Potansyèl neropwoteksyon nan isothiocyanates nan yon modèl in vitro nan neuroinfammation

Kontakte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Resevwa: 10 Jiyè 2020 / Aksepte: 25 Oktòb 2020 / Pibliye sou Entènèt: 16 Novanm 2020

© Otè a (yo) 2020

Cistanche èrbal poud fonksyon: gen yon trè bonefè neuroprotective

Résumé

Isothiocyanates (ITCs), prezan kòm précurseurs glikozinolat nan legim krusifè, yo te montreanti-enflamatwa, antioksidan, ak aktivite antikanserojèn. Isit la, nou konpare efè twa diferan ITC yo sou pwodiksyon ROS ak sou ekspresyon matris metaloproteinase (MMP) -2 ak -9, ki reprezante faktè patojèn enpòtan nan divès maladi newolojik. Kilti prensipal astrosit rat yo te aktive pa LPS epi yo te trete ansanm ak diferan dòz Allyl isothiocyanate (AITC), 2- Phenethyl isothiocyanate (PEITC), ak 2- Sulforaphane (SFN). Rezilta yo te montre ke SFN ak PEITC te kapab kontrekare pwodiksyon ROS pwovoke pa H2O2. Analiz zimografik nan supernatant kilti selil yo te pwouve ke PEITC ak SFN te inhibiteur ki pi efikas nan MMP-9, tandiske, sèlman SFN siyifikativman anpeche aktivite MMP-2. Analiz PCR te montre ke tout ITC yo te itilize yo te anpeche siyifikativman ekspresyon MMP-2 ak MMP-9. Ankèt la sou wout siyal mitogen-aktive protein kinase (MAPK) demontre ke ITC yo modile transkripsyon MMP lè yo anpeche aktivite ekstraselilè-reglemante pwoteyin kinaz (ERK). Rezilta etid sa a sijere ke ITC yo ta ka pwomèt ajan nutraceutical pou prevansyon ak tretman konplemantè nan maladi newolojik ki asosye ak patisipasyon MMP.

Mo kleAntioksidan · Anti-enflamatwa · Isothiocyanate · Metaloproteinas matris · Maladi newodejeneratif

Entwodiksyon

Neuroinflammation se yon repons konplèks nan blesi nan sèvo ki enplike yon kaskad nan evènman byochimik ki mennen nan aktivasyon an nan sistèm nève santral (CNS) selil rezidan yo. Aktivasyon aberan nan astwosit konpwomèt wòl neropwotektif yo ki mennen nan lage medyatè enflamatwa, tankou espès oksijèn reyaktif (ROS), oksid nitrique (NO), sitokin, chemokin, ak metaloproteinas matris.

(MMPs).

MMP yo se yon gwo fanmi endopeptidaz net, Zn2 plis-depandan ki gen kòm objektif prensipal eleman nan matris ekstraselilè (ECM) tankou fibronectin, kolagen, elastin, ak laminin (Latronico and Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Depatman Biosyans, Biotechnologies, ak Biopharmaceutique, University of Bari "Aldo Moro",

Bari, Itali

Depatman Syans, University of Basilicata, Potenza,

Itali

Nan CNS a, MMP yo patisipe nan divès repons fizyolojik, tankou mòfogenesis, woulman, ak renovasyon nan ECM, anbrijenez, ak reparasyon blesi; sepandan, lè MMP yo chape anba mekanis regilasyon yo vin danjere (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

Nan respè sa a, li konnen ke chanjman nan ekspresyon MMP ak aktivite yo se evènman kle patojèn nan plizyè maladi newolojik (Latronico and Liuzzi 2017; Mastroianni and Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Prèv eksperimantal yo sijere ke pami MMP yo, jelatinaz A (MMP-2) ak B (MMP{-9) yo patikilyèman patisipe nan neroenflamasyon paske regilasyon yo ka konpwomèt entegrite nan baryè san-sèvo (BBB). Sa a mennen nan ogmante rekritman ak enfiltrasyon nan selil iminitè periferik nan parenchyma nan sèvo perpétuer pwosesis la enflamatwa ki se kòz pèt newòn pwogresif ak fonksyon newòn ki gen pwoblèm (Rivest 2009). Plizyè etid in vitro ak in vivo te montre pwodiksyon ROS se youn nan faktè ki enplike nan regilasyon ekspresyon MMP-9 nan selil sèvo yo atravè mekanis siyal ki depandan sou wout pou siyal mitogen-aktive protein kinase (MAPK) (Hsieh ak Yang 2013).

Dapre prèv sa a, li klè ke downregulation nan faktè nerotoksik, sa ki lakòz repons neroenflamatwa redwi, ka reprezante yon estrateji efikas terapetik pou anpeche aparisyon oswa soulaje pwogresyon nan maladi nan sèvo.

Nan dènye ane yo, enterè byomedikal nan domèn newolojik la konsantre de pli zan pli sou rechèch nan konpoze natirèl ki kapab modile pwosesis ki asosye ak repons nero-enflamatwa. Nan respè sa a, plizyè etid yo montre ke konpoze fitochimik, tankou polifenol, isothiocyanates (ITCs), ak lòt moun, gen potansyèl neuroprotective ki tou sòti nan kapasite yo nan anpeche ekspresyon MMP yo ak debat pwodiksyon ROS (Dinkova-Kostova ak Kostov). 2012; Liuzzi et al 2007, 2011).

Isothiocyanates yo se metabolit ki pwodui pa plizyè plant ki fè pati fanmi Brassicaceae kòm yon sistèm defans kont atak patojèn (Bones and Rossiter 2006). Yo soti nan degradasyon anzimatik nan glikozinolat (GSL) pa myrosinase anzim la. ITC yo prezan nan legim krisifè yo souvan konsome tankou bwokoli, jèrm Brussels, chou, navèt, refor, kohlrabi, moutad, radi, kreson, ak chou frize. Kantite yo nan manje yo trè varyab ak depann sou pwosesis manje ak preparasyon.

Dènyèman li te montre ke ITC yo posede yon varyete de efè terapetik, ki gen ladan antioksidan, anti-bakteri, anti-enflamatwa, ak chemopreventive aksyon (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

Aktivite pwoteksyon ITC yo fèt atravè modulasyon diferan chemen siyal ki enplike nan dezentoksikasyