraj sou yon papye filtre: MP, osi byen ke MPMC ki rezilta a, yo te cheche pa lyofilizasyon nan -45 degre C pou 24 èdtan lè l sèvi avèk lyophilizer Novalyphe-NL500 la. , Savant Instruments, Holbrook, NY, USA.
3.4. Karakteristik fizikochimik ak fonksyonèl
3.4.1.PH Mezi
Yo te mezire pH pwodwi yo nan solisyon 10 pousan lè l sèvi avèk yon mèt pH kalibre (HANNA, HI 902 m, Almay).
3.4.2.Detèminasyon Dansite Bulk (BD), Dansite Tapped (TD), ak Endèks Carr
Yo te vide poud MPMC nan yon silenn mezire 50 mL jiska 25 mL, ki koresponn ak volim ki pa eksplwate a, ak Lè sa a, tape 5-10 fwa jiskaske pa gen okenn lòt chanjman nan volim poud lan te note ki koresponn ak volim eksplwatasyon an.
Yo te detèmine dansite esansyèl la, dansite tape, ak endèks Carr nan aplike ekwasyon sa yo [45]:
(1)BD=mas/volim ki pa eksplwate
(2)TD=volim mas/tapped
(3)Endèks Carr a (pousan)= (TD-BD)/TD×100
3.4.3. Endèks absòpsyon dlo (WAI) ak Endèks solubilite dlo (WSD)
Solibilite dlo ak endis absòpsyon dlo nan MP ak MPMC yo te egzamine dapre metòd ki dekri pa Yagc ak Gogus ak kèk modifikasyon [46]. Echantiyon yo (0.5 g) yo te gaye nan 10 mL dlo distile a 25 degre nan yon tib santrifijeur. Apre yo fin kanpe pou 30 minit, ak envèsyon tib chak 5 minit, echantiyon yo te santrifuje nan 3500 rpm pou 15 min. Te filtraj la transfere sou yon plak aliminyòm epi sèk pou 3 èdtan nan 105 degre. Pwa jèl ki rete a te anrejistre epi yo te detèmine WSI ak WAI jan sa a:
(4)WAI(g/g)= Pran pwa jèl/Pwa sèk echantiyon an
(5)Posan WSI=Pwa solid sèk nan supernatant × 100/Pwa sèk echantiyon an
3.4.4. Dijèstibilite Pwoteyin Lèt
Dijèstibilite pwoteyin yo te detèmine dapre Abd El-Ghany et al. [47]. Yon ti tan, echantiyon MP ak MPMC yo te gaye nan dlo distile nan yon konsantrasyon 6.38 mg/mL, epi pH la te ajiste a 8. 0. Yon mililit solisyon stock anzim ki fèk prepare (1.6 mg/mL tripsin, 3.1 mg/mL chimotripsin, ak 1.3 mg/mL ER amino peptidase1).
(ERAP1) te melanje ak sispansyon pwoteyin nan 37 degre. Yo te anrejistre pH la apre 10 min, epi yo te detèmine aktivite anzim lè l sèvi avèk kazein kòm referans. Yo te itilize ekwasyon sa a pou kalkile dijèstibilite pwoteyin [47]:
(6) pousan dijèstibilite=210.46-18.10 (pH)
3.5.Fraksyon fenolik nan PHM ak NabM
Konpoze fenolik nan echantiyon mucilaj lè l sèvi avèk analiz HPLC yo te fèt pa pwotokòl ki dekri pa Elsayed et al. [48]. Yon ti tan, yo te analize ekstrè mizilaj la lè l sèvi avèk yon sistèm HPLC seri Agilent 126 0 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Separasyon an te pase lè l sèvi avèk kolòn C18 la (100 mm × 4.6 mm id, 5 um). Faz mobil lan te genyen (A) dlo 0.2 pousan H3PO4, (B) methanol, ak (C) asetonitrile nan yon pousantaj koule 0.6 mL/min. Elite gradyan te tankou pou pwochen konplo a: 0-11 min (96 pousan A., 2 pousan B);11-13 min (50 pousan A, 25 pousan B);13-17 min (40 pousan A, 30 pousan B);17-20.5 min (50 pousan B, 50 pousan C); ak 20.5-30 min (96 pousan A, 2 pousan B). Longèdonn deteksyon an (UV detektè, 284 nm) te mete nan 284 nm. Gwosè piki a te 20 μL epi yo te kenbe tanperati kolòn nan 30 degre. Konpoze yo te konnen lè yo konpare tan retansyon yo ak sa yo ki soti nan estanda natif natal. Yo te itilize koub kalibrasyon pou evalye kantite konpoze yo.
