Rejim ki baze sou plant yo te asosye ak yon pi ba risk pou yo devlope maladi kwonik tankou obezite

Tanpri kontakteoscar.xiao@wecistanche.compou plis enfòmasyon

Résumé:Li te sigjere ke epina ekstrè metanolik (SME) inibit fòmasyon nan pwodwi fen glikasyon avanse (AGEs), ki ogmante pandan pwogresyon dyabèt, kidonk li enpòtan pou konnen si SMEs gen efè benefisye sou retin dyabetik la. Nan etid sa a, tès in vitro te montre ke SME inibit glikasyon, fòmasyon gwoup karbonil, ak diminye-tiol gwoup rediksyon nan albumin serom bovin enkubasyon swa diminye sik oswa methylglyoxal. Efè SME nan retin rat dyabetik streptozotocin-induced (STZ2) te etidye tou (n=10) nan gwoup la normoglycemic, STZ, rat STZ trete ak SME, ak rat STZ trete ak aminoguanidine (referans anti-AGEs). gwoup) pandan 12 semèn. Retin lan te seksyone ak immunostained pou Ne-carboxymethyl lysine (CML), reseptè RAGE, NADPH-Nox4, inductible nitrique synthase (iNOS), 3-nitrotyrosine (NT), nikleyè NF-kB, vaskilè endothelial kwasans faktè ( VEGF), pwoteyin asid fibrilè glial (GFAP), pwoteyin S100B, ak tès TUNEL. Peroksidasyon lipid te detèmine nan retin antye a pa nivo malondialdehyde (MDA). Rezilta yo te montre ke nan retin dyabetik, SME redwi ko-lokalizasyon CML-RAGE, estrès oksidatif (NOX4, iNOS, NT, MDA), enflamasyon (NF-B, VEGF, S10B, GFAP), ak apoptoz (p).<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Mo kle:epina; retinopati dyabetik; pwodwi fen glikasyon avanse; estrès oksidatif; enflamasyon; KOLER; karboksimetil L-lizin

Tanpri klike isit la pou konnen plis

1. Entwodiksyon

Rejim ki baze sou plant yo te asosye ak yon pi ba risk pou yo devlope maladi kwonik tankou obezite, dyabèt tip 2, ak maladi kè kardyovaskulèr. Epina (Spinacia oleracea L.) se yon legim fèy manjab ki konsome nan tout mond lan akòz li bay yon kantite fib, vitamin ak mineral [1,2]. Yo idantifye plizyè fitochimik li yo, tankou klowofil, karotenoid (lutein ak zeaxanthin) [3], ak konpoze fenolik (flavon, flavonoid, koumarin) [4-8] (gade sipleman 1). Yo te rapòte ke epina, lè yo enjere kòm yon manje, dlo-idrosolubl ekstrè, oswa nan yon fòm friz-seche, ak thylakoids li yo gen anti-kansè, anti-obezite, ak pwopriyete ipoglisemi [9]. Yo te demontre efè anti-enflamatwa epina nan modèl endotoksemi bèt, bèt obèz, ak moun ki an sante [9]. Efè antioksidan li yo te etidye nan selil kansòm pwostat imen, modèl bèt ak obezite, sourit UV-iradyasyon, ak adenokarcinom nan pwostat sourit transjenik [9,10]. Efè anti-glycation ak anti-enflamatwa nan ekstrè metanolik epina (SME) yo te etidye nan modèl la nan dyabèt glikoz-induit nan zebrafish ak isoproterenol-induit necrosis myokad nan rat, respektivman [11,12]. SME diminye emoglobin glikozile ak nivo fruktozamin, ki gen ladan nivo pwoteyin glike, lè li diminye aktivite aldoz reduktaz nan lantiy lantiy la [11]. Konklizyon ki anwo yo sijere ke SMEs ta ka gen yon efè prevantif sou pwogresyon nan konplikasyon dyabèt melitus tankou retinopati dyabetik (DR).

