Nc886, yon RNA ki pa kodaj, se yon nouvo biomarker ak medyatè epijenetik nan senesans selilè nan fibroblast.
Apr 14, 2023
Résumé:
Etid fonksyonèl nan òganis ak modèl imen yo te revele ke chanjman epigenetik ka gen yon enpak siyifikativ sou pwosesis la nan aje. RNA ki pa kode (ncRNA), youn nan regilatè epigenetik yo, jwe yon wòl enpòtan nan modifye ekspresyon mRNA yo ak pwoteyin yo. Li ka medyatè fenotip selil yo. Yo te rapòte ke nc886 (=vtRNA2-1 oswa pre-miR-886), yon ncRNA long, ka siprime fòmasyon timè ak foto-domaj nan keratinosit ki te koze pa UVB. Etid sa a te vize pou detèmine wòl nc886 nan repwodiktif senesans fibroblast yo epi detèmine si sibstans ki kapab kontwole ekspresyon nc886 ta ka kontwole senesans selilè.
Nan fibroblasts repwodiksyon senesans, ekspresyon nc886 te diminye pandan y ap ogmante nc886 methylated. Te gen chanjman nan biomarkers senesans ki gen ladan aktivite SA- -gal ak ekspresyon p16INK4A ak p21Waf1/Cip1 nan selil senesan yo. Konklizyon sa yo endike ke diminisyon nan nc886 ki asosye ak aje gen rapò ak senesans selilè fibroblast yo e ke ogmante ekspresyon nc886 gen potansyèl pou siprime senesans selilè. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) ogmante ekspresyon nc886 ak amelyore senesans selilè fibroblast yo pa anpeche biomarqueurs ki gen rapò ak laj yo. Rezilta sa yo endike ke nc886 gen potansyèl kòm yon nouvo sib pou anti-aje e ke ATC kapab yon pisan epigenetic engredyan anti-aje.
Senesans selilè se yon tèm laj ki kouvri fenomèn tankou diminye fonksyon selilè, diminye kapasite proliferasyon, ak domaj ADN ki te koze pa anpil faktè. Senesans selilè se pa yon sèl, pwosesis previzib, men efè konbine nan yon seri de diferan faktè fizyolojik, jenetik, ak anviwònman an. Nan rechèch la, li te jwenn ke Cistanche ka reziste aje paske prensip la anti-aje nan Cistanche se sitou ki gen rapò ak engredyan yo divès kalite aktif li genyen. Cistanche se moun rich nan yon varyete de sibstans ki sou biyolojik aktif, tankou polisakarid, flavonoid, asetofenon, elatriye. Pami yo, polisakarid la se youn nan engredyan prensipal yo aktif nan Cistanche, ki gen divès kalite fonksyon sante tankou amelyore iminite, anti-oksidasyon, reglemante metabolis, elatriye, epi yo ka soulaje degre aje nan kò a.
Klike sou benefis cistanche tubulosa
Mo kle:
fibroblasts; repwodiksyon senesans; règleman epijenetik; nc886; ekstrè te vèt.
1. Entwodiksyon
Senesans selilè nan yon eta irevokabl apre arestasyon pwopagasyon selilè parèt kòm yon kontribitè potansyèlman enpòtan nan malfonksyònman tisi ak aje nan òganis [1]. Senesans karakterize pa gwo aktivite nan senesans ki asosye beta-galactosidase (SA- -gal), ogmante ekspresyon de biomarkers senesans tankou p16INK4A ak p21Waf1/Cip1, ak diminye ekspresyon nan LaminB1 [2]. Gen de kalite debaz nan senesans selilè: senesans replikasyon ak senesans twò bonè estrès. Senesans repwodiktif defini kòm fenomèn lè selil nòmal yo sispann divize apre yo rive nan yon kantite limite nan divizyon. Li gen rapò ak aje kwonolojik. Akimilasyon domaj kontinyèl ka pwovoke replike senesans fibroblast, ki mennen nan pèdi kapasite nan remodel ak òganize matris la ekstraselilè (ECM). Karakteristik prensipal yo nan dèrm yo ki gen laj yo se yon kantite redui nan fib kolagen an ak ogmante pwodiksyon nan matris metaloproteinases (MMPs), ki kontribye nan yon estrikti mens ak dezorganize nan dèrm la [3,4].