3.6.Total Phenolic ak Flavonoid kontni nan MP ak MPMC
Kontni polifenolik te detèmine pa metòd Folin-Ciocalteu ak kèk modifikasyon [5]. An brèf, 2.8 mL milli-Qwater ki gen 10 mg MP oswa MPMC yo te melanje ak 2 mL 2 pousan kabonat sodyòm, ak 0.1 mL 50 pousan Folin-Ciocalteau reyaktif. Apre 30 min nan enkubasyon nan tanperati chanm, yo te mezire absorpsyon melanj reyaksyon an nan 750 nm kont dlo deyonize kòm yon vid lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt (Hitachi, Modèl 100-20). Asid galik (GA) te itilize kòm yon konpoze fenolik estanda, epi yo te konstwi yon koub estanda sèt pwen (0-200 mg/L). Rezilta yo te eksprime kòm ekivalan miligram asid galik pou chak gram pwoteyin (GAE/g).
Flavonoidkontni an te detèmine lè l sèvi avèk metòd la klori aliminyòm jan Abedelmaksoud et al. ak kèk modifikasyon [5]. An brèf, 2.8 mL milli-Q dlo ki gen 10 mg MP oswa MPMC te melanje ak 0.1 mL 10 pousan klori aliminyòm hexahydrate ak 0.1 mL acetate potasyòm 1 M. Apre enkubasyon nan tanperati chanm pou 40 min, yo te mezire absorpsyon melanj reyaksyon an nan 415 nm kont dlo deyonize kòm yon vid. Quercetin te itilize kòm yon estanda itilize yon koub estanda sèt pwen (0-50 mg/L). Kontni total flavonoid te eksprime kòm ekivalan miligram quercetin (QE/g).
3.7. Aktivite antioksidan MP ak MPMC
Kapasite total lib radikal MP ak MPMC te evalye lè l sèvi avèk twa diferan tès antioksidan: Stable 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline{{5 }} asid sulfonik (ABTS), ak radikal Hydroxyl radikal (HS) jan yo te dekri deja pa El-Maksoud et al [5].
3.8. Asid amine pwofil MP ak MPMC
Echantiyon pwoteyin yo te idrolize asid lè l sèvi avèk 6 N HCl dapre Peksa et al. [49. Yo te itilize yon analizè otomatik asid amine (AAA 400, INGOs Ltd.) pou detèmine asid amine.
3.9. Pwopriyete reolojik
Yo te prepare echantiyon yo jan Barnes [50] te dekri ak kèk modifikasyon. Viskozite 2.5 pousan (w/w) solisyon nan pH7 te detèmine nan 25±1 degre lè l sèvi avèk yon viskozimèt Brookfield（DV-II plis Pro, Rheocalc Software, Almay）. Estrès （σ） ak viskozite （n） yo te trase kòm yon fonksyon de taye taye. Yo te kalkile endèks konsistans (K) ak endis konpòtman koule (n) nan modèl lalwa pouvwa a:
Valè n egal a 1 pou likid Newtonyen yo epi li varye ant 0 a 1 pou likid ki taye-eklèsi ak pi gran pase 1 pou likid ki taye-epesisman [51].
3.10.Diferansyal analiz Kalorimetri (DSC)
Pwopriyete tèmik MP ak MPMC yo te mezire lè l sèvi avèk yon kalorimèt optik diferans (PerkinElmer, USA). Yo te mete echantiyon (4-6 mg) nan yon plak aliminyòm epi sele. Lè sa a, chak chodyè te chofe a 350 degre ak yon koule nan gaz nitwojèn sèk nan 20 mL min-I nan yon vitès chofaj nan 10 degre min -1. Soti nan pik andotèmik tèmogram DSC la, yo te estime tanperati denaturasyon an, tanperati tranzisyon maksimòm, ak pwen degradasyon [52]. Yo te detèmine valè enthalpy tranzisyon (AH) ki soti nan zòn ki anba pik andotèmik nan koub DSC a, epi yo te itilize chodyè aliminyòm vid la kòm referans.