DR pwogresivman mennen nan pèt akwite vizyèl oswa avèg ki te gen rapò ak enflamasyon, estrès oksidatif, ak akimilasyon nan pwodwi fen glikasyon avanse (AGEs) [13,14]. AGE yo pwovoke retikilasyon pwoteyin, chanje estrikti / fonksyon ak woulman / clearance li yo. AGE yo ka pwodwi pa yon reyaksyon ki pa anzim ant glikoz la ak yon gwoup amine gratis nan pwoteyin, fòme entèmedyè revèsib tankou baz Schiff ak pwodwi Amadori (fructosamine) [15]. Lòt mekanis pou fòmasyon AGE yo enkli chemen "estrès karbonil", kote oksidasyon sik ak lipid kreye konpoze entèmedyè dikarbonil tankou glyoxal ak methylglyoxal (MGO), ki mennen nan fòmasyon AGE kòm N:-carboxymethyl lysine (CML) [ 16]. Ogmantasyon nivo CML nan serom ak vitre ka yon makè byochimik pou tou de aparans ak pwogresyon DR [17,18]. Nan retin a, aktivasyon reseptè RAGE pa AGEs(AGEs-RAGE) pwovoke twòp ekspresyon nan pwoteyin glial fibrilè asid (GFAP) ak faktè pro-enflamatwa, reglemante pa faktè nuklear kappa-light-chain-enhancer nan aktive B. selil (NF-kB) [19]. NF-kB kontwole pozitivman ekspresyon RAGE lè li aji kòm yon mekanis fidbak pozitif [20].ki sa ki cistancheNan lòt men an, gwo konsantrasyon nan S100B, yon pwoteyin obligatwa kalsyòm, ka aktive tou NF-kB, pwovoke neroenflamasyon ak aktivasyon selil glial [21]. Surekspresyon S100B nan astrosit pwovoke efè nerotoksik ki manifeste pa astrogliosis retin [22].

Cistanche ka anti-aje

Yo te devlope estrateji eksperimantal pou anpeche domaj retin. Gen kèk phytochemicals nan epina izole nan lòt plant yo te asosye ak anpèchman nan AGEs ak estrès oksidatif [8,23-26]. Lutein, astaxanthin, ak kaempferol te pwoteje selil epitelyal pigman retin ki sòti nan imen (ARPE-19) kont domaj atravè pwopriyete anti-AGE, antioksidan ak anti-apoptoz yo [26-28]. Rezilta sa yo sijere ke phytochemicals yo nan epina gen yon wòl enpòtan nan prevansyon nan koripsyon retin tankou DR. Yon lòt estrateji te itilize aminoguanidine (AG) kòm yon inibitè ki pisan nan glikasyon ak aktivite iNOS, diminye akimilasyon CML ak fòmasyon nan précurseur di-karbonylic reyaktif nan rat [29]. Sepandan, nan yon esè klinik miltisantrik ak owaza ak 690 pasyan dyabetik, efè a benefisye pa te etabli klèman [30].

Chanjman yo nan koripsyon retin nan kondisyon ipèglisemi yo te fèk etidye. Se poutèt sa, li enteresan pou konnen si SME pwoteje kouch retin nan domaj ki gen rapò ak anti-AGEs li yo, antioksidan, ak pwopriyete anti-enflamatwa nan retin nan rat dyabetik streptozotocin-induit.

2. Materyèl ak Metòd

2.1.Preparasyon Ekstrè Methanolic nan Epina (SME)

Fèy fre epina (S.oleracea L.) yo te rekòlte nan sezon otòn-ivè nan yon jaden agrikòl nan pwovens Puebla, Meksik, epi yo te idantifye pa yon botanis nan èrbyòm nan Enstiti Nasyonal Politeknik (IPN, Mexico City,). Meksik). Yo te depoze echantiyon bon nimewo 4532 nan èrbyòm Lekòl Nasyonal Syans Byolojik IPN.

Fèy yo te dezidrate ak tise byen mouye. Fèy yo sèk yo te masere ak metanol nan tanperati chanm, yo te filtre nan filtè seluloz (Whatman, Maidstone, UK), epi yo te seche lè l sèvi avèk yon evaporateur vakyòm wotasyon (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Swis) nan 45 degre. bay yon jansiv vèt (95.0g/kg fèy sèk).Anti aje cistancheSME a te estoke nan fènwa nan 4 degre jiskaske itilize. Pou tout tès yo, ekstrè a te rekonstitye nan dlo distile [11].

2.2.In Vitro Assays of SME Anti-Glycation Aktivite

2.2.1. Fòmasyon pwodwi fen glikasyon avanse ki sòti nan albumin serom bovin (BSA-AGEs)

Yo te fè tès BSA-AGEs la, jan sa dekri deja [31]. Yon ti tan, 10 mg/mL BSA (fraksyon V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) te ajoute swa nan D-glikoz 0.5 M, D-fruktoz {{12 }}.5 M, oswa methylglyoxal 2.5 mM, epi fè nan yon solisyon 0.1 M PBS (pH 7.4) ak 0.02 pousan azid sodyòm. Konsantrasyon SME (5, 10,25, 50, 100, ak 200 mg/mL) yo te ajoute nan chak melanj ak Lè sa a, enkube nan 37 degre pou 4 semèn. Apre sa, sik ki pa reyaji yo te retire pa dyaliz kont dlo distile pou de jou nan 4 degre. Nivo BSA-AGE yo te detèmine pa spèktrofotometri fluoresans (Ex370/Em 440 nm; modèl LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK) [32]. Glikasyon an nan pwoteyin BSA pa diminye sik ak MGO yo te yon kontwòl pozitif (BSA glycated), pandan y ap enkubasyon nan BSA glycated ak aminoguanidine (1 mg/mL) te itilize kòm kontwòl negatif (BSA glycated-AG). Yo te fè tès yo an triple.

2.2.2. Fruktozamin tès

Nivo fructosamine te detèmine pa nitro ble tetrazolium (NBT) tès [33], ki baze sou kapasite fructosamine pou redwi NBT, fòme formazan, yon koulè fen-pwodwi anba kondisyon alkalin. Dis mikrolit swa nan kontwòl yo oswa konsantrasyon glycated BSA-enkube SME (BSA-SME) yo te ajoute nan 90 μL NBT nan 2.5 mM, prepare nan yon tanpon kabonat (0.1 M; pH 10.3); tout yo te enkube nan 37 degre C pou 30 min. Yo te mezire absorbans nan 530 nm. Konsantrasyon fruktozamin (nmol/mg) yo te kalkile dapre yon koub estanda nan formazan.

2.2.3. Detèminasyon Fòmasyon Gwoup Carbonyl ak Gwoup Thiol nan BSA-AGEs

Konsantrasyon gwoup Carbonyl te mezire nan BSA-SME ak echantiyon kontwole, dapre Levine et al. [34]. Yon solisyon 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH; 10 mM) nan 400 μL nan 2.5 M HCl te ajoute nan 100 μL chak echantiyon epi enkube nan fènwa pou 60 min nan tanperati chanm.cistanche benefíciosLè sa a, 500 μL asid trichloroacetic (20 pousan w/v) te ajoute epi kenbe sou glas pou 5 min. Echantiyon yo te santrifuje nan 4 000 rpm pou 15 min, epi yo te lave grenn pwoteyin nan twa fwa ak acetate etil/etanòl (1:1 v/v). Apre sa, echantiyon yo te sispann nan 250μL idroklorid guanidine a 6 M. Yo te kalkile konsantrasyon nan gwoup karbonyl (nmol / mg pwoteyin) pa spectrophotometry nan absorpsyon 370 nm (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) lè l sèvi avèk la. koyefisyan absòpsyon DNPH (22,000 M-1 cm-1).