Mekanis regilasyon epijenetik yo se medyatè kle nan pwosesis la aje, adapte ak estrès ak chanjman ki gen rapò ak laj nan anviwònman an jenomik ak molekilè. Chanjman epijenetik sa yo rive nan divès nivo, ki gen ladan rediksyon iston nwayo masiv, deformation histon pa modifikasyon apre-tradiksyon ak metilation ADN, ranplasman histones kanonik ak varyant histon, ak ekspresyon chanje RNA ki pa kodaj (ncRNA) pandan senesans òganis ak replikasyon [5]. ,6]. nc886 se 101 nukleotid long ncRNA ki ka mare nan yon pwoteyin sib, kidonk medyatè aktivite a nan pwoteyin nan ak kontwole ekspresyon jèn [7]. nc886 te pwopoze tou kòm yon timè suppressor lajman dedwi pa modèl ekspresyon li yo ak kote jenomik li yo sou kwomozòm imen 5q31, kote a nan jèn nan timè suppressor. Yon karakteristik nan ekspresyon nc886 se silans souvan nan maladi malfezan pa metilation ADN CpG nan rejyon pwomotè a [8]. Dapre etid anvan yo, nou te jwenn ke rediksyon nan ekspresyon nc886 ki te koze pa iradyasyon UVB asosye ak ogmantasyon nan COX-2 ak MMP{-9 atravè chemen pwoteyin kinaz RNA-aktive (PKR) nan keratinosit e ke pwomosyon ekspresyon nc886 kapab yon estrateji itil pou devlope materyèl pwoteksyon UVB [9,10].
Te vèt te etidye kòm yon tretman pou yon varyete de kondisyon dèrmatolojik, tankou akne, rosacée, psoriasis, veri viral, e menm kansè po. Konpoze fenolik ki gen ladan asid galik (GC) ak epigallocatechin gallat (EGCG) se byen koni konpoze aktif nan te vèt. (-)-Epigallocatechin-3-(3"-O-methyl) gallat (3" Me-EGCG) se yon fòm inik O-methylated EGCG epi li genyen nan te oolong ak te vèt. An patikilye, Jangwon No 3 (Amorepacific varyete te vèt) gen plis 3 "Me-EGCG pase lòt varyete te vèt [11]. Yo te rapòte 3" Me-EGCG pou montre efè antioksidan ak fotopwotektif sou keratinosit [12] . Nan etid sa a, nou te mennen ankèt sou wòl nc886 nan repwodiksyon fibroblast yo epi detèmine si trè konsantre te vèt 3 "me-EGCG preparasyon (AbsoluTea Concentrate 2.0) ki ta ka ogmante ekspresyon nc886 ta ka amelyore senesans selilè.
2. Rezilta
2.1. Pwofil chimik AbsoluTea Konsantre 2.0 (ATC)
Pwofil chimik AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) montre nan Figi 1B. Rezilta yo te jwenn lè l sèvi avèk HPLC pou ATC prepare jan sa dekri nan seksyon an Metòd. ATC te genyen 30 pousan oswa plis 3 "Me-EGCG (Figi 1B). Li konnen ke ekstrè te vèt pa gen 3" Me-EGCG oswa montre yon konsantrasyon mwens pase 6 pousan [13,14]. Tou de jèn ak senesan fibroblast trete ak ATC te montre plis ogmantasyon nan ekspresyon nc886 pase sa yo trete ak 70 pousan ekstrè etanòl nan te vèt (figi siplemantè S1A). Anplis de sa, nivo ekspresyon SA- -gal nan fibroblast senesan trete ak ATC te diminye plis pase nan sa yo trete ak ekstrè te vèt (figi siplemantè S1B).
2.2. nc886 kontwole senesans selilè fibroblasts
Pou obsève wòl nc886 nan senesans selilè fibroblasts, nou te itilize yon modèl repwodiksyon senesan atravè grandi ak subkilti. Jan yo montre nan Figi Siplemantè S2, aktivite SA- -gal ak nivo ekspresyon makè senesan p16INK4A ak p21Waf1/Cip1 te ogmante epi ekspresyon Lamin B1 te diminye nan fibroblasts senesan konpare ak selil jèn yo. Anpil etid anvan yo te rapòte ke aje se ki te koze pa estrès oksidatif. Pou konfime si seri estrès oksidatif sa a enplike nan senesans selilè, yo te mezire nivo ROS nan jèn (p3) ak fibroblasts senesan (p30). Rezilta yo te montre ke nivo ROS yo te ogmante ak aje (figi siplemantè S2D).
Pou obsève enpak potansyèl nc886 sou senesans selilè nan fibroblasts, yo te detèmine nivo ekspresyon jèn nc886 nan chak kantite pasaj. Nivo ekspresyon nc886 te diminye ak ogmante nimewo pasaj (Figi 2A). Yo te rapòte ke ekspresyon nc886 diminye ak methylation nan zile CpG. Pou detèmine si nc886 downregulation nan fibroblasts senesan te medyatè pa methylation nan nc886, yo te fè yon PCR methylation-espesifik. Jan yo montre nan Figi 2A, methylation nan nc886 te ogmante ak yon nimewo pasaj ogmante (Figi 2A). Rezilta sa a demontre ke ekspresyon redwi nan nc886 nan yon kantite pasaj segondè nan fibroblast se akòz yon ogmantasyon nan nc886 ADN methylation. Pou verifye wòl nc886 nan senesans fibroblast, yo te detèmine chanjman nan makè senesan nan surespresyon nc886 ak modèl knock-down. Rezilta yo te revele ke gwoup la nan fibroblasts senesan ak nc886 surespresyon te montre diminye SA-beta-gal aktivite, diminye nivo ekspresyon nan p16INK4A ak p21Waf1 / Cip1, ak ogmante nivo nan laminB1.
Anplis de sa, ogmantasyon ROS nan fibroblasts senesan te diminye pa ekspresyon nc886 (Figi 2B). Kontrèman, nan gwoup jèn fibroblasts ki gen nc886 knock-down, senesans selilè te akselere ak nivo ekspresyon nan makè senesan selilè tankou p16INK4A ak p21Waf1 / Cip1 yo te ogmante (Figi 2C). Rezilta sa yo sijere ke nc886 ka kontwole senesans selilè fibroblasts pa reglemante ekspresyon makè senesans (Figi 2B, C).
2.3. ATC diminye senesans selilè pa reglemante ekspresyon nc886
Rezilta yo jwenn pi wo a te montre ke ogmante ekspresyon nc886 ta ka amelyore senesans selilè pa medyatè makè senesan. Pou obsève efè ATC sou ekspresyon nc886, nivo ekspresyon, ak methylation nc886 nan fibroblasts senesan yo te evalye apre tretman ak ATC nan yon konsantrasyon ki pa cytotoxik (Figi 3A). Jan yo montre nan Figi 3B, ak C, ATC siyifikativman ogmante ekspresyon nc886 ak diminye metilation nan nc886 nan yon fason ki depann de konsantrasyon. Rezilta sa a te demontre ke ogmantasyon nan ekspresyon nc886 pa ATC te medyatè atravè anpèchman nan nc886 methylation. Anplis de sa, nou te obsève ke ATC anpeche aktivite SA- -gal ak diminye nivo ekspresyon makè senesan p16INK4A ak p21Waf1 / Cip1 nan fibroblast senesan (Figi 3D, E). Sepandan, ekspresyon LaminB1 li te ye yo dwe diminye ak aje te ogmante nan fibroblasts senesan trete ak ATC (Figi 3E). Rezilta sa yo demontre ke ATC ka bese senesans selilè lè yo ogmante ekspresyon nc886.
Figi 2. nc886 kontwole senesans selilè fibroblasts. (A) Ekspresyon nc886 ak methylated nc886 dapre pasaj la te konfime pa PCR an tan reyèl ak nòmalize ak 18s rRNA. (B) Fragman nc886 anplifye ak pirifye nan ADN jenomik imen an te transfekte nan selil senesan ak Lipofectamine 3000. Yo te konfime twòp ekspresyon lè yo obsève ekspresyon nc886 pa PCR an tan reyèl ak ekspresyon SA- -gal pa mikwoskospi fliyoresan ak sitometri koule. Ekspresyon nan pwoteyin makè senesans ak jenerasyon entraselilè ROS te obsève nan modèl la overexpression nc886. (C) Selil yo te transfekte ak anti-oligos (si-ctrl ak si-nc886) nan yon konsantrasyon 250 ppm lè l sèvi avèk LipofectaminTM RNAiMAX reyaktif. nc886 knock-down te konfime lè yo obsève ekspresyon nc886 pa PCR an tan reyèl ak ekspresyon SA- -gal pa mikwoskospi fliyoresan ak sikometri koule. Ekspresyon makè senesans yo te konfime ak Western blot. Ba echèl: 200 µm. Done yo prezante kòm mwayen ± SD nan twa tès endepandan. *, p <0.05; **, p <0.01 konpare ak kontwòl.
2.4. ATC kontwole Chanjman ECM ak SASP ki gen rapò ak laj yo
Yon karakteristik nan senesans fibroblast se ke aktivite MMP-1, yon eleman ki degrade kolagen an, ogmante, tandiske sentèz kolagen an diminye [15,16]. Ogmantasyon MMP -1 ak diminisyon kolagen an te konfime nan fibroblasts senesan ak nimewo pasaj segondè (Figi 4A).
Sepandan, ATC siprime ekspresyon MMP-1 ak ogmante sentèz kolagen an nan fibroblasts senesan. Rezilta sa a endike ke ATC ka amelyore chanjman ECM ki gen rapò ak laj atravè règleman ekspresyon MMP-1 ak sentèz kolagen an nan fibroblasts senesan (Figi 4B). Yon fenotip sekretè ki asosye ak senesans (SASP) kote selil senesan sekrete faktè espesifik pro-enflamatwa, faktè kwasans, ak anzim proteolitik yo te rapòte pou kontribye nan aparisyon ak pwogresyon maladi ki gen rapò ak aje [17-19]. Nou te obsève efè ATC sou SASP espesyalman pro-enflamatwa cytokines tankou IL-1, IL_6, ak IL-8. Jan yo montre nan Figi 4C, ATC desann nivo ekspresyon IL-1, IL-6, ak IL-8 ki te pwovoke senesans. Sa a sijere ke ATC ka egzèse yon efè anti-aje atravè repwesyon SASP.
3. Diskisyon
Selil senesan sibi chanjman mòfolojik karakteristik ki enplike reòganizasyon nikleyè ak kwomatin elaji e souvan iregilye. Lè senesans pwovoke pa domaj ADN, rediksyon replikasyon, oswa ekspresyon onkojèn, Lamin B1 prensipalman pèdi. Plizyè estrès entèn oswa ekstèn ka deklanche chemen repons ADN domaj (DDR) pou aktive chemen p53 ak/oswa p16INK4A. p16INK4A ka inaktive Cdk4/6, lakòz akimilasyon pRb fosforilate, deranje règleman faktè transkripsyon E2F la, epi pwovoke arèstasyon sik selilè oswa senesans [20,21]. Ogmantasyon pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) ki pwodui sitou pa mitokondri disfonksyonèl ka mennen nan senesans selilè atravè domaj ADN ak transactivation nan chemen siyal senesans, ki gen ladan p53, p16INK4A, ak p21Waf1 / Cip1 [22].
Nan etid sa a, nou te jwenn ke ekspresyon nc886 te diminye ak ogmante kantite pasaj ak ke upregulation nan ekspresyon nc886 bese senesans selilè atravè medyasyon an nan LaminB1, p16INK4A, p21Waf1 / Cip1, ak pwodiksyon ROS. nc886 transkri pa RNA polymerase III (Pol III) ak silans pa ipèmetilasyon ADN CpG nan anpil maladi malfezan [8]. Nou te obsève ke ekspresyon nc886 te diminye ak methylation nan zile CpG nan fibroblasts senesan. Rezilta sa a endike ke hypermethylation nan zile CpG afekte fonksyonalite a nan nc886 kòm yon sipresyon nan senesans selilè.
Chemen ekspresyon jèn espesifik ki afekte nan nc886 yo pa klè. Yo gen anpil chans pou yo enkli deja rapòte pou lòt ncRNAs. nc886 ka jwe wòl enpòtan nan senesans selilè atravè dirèk oswa endirèkteman medyatè chemen siyal senesans nan nivo estrikti chromatin, aktivite faktè transcription, pòs-transcription, ak règleman jèn post-tradiksyon [23]. Pou egzanp, nc886 ka medyatè chemen an senesan nan pwogresyon sik selil.
Yo te rapòte ke AK156230 kòm yon ncRNA ki asosye ak endiksyon nan repwodiksyon senesans nan fibroblast nan wòl li nan otofaji ak pwogresyon sik selilè. Downregulation nan AK156230 pwovoke selil yo montre repons senesans lè yo aktive p53 ak p21 pandan y ap diminye kinaz 1 depandan siklin (CDK1) [24]. Senesans-asosye ncRNA1 (SAL-RNA1), MALAT1, ak MIAT yo konnen kòm regilatè negatif nan senesans selilè. Yo diminye nan fibroblasts senesan. Downregulation nan jèn sa yo ka mennen nan ogmantasyon nan makè senesans tankou SA-gal, p16, p21, ak p53 [25]. Efè MALAT1 sou senesans selilè te reyalize nan n bès nan faktè transcription onkogenic b-Myb/Mybl2.
Malgre ke ekspresyon divès ncRNA yo afekte pandan senesans, se sèlman kèk ki enplike fonksyonèl nan senesans. Paske lokalizasyon ncRNAs enpòtan pou konprann mekanis ki enplike nan fonksyon, ncRNA nikleyè ak sitoplasmik yo diskite separeman lè yo dekri mekanis molekilè ki afekte senesans [26]. ncRNA ki sitiye nan sitoplasm la ka fonksyone kòm yon regilatè tradiksyon atravè pèman baz ak mRNA sib la [27]. ncRNA ka afekte nivo ekspresyon pwoteyin lè yo ogmante oswa diminye estabilite mRNA [28].
Pou egzanp, pandan senesans RAS-induit, sitoplasmik UCA1 kontribye nan estabilizasyon p16 mRNA pa sequestre hnRNPA1 [29]. nc886 gen yon sit obligatwa pwoteyin kinaz RNA-aktive (PKR). PKR-nc886 obligatwa ka anpeche aktivite PKR. PKR, yon reseptè sitoplasmik pou RNA doub-chèn (dsRNA), se reglemante pa serin / treonin pwoteyin kinaz ki aktive pa enfeksyon, sitokin, estrès oksidatif, ak iradyasyon (ki gen ladan UV), ki mennen nan endiksyon ki vin apre nan enflamasyon ak apoptoz [20]. ,21] [30,31]. nc886 mare ak PKR ak yon afinite ki konparab ak dsRNA epi li anpeche PKR aktive. nc886 knockdown rezilta nan fosforilasyon nan inisyasyon eukaryotic faktè 2 (eIF2) atravè chemen PKR la, ki lakòz lanmò selil ak inibit sentèz mondyal pwoteyin selilè. Yo te rapòte ke pwodiksyon an nan COX -2, IL{-8, ak MMPs pa TNF- se medyatè pa chemen an PKR nan kondrosit imen [32].
Nan yon etid anvan, nou te demontre tou ke UVB-pwovoke enflamasyon ka kontwole atravè chemen nc886-PKR nan keratinosit [10]. Anplis, PKR gen rapò ak blesi estrès oksidatif nan myosit kadyak neonatal. Anpèchman PKR pwoteje kont blesi H2O2-pwovoke pa diminye apoptoz ak enflamasyon [33]. Enflamasyon ak estrès oksidatif se pi gwo faktè ki pwovoke pwosesis la aje. Kidonk, chemen PKR la ka medyatè senesans selilè fibroblasts ki te pwovoke pa rediksyon nc886. Pou elicide mekanis regilasyon detaye ki enplike nan efè nc886 sou senesans selilè fibroblast yo, yo bezwen plis etid.
Efè antiaging ekstrè te vèt yo te lajman rapòte nan etid anvan yo. Aktivite antioksidan ak anti-enflamatwa nan te vèt yo se mekanis byen li te ye ki kontribye nan efè anti-aje li yo. Nan yon tès preliminè, nou te jwenn ke ATC ogmante ekspresyon nc886 siyifikativman pa plis pase 70 pousan ekstrè etanolik nan te vèt (Sipleman Figi S1A). Rezilta sa a sijere ke katechin konsantre ki gen ladan 3 "Me-EGCG ka atribiye a upregulation nan ekspresyon nc886. Pou detèmine si ajan an eksitan nc886 ta ka anpeche senesans selilè, nou obsève efè a nan ATC sou fibroblasts senesan. ATC ogmante ekspresyon de nc886 pa anpeche nivo metilation jèn nc886 la nan fibroblasts senesan (Figi 3B, C). ATC te soulaje tou senesans selilè lè li medyatè biomarqueurs senesan tankou aktivite SA- -gal, LaminB1, p16INK4A, ak p21Waf1/Cip1 (Figi 3E). ). Anplis, ogmante MMP-1 ak diminye pwodiksyon kolagen an pwovoke pa senesans selilè te retabli pa ATC (Figi 4B). Faktè SASP yo varye yon ti kras depann sou kalite selil la ak kalite estrès aje-pwovoke, yo souvan. ke yo rekonèt kòm jèn sib pou NF-κB ki kontwole sitokin pro-enflamatwa tankou IL-6 ak IL-8.