3.11. Fourier-transfòme enfrawouj Spectroscopy (FTIR)
Enfrawouj spectre ant 600 ak 3500 cm-I yo te mezire nan 25 degre lè l sèvi avèk yon espektrofotomèt FTIR (QFA Flex, USA) pa metòd la refleksyon total atenye lè l sèvi avèk yon rezolisyon nan 4 cm-I ak akeri 10 eskanè pou chak segonn.
3.12. Mikwoskopi elektwonik transmisyon
Mikwostrikti MP ak MPMC te vizyalize lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elèktron transmisyon (JEOL, JEM 1400 Flash, Japon) nan 80 kV. Yo te aplike etap kriyo nan metòd tach negatif [53].
3.13.Etid byolojik sou MP ak MPMC
3.13.1.In Vitro Aktivite Antikansè
Tout liy selil yo itilize nan eksperyans sa a te jwenn nan American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Yo te itilize de liy selil kansè imen nan tès sa a: adenokansòm mamè (MCF{{0}}, ATCCHTB-22TM) ak kansòm epatoselilè (HepG2, ATCC4 HB{-8065TM). Yo te teste tou liy selil fibroblast BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) ak epitelyal tete MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) pou konparezon. Liy selilè yo te grandi nan mwayen Eagle's modifye Dulbecco a (DMEM/glikoz segondè, HyCloneTM, USA) siplemantè ak 10 pousan serom fetis bovine (FBS, Gibco, Brezil), 100 U/mL penisilin, 100 ug/mL streptomycin, ak 25 ng/. mL amphotericin B (Sigma, Oakville, ON, Kanada) ak kiltive nan 37 degre ak 5 pousan CO, nan yon enkibatè imidite. Mwayen kilti a te ranplase chak lòt jou ak yon mwayen fre. Lè selil yo te rive nan 70 pousan konfluyans, yo te detache lè l sèvi avèk 0.25 pousan Trypsin-EDTA (1X) Gibco, Kanada, epi yo te transfere nan yon nouvo flakon kilti. Apre dezyèm pasaj la, yo te trypsinize selil yo epi yo te plake yo nan yon plak 96-byen nan yon konsantrasyon 2×10* selil/pi. Apre 24 èdtan nan enkubasyon, yo te decante mwayen an, epi selil yo te lave de fwa ak PBS Lè sa a, trete ak 200 μL nan mwayen kilti ki gen diferan konsantrasyon nan echantiyon pwoteyin (1, 5, 10, ak 20ug / mL). Doxorubicin HCl (4 ug/mL) te itilize kòm yon kontwòl pozitif, pandan y ap selil trete ak yon mwayen san sipleman yo te pran kòm yon kontwòl negatif. Plak yo te enkube nan 37 degre C pou 24 èdtan ak laanti-kansèaktivite echantiyon yo te detèmine lè l sèvi avèk yon tès absorption wouj net dapre Repetto et al. [54]. Yon ti tan, apre peryòd enkubasyon an, mwayen an te ranplase ak 150 uL koloran wouj net (100 mg/mL) ki fonn nan yon mwayen san serom, epi selil yo te enkube nan 37 degre C pou 3 èdtan. Apre sa, selil yo te rense ak PBS, epi 150 μL medyòm elisyon (EtOH/AcCOOH, 50∶1) te ajoute ki te swiv pa dousman souke pou 10 minit asire disolisyon konplè. Absorbans te mezire nan 540nm lè l sèvi avèk yon lektè plak mikrotiter (BioTek, 96 Well Plaques, ELX808, USA).
kote Ac se absorbans kontwòl la ak As se absòbe echantiyon an. Pousantaj lanmò selil ki prezante kòm sitotoksisite (pousan) ak konsantrasyon ki touye 50 pousan selil (IC50) te kalkile pou chak echantiyon.