Dapre metòd Ellman a, yo te fè detèminasyon gwoup thiol nan BSA-SME ak echantiyon kontwòl yo. Yon ti tan, 10 μL nan 5,5'-Disulfanediylbis (2-nitrobenzoic asid) (DNTB; 10 mM, prepare nan PBS) ak 50 μL nan echantiyon glycated yo te enkube pou 15 min nan tanperati chanm, Lè sa a, yo te mezire absorbans nan 410 nm. Nivo gwoup thiol gratis yo te kalkile lè l sèvi avèk yon koub estanda L-cysteine（0.4-11 μM） ak eksprime nan nmol/mg pwoteyin [34].

2.3. Efè SME sou retin rat dyabetik 2.3.1.Dyabèt endiksyon nan rat yo

Yo te itilize rat gason Wistar ki te peze 250± 10 gr (N=40) ki te fè jèn pou 8 èdtan. Yo te administre yon dòz intraperitoneal nan streptozotocin (60 mg/kg) nan tanpon sitrat (10 mM, pH 4.5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) [35]. Twa jou apre, yo te mezire nivo glikoz la (glukomèt; ACCU-CHEK aktif; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Almay) lè yo kolekte yon gout echantiyon san nan ke a. Yo te rekrite bèt ki gen nivo glisemi ki pi wo pase 350mg/dL pou etid la. Yo te mezire glikoz nan san chak semèn pou 12 semèn.

2.3.2. Konsepsyon eksperimantal

Rat dyabetik streptozotocin-induced (STZ) yo te divize owaza nan gwoup sa yo (n =10): STZ trete intragastrik ak 2 mL dlo pou bwè (STZ); STZ trete ak SME nan 4 00 mg / kg (STZ-SME); rat normoglisemi (NG); ak STZ trete ak 50 mg/kg aminoguanidine (AG; Sigma-Aldrich, Inc.)(STZ-AG).STZ-AG te itilize kòm yon gwoup referans anti-AGE. Dòz yo te bay yo te administre chak 24 èdtan (9:00 am) pou 12 semèn. Nivo glisemi nan tout gwoup yo te kontwole chak semèn. Rejim dòz SME nan 400 mg / kg te baze sou sa ki annapre yo: yo jwenn 7 g SME nan 100g epina fre (done yo pa montre). Kantite lajan sa a ekivalan a konsomasyon chak jou nan yon moun mwayèn nan 70 kg nan rejim Ameriken an [36], ki koresponn ak 100 mg nan ekstrè / kg nan pwa kò.Cistanche èkstre anti radyasyonNan lòt men an, akòz diferans lan nan metabolis akselere nan rat, li rekòmande pou ogmante konsomasyon nan nenpòt ekstrè natirèl jiska 6.4 fwa pou etid konparezon ak moun [37]. Dòz la nan 400 mg / kg ke nou te itilize te baze sitou sou rezilta yo jwenn nan yon modèl nan necrosis myokad pwovoke nan rat Wistar, ki te montre ke efè a anti-enflamatwa nan SME se pi enpòtan nan 300 mg / kg [12].

2.3.3. Evalyasyon histolojik ak imunohistochimi

Je enucleated yo te fiks nan fòmalin net ak Lè sa a, yo te dezidrate nan alkòl gradye ak entegre nan parafine. Seksyon histolojik nan 2 μm yo te monte sou glisad elektwochaj, dewaxed, ak reyidrate jiska solisyon rekiperasyon antijèn (K035; 10 × Sitrat Tanpon, pH6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Yo te itilize yon sistèm iminodeteksyon ki baze sou polymère (PolyVuemouse/lapen DAB sistèm deteksyon, Dyagnostik BioSystems). Yo te itilize antikò prensipal sa yo: pwoteyin asid fibrilè glial (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA); faktè vaskilè endothelial grandi (anti-VEGF; sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), S100 kalsyòm-obligatwa pwoteyin B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Cambridge, UK) , ak nikleyè faktè kappa-light-chain-enhancer nan selil B aktive (anti-NF-kB p65;sc-8008).Tout dilusyon yo te nan 1:200 ak enkube lannwit lan nan 4 degre. Yo te ajoute yon antikò segondè (sourit/lapen PolyVueTM) dapre enstriksyon founisè a.cistanche herbaSeksyon yo te tache ak DAB plis / chromogen substra ak ematoksilin. Obsèvasyon istolojik ak kaptire imaj yo te fèt nan yon mikwoskòp Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Almay).