Nan etid sa a, nou konfime ke ogmante ekspresyon IL-1, IL_6, ak IL{-8 nan selil senesan yo te siprime pa ATC (Figi 4C). Nou pa ka eskli posiblite pou amelyore efè te vèt sou senesans selilè reyalize pa plizyè mekanis, ki gen ladan règleman nc886, anti-oksidasyon, ak anti-enflamasyon. Sepandan, rezilta nou yo sijere ke ogmante nc886 pa ATC jwe yon wòl kritik nan repwesyon nan senesans selilè, ki imedyatman afekte pwodiksyon ECM nan fibroblast.
4. Materyèl ak Metòd
4.1. Preparasyon pou ATC
Seche fèy vèt te (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No 3) yo itilize pou etid aktyèl la te jwenn nan plant te grandi nan jaden te Dolsongi (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Kore di sid. Fèy te sèk (170 g) yo te ekstrè ak 70 pousan EtOH (v / v) nan tanperati chanm pou 16 èdtan. Lè sa a, ekstrè a te an poud lè l sèvi avèk yon lyophilizer (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Lachin). Pou prepare ATC, ekstrè EtOH a te konsantre dis fwa ak yon evaporateur rotary epi chaje sou yon kolòn ki chaje ak AB-8 résine (dyamèt enteryè 5 cm, longè 45 cm). Elisyon sòlvan nan kolòn nan te fèt ak 4 fwa volim kabann (BV) nan 20 pousan, 30 pousan, ak 100 pousan EtOH (v/v). Nan etid sa a, solvang rezidyèl nan kolòn nan yo te retire ak yon COMPRESSOR lè anvan elisyon. 30 pousan EtOH eluate a te konsantre ven-pliye epi aplike nan yon kolòn poliamid (dyamèt enteryè 2.5 cm, longè 40 cm). Kolòn nan poliamid te eluye 5 fwa BV nan 10 pousan ak 100 pousan EtOH. 100 pousan EtOH eluate a te ak anpil atansyon konsantre ak lyofilize.
4.2. Kilti Selil ak Tretman Selil ak ATC
Yo te achte fibroblasts po imen (HDFs) nan ATCC (Manassas, VA, USA). Kilti selilè yo te fèt nan kondisyon kontwole nan 37 ◦C ak 5 pousan CO2 lè l sèvi avèk mwayen Eagle's modifye Dulbecco a (WELGENE, Daegu, Kore di) konplete ak 10 pousan serom fetis bovin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ak 1 pousan penisilin. -streptomycin (WELGENE, Daegu, Kore di). Selil yo te simen nan 6-plak byen nan yon dansite 2 × 105 selil/plak. Apre yo te rive nan 60 pousan konfluans, yo te trete ak konsantrasyon ki endike nan ATC pou 72 èdtan.
4.3. SA- -Gal tach ak analiz sitometri koule
Selil yo te tache avèk yon Spider- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japon) dapre enstriksyon manifakti a. Selil yo te analize ak yon EVOS® FL Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ak yon sitomèt koule BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).
4.4. Mezi ROS Entraselilè
Pwodiksyon ROS intraselilè te kontwole lè l sèvi avèk C20, 70 -dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA; Molecular Probes), yon endikatè ROS fliyoresan. Selil yo te enkube ak H2DCFDA (5 µM) pou 30 min nan 37 ◦C. Yo te detekte fliyoresans ki asosye ak selil ak yon sitomèt koule BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).
4.5. PCR an tan reyèl ak PCR espesifik pou methylation
Total RNA te ekstrè lè l sèvi avèk TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Mezi RNA yo te fèt lè l sèvi avèk yon espektwofotomèt Epoch microplate (BioTek, Winooski, VT, USA). cDNA te sentèz lè l sèvi avèk yon am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Genomic DNA te ekstrè lè l sèvi avèk AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER, Daejeon, Kore di). Konvèsyon Bisulfite te fèt lè l sèvi avèk twous EZ DNA methylation (Zymo Research, CA, USA). Pou fè qRT-PCR, yo te itilize yon Twous sentèz AMPIGENE® cDNA (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, USA) ak yon sistèm PCR an tan reyèl ABI7500 (Ambion Inc, Austin, TX, USA). Sekans Primer yo itilize nan etid sa a yo dekri nan Tablo 1.
4.6. Laktat Dehydrogenase Assay
Yo te itilize tès LDH pou detèmine sitotoksisite a lè yo mezire aktivite laktat dehydrogenase (LDH) ki soti nan selil ki domaje yo. Yo te fè tès la lè l sèvi avèk yon LDH Cytotoxicity WST Assay kit (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, USA) dapre enstriksyon manifakti a.