3.13.2.Detèminasyon Nivo Pwoteyin p53, Bax, Caspase-3, ak Bcl{-2
Nivo selilè makè pwoteyin kle apoptoz yo te detèmine apre 24 èdtan apre tretman ak ICso MP ak MPMC. Yon ti tan, Hep G-2, MCF-7, Bj-1, ak MCF-12F selil yo te simen nan 5 × 10* selil/pou nan 6-pi. asyèt. Apre 24 èdtan nan enkubasyon ak echantiyon yo nan 37 degre, selil yo te kolekte epi liz epi santrifuje a 10,000rpm pou 20 min nan 4 degre. Konsantrasyon pwoteyin te quantifye nan supernatant la pa tès Bradford [55]. Yo te analize aktivite kaspas-3 lè l sèvi avèk yon twous tès kolorimetri (Abcam, ab39401) dapre enstriksyon manifakti a [56]. An brèf, 10 mg pwoteyin yo te ajoute nan 50 uL nan substra Caspase ak volim final la te ajiste a 200 μL lè l sèvi avèk tanpon reyaksyon an nan 37 degre, epi yo te melanj lan enkube pou 1 èdtan nan fè nwa a ki te swiv pa mezire Caspase {{24} } konsantrasyon nan 405 nm.
Nivo makè pro-apoptotik p53, asosye X(Bax), ak makè anti-apoptotik lenfom selil B-2(Bcl-2) yo te detèmine nan lisat selil lè l sèvi avèk Esè Imunosorban ki Lye ak Anzim Etap Senp. ELISA dapre enstriksyon manifakti a (ab207225, ab119506, ak ab199080; Abcam, USA), respektivman [57,58].
3.13.3.ADN domaj pwovoke pa pwoteksyon estrès oksidatif
Te analiz domaj ADN te pote jan sa te dekri deja pa Leba et al. [59] ak yon ti modifikasyon. An brèf, 3 μL nan plasmid inibitè ribonukleaz RNH1（NM_203387）Human Tagged ORF Clone 10 ug/μL yo te melanje ak reyaktif Fenton a (5 mM H2O2 ak 0.3 mM). nan FeSO4 ak 0.6 mM nan EDTA), epi yo te ajiste volim final la a 25 μL lè l sèvi avèk tanpon fosfat (H2POA, 8.3 mM, pH 7.4). Lè sa a, solisyon an te enkube pou 20 minit nan 37 degre. Pou evalye kapasite pwoteksyon antioksidan MP ak MPMC kont domaj ADN pwovoke pa reyaktif Fenton a, yo te ajoute 5 ug/mL MP/NabM, MP/IHM, ak MP anvan enkubasyon. RNH1 plasmid DNA (3 μL, 10 ug/μL) te itilize kòm kontwòl pwoteksyon ADN.
3.13.4.PCR ki baze sou Genomic DNA Domaj essai
Jèn Homo sapiens methylenetetrahydrofolate reduktaz (MTHFR) te anplifye lè l sèvi avèk PCR soti nan jenomik san ki te deja ekstrè nan echantiyon san ki an sante lè l sèvi avèk yon twous ekstraksyon ADN estanda [60]. ADN te enkube pou 10 minit avèk oswa san reyaktif Fenton a konplete ak MP oswa MPMC. Yon fragman 198-bp te anplifye lè l sèvi avèk forward5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' ak ranvèse 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'primer. Sèvi ak 50ng nan ADN trete, anplifikasyon PCR te fèt apre pwochen thermocycler (94 degre pou 5 min, ki te swiv pa 25sik nan denaturasyon, 30s yo nan 94 degre; rkwir, 30s nan 60 degre; ak ekstansyon, 30s nan 72 degre) pou 25 sik ak 1 sik ekstansyon final nan 72 degre pou 5min. Yo te aplike echantiyon reyaksyon PCR yo pou elektwoforèz jèl agarose (2 pousan).