Pou tach imunofluoresan, yo te enkube glisad yo lannwit lan nan 4 degre C ak antikò prensipal sa yo: carboxymethyl Lysine (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Cambridge, UK), AGE reseptè (anti-RAGE; sc-365154), NADPH oksidaz 4 (anti-Nox4; ab133303), 3-nitrotyrosine (anti-NT; ab110282), ak nitrik oksid sintaz (inducible) (anti-iNOS; A00368-1; Boster Bio, Pleasanton, CA , USA). Lè sa a, yo te itilize antikò segondè sa yo: pou anti-RAGE, kabrit anti-sourit lgG(FITC)-konjige (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); pou anti-CML ak anti-NT, sourit anti-lapen IgG-PE (SC -3753); ak pou anti-iNOS ak anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Tout yo te enkube nan tanperati chanm pou 60 minit. Apre sa, seksyon yo te monte nan yon mwayen ki gen 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Antikò anti-CML ak anti-RAGE yo te ko-ibrid nan menm glisad la. FLoidTM Cell Imaging Station (teknoloji lavi Carlsbad, San Diego, CA, USA) te itilize pou imaj fluoresans.

2.3.4.Evalyasyon Apoptoz

Apoptoz selil retin yo te detekte dapre manyèl ki dekri pa tèminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-medyatè deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick-end labeling (TUNEL) tès lè l sèvi avèk Twous deteksyon nan selil lanmò in situ, TMR (tetramethyl-rhodamine{{ 3}}dUTP) wouj, vèsyon 12 (12156792910; Roche Diagnostics). Yon ti tan, glisad dewaxed yo te reyidrate epi rense de fwa ak PBS. Lè sa a, yo te enkube ak melanj reyaksyon TUNEL la nan yon atmosfè imidite pou 60 min nan 37 C. Apre sa, seksyon yo te monte ak DAPI ak obsève nan mikwoskospi fluoresans (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD pou TUNEL te kalkile pou kouch retin.

2.3.5. Esè peroksidasyon lipid

Pou evalyasyon nivo malondialdehyde (MDA) nan tisi retin lan, apeprè 3 mg tisi fre (n=3) yo te omojene ak trete jan yo te deja re-pòtaj [38]. Nivo MDA yo te quantifye swiv enstriksyon founisè twous la (OXItek-TBARS assay kit, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).

2.4.Estatistik analiz

Pou analiz estatistik, tout mikrograf retin yo te kaptire ak yon mayitid 200× nan 100 μm pi lwen pase rejyon nè optik la. Yo te analize apeprè 40 imaj pou chak gwoup bèt (n=7). Analiz imaj yo te fèt ak lojisyèl Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Nou te itilize lojisyèl GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA; vèsyon 8.0). Figi yo montre valè yo make nan sima bwat-ak-moustach (medyan, premye-twazyèm katil, valè minimòm-maksimòm) pou kouch selil ganglion (GCL), kouch enteryè nikleyè (INL), ak kouch ekstèn nikleyè (ONL). Mwayèn ak devyasyon estanda (mwayèn ± SD) yo montre nan Apendis A (Tablo A1-A3). Nan tout ka yo, yo te fè yon tès ANOVA yon sèl-fason ki te swiv pa tès Tukey a. p<0.05 was="" considered="" statistically="">