4.7. Transfèksyon ADN pou nc886 Overexpression ak transfèksyon siRNA pou nc886 Knockdown
Pou jwenn ADN pou ekspresyon nc886 nan selil yo, yo te anplifye ADN ak AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Kore di) lè l sèvi avèk ADN jenomik HDF yo kòm yon modèl ak primè sa yo ki dekri nan Tablo 2.
ADN anplifye te pirifye lè l sèvi avèk yon QIAquick PCR Pirifikasyon Twous (QIAGEN, Hilden, Almay). ADN pirifye a te transfekte ak yon reyaktif LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pou kraze nc886, selil yo te transfekte ak anti-oligos (si-ctrl ak si-nc886) nan yon konsantrasyon 250pM lè l sèvi avèk reyaktif Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
4.8. Western Blotting
Lysates selil yo te prepare ak PRO-PREP™ Pwoteyin Ekstraksyon Solisyon (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Kore di). Pwoteyin total yo te separe ak yon sistèm elektwoforèz NuPAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) epi yo transfere nan manbràn polyvinylidene difluoride (PVDF). Immunoblotting te fèt lè l sèvi avèk antikò prensipal kont p16INK4A, p21Waf1 / Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), MMP1, Col1A2, ak -actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA). Yo te analize valè densitometrik nan gwoup lè l sèvi avèk ImageJ, vèsyon lojisyèl 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
4.9. Anzim-Linked Immunosorbent Assay
Apre enkubasyon ki endike yo, yo te mezire kolagen an (Procollagen Tip I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japon) ak MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) nan sipènatant kilti lè l sèvi avèk tès iminosorban ki lye ak anzim la. (ELISA) kit swiv enstriksyon manifakti a.
4.10. Analiz estatistik
Tout rezilta yo prezante kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD). Diferans ant de gwoup yo te evalye pa t-tès la oswa analiz de divèjans (ANOVA) lè l sèvi avèk GraphPad Prism. Yo te endike siyifikasyon estatistik kòm swa p < 0.0 5 oswa p < 0.01.
5. Konklizyon
An konklizyon, reglemante ekspresyon nc886 kapab yon sib potansyèl de senesans selilè nan fibroblasts, ak ATC kapab yon pisan epigenetic engredyan anti-aje.
Kontribisyon otè:
Konsepyalizasyon, YK, KH, ak EJ; metodoloji YK, HJ, N.-HP, ak K.-SL; gerizon done, YK, HJ ak EC; ankèt, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP, ak EJ; administrasyon pwojè, WP, DP, ak EJ; resous, WP ak DP; sipèvizyon, DP, ak EJ; ekri— bouyon orijinal, YK; ekri—revizyon ak koreksyon, N.-HP, KH, WP, DP, ak EJ Tout otè yo te li epi dakò ak vèsyon maniskri a pibliye.
Finansman:
Rechèch sa a pa te resevwa okenn finansman ekstèn.
Deklarasyon Komisyon Konsèy Revizyon Enstitisyonèl:
Pa aplikab.
Deklarasyon Konsantman Enfòme:
Pa aplikab.
Deklarasyon Disponibilite Done:
Done yo pral disponib sou demann.
Konfli enterè:
Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.