3.13.5. Profile ekspresyon jèn pa RT-qPCR
Analiz ekspresyon jèn nan jèn makè kle pro-ak anti-apoptotik yo te fèt ak selil HepG-2, MCF-7, Bj-1 ak MCF{-12F ki ekspoze a IC50 yo te jwenn. done (Tablo 3) pou 72 h. Yon ti tan, RNA total yo te ekstrè lè l sèvi avèk Total RNA Purification Kit (QIAGEN., Thorold, ON, Kanada) dapre enstriksyon manifakti a. cDNA
sentèz te pote soti jan Aboul-Sound et al te dekri deja. [61]. Pwogram anplifikasyon ak espesifik PCR anplikon yo te fèt ak evalye pa itilizasyon yon Rotor-Gene O 5-Plex HRM tèmik sikilasyon (Qiagen, Almay) ak Quanti-Tect SYBR-Green PCR Twous (Qiagen, Almay) jan yo te dokimante deja. swiv pwotokòl estanda [61]. Yo te itilize primè sa yo: Hs_P{53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); Lenfom selil B 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011); Bcl-2-tankou pwoteyin Hs{_BAX{_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); ak 18S rDNA housekeeping (HK) jèn Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay (QT00199367). Pwogram tèmik monte bisiklèt PCR ak analiz ekspresyon jèn pou detèmine chanjman pliye an parapò ak jèn 18S yo te esansyèlman fèt jan yo te deja rapòte [61].
3.14.Estatistik analiz
Rezilta yo jwenn yo te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda. Estatistik yo te reyalize lè l sèvi avèk SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, USA). Yo te itilize tès miltip Duncan a pou detèmine diferans enpòtan yo pami tout echantiyon yo, epi yo te konsidere diferans ki enpòtan nan p.<>
4. Konklizyon
An konklizyon, etid sa a te revele ke melanje pwoteyin lèt akpolisakaridatravè diferansyasyon nan pH solisyon se yon teknik apwopriye pou complexation. Konsiltan lèt pwoteyin mucilaj konplèks (MPMC) gen siyifikativman pi wo fenolik akflavonoidkontni pase pwoteyin nan lèt (MP) .DSC rezilta yo te montre ke konplexasyon an nan MP ak polisakarid siyifikativman ogmante estabilite nan tèmik ak yon chanjman nan tanperati denaturasyon. Yo te fè analiz FTIR pou idantifye gwoup fonksyonèl yo, epi yo te envestige konpòtman koule nan konplèks yo prepare. WSI ak WAI nan pwoteyin lèt yo te ogmante pa konplèks ak NabM oswa IHM. TEM te itilize pou visualiser microstructure de complexes pwepare yo. Nan lòt men an, konplèks pwoteyin lèt yo ki kapab lakòz ak isabgol mucilage (HM) oswa Nabeq mucilage (NabM) espere depase pwoteyin lèt natif natal nan efè antioksidan ak antikansè. An rezime, MPMCexpressed inik pwopriyete antikansè kont kansè nan tete modèl ak liy selil kansòm epatik (MCF7 ak HEPG2, respektivman) jan yo pwouve pa yon tès absorption wouj net.
MPMC amelyore tou deantioksidanak aktivite anti-proliferasyon. Caspases yo se pwoteyin regilatè kle ki enplike nan endiksyon apoptoz. Regilasyon nan pwoteyin caspase 3 ak transkripsyon mRNA yo (Figi 9A, B) kontwole lòt pwoteyin nan chemen apoptoz la, ki karakterize pa efondreman manbràn mitokondriyo a ak lage cytochrome c Bax-induit ak aktivasyon kaspase 9 ki mennen nan angajman an ki vin apre nan. caspase 3. Up-regleman Casp3, p53, ak Bax, ansanm ak rediksyon nan ekspresyon Bcl-2 revele ke MPMCinduced apoptoz endiksyon, kote upregulation nan p53 pral estimile ekspresyon nan Bax, ki, nan vire, pral pwovoke cytochrome c. lage, ki te swiv pa kaspas-9 ak-3 aktivasyon. Anplis, Bcl-2 li te ye pou anpeche lage cytochrome c. Nan etid nou an, MPMC-induit Bcl-2 downregulation yo te montre fasilite san opozisyon Bax-induit cytochrome c liberasyon ak apoptoz ki vin apre.
Efè antikansè konplèks pwoteyin-polysakarid bay plis lumières sou aplikasyon konplèks sa yo pou itilize nan devlopman terapi kansè abòdab ak efikas ak efè segondè minim.