Referans
1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Senesans selilè: Lè move bagay rive nan bon selil yo. Nat. Rev Mol. Selil Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]
2. Kapoor, VK; Dureja, J. Aging: Apwòch nan direksyon pou kontwòl li yo. Dwòg Discov. Jodi a Ther. Estrateji. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]
3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Mekanis fotoaging ak kwonolojik aje po. Arch. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]
4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Karakteristik yo nan aje fibroblast. Mech. Aje Dev. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]
5. Brunet, A.; Berger, SL Epigenetics nan aje ak maladi ki gen rapò ak aje. J. Gerontol. Yon Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]
6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Jenetik ak epigenetik nan aje ak lonjevite. Cell Cycle 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]
7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, mwen; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Precursor miR-886, yon roman RNA ki pa kodaj ki reprime nan kansè, asosye ak PKR ak modil aktivite li. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]
8. Park, JL; Lee, YS; Chante, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; et al. Regilasyon epigenetik nan transcription RNA polymerase III nan tumigenesis tete bonè. Onkogene 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]
9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Mwen, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886, yon RNA ki pa kode, anpeche UVB-induit MMP-9 ak ekspresyon COX{-2 atravè chemen PKR nan keratinosit imen. Byochim. Biophys. Res. Komin. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]
10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. Anpèchman nan enflamasyon UVB-pwovoke pa ekstrè Laminaria japonica atravè Règleman nan nc 886- PKR Pathway. Nutrients 2020, 12, 1958. [CrossRef]
11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Idantifikasyon epigallocatechin-3-O-(3-Omethyl)-gallate (EGCG300Me) ak pwofil asid amine nan divès kalite te (Camellia sinensis L.). Done Brèf. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]
12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY Antioksidan ak Efè Sitopwotektif nan (-)-Epigallocatechin-3-({300-O-methyl) Gallate. Ent. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]
13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Efè ekstrè te vèt sou fanm ki twò gwo ak obèz ak nivo segondè nan dansite-lipoprotein-kolestewòl ki ba (LDL-C): Yon esè klinik owaza, doub-avèg, ak kwa-sou plasebo-kontwole. BMC Konpleman. altènatif. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]
14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Entèraksyon oral ant yon ekstrè flavanol te vèt ak ekstrè anthocyanin diven wouj lè l sèvi avèk yon nouvo modèl selil ki baze sou: Insights sou efè diferan epiteli oral. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]
15. Levi, N.; Papismadov, N.; Salomon, I.; Sagi, mwen .; Krizhanovsky, V. ECM chemen an nan senesans nan aje: Konpozan ak modifye. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]
16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Tretman Resveratrol kwonik Amelyore Adhesion selil ak bese fenotip enflamatwa a nan Fibroblast Imèn Senesan. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]
17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Solèy, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Senesans-asosye fenotip sekretè revele fonksyon selil-non otonòm nan RAS onkojenik ak suppressor timè p53 la. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]
18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Senesans selilè ak fenotip sekretè senesan: opòtinite terapetik. J. Clin. Investig. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]
19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Senesans selilè: Soti nan fizyoloji nan patoloji. Nat. Rev Mol. Selil Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]
20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. Yon fonksyon esansyèl nan histon deacetylase 1 nan kontwòl pwopagasyon ak represyon inibitè CDK. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]
21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Wòl nan metaloproteinas matris nan aje: tisi renovasyon ak pi lwen. Biochim. Biophys. Acta Mol. Selil Res. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]
22. Victorelli, S.; Passos, JF Deteksyon espès oksijèn reyaktif nan selil senesan. Metòd Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]
23. Puvvula, PK LncRNAs Rezo regilasyon nan senesans selilè. Ent. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]
24. Chen, YN; Kayi, MWEN; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Idantifikasyon lncRNA a, AK156230, kòm yon regilatè roman nan senesans selilè nan fibroblast anbriyon sourit. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]
25. Abdelmohsen, K.; panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimyan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Wood, WH, 3yèm; Becker, KG; et al. Senesans-asosye lncRNAs: Senesans-asosye RNAs long noncoding. Aging Cell 2013, 12, 890–900. [CrossRef]
26. Montes, M.; Lund, AH Wòl émergentes lncRNAs nan senesans. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]
27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. Long ki pa kodaj RNA antisans kontwole tradiksyon Uchl1 atravè yon repete SINEB2 entegre. Nature 2012, 491, 454–457. [CrossRef]
28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. Kontwòl diferansyasyon tisi somatik pa long RNA TINCR ki pa kode. Nature 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]
29. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Lalin, AM Kowòdone kontwòl senesans pa lncRNA ak yon nouvo konplèks T-box3 ko-represè. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]
30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Campisi, J. Lamin B1 pèt se yon biomarker senescence ki asosye. Mol. Biol. Cell 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]
31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Yon kinaz pou sonje. Devan. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]
32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Ou, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, aktivasyon KL PKR lakòz enflamasyon ak sekresyon MMP-13 nan chondrocytes artikulèr moun dejenere. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]
33. Wang, Y.; Gason, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. Anpèchman PKR pwoteje kont blesi H2O2 -pwovoke sou myosit kadyak neonatal lè yo diminye apoptoz ak enflamasyon. Sci. Rep 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]
Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Nok-Hyun Park 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Wonseok Park 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 ak Eunsun Jung 1,*.
1 Biospectrum Life Science Institute, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Kore; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EC); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)
2 Divizyon rechèch ak inovasyon debaz, Amorepacific Corporation R&D Center, Youngin-si 17074, Kore di; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)
* Correspondence: bioso@biospectrum.com
For more information:1950477648@nn.com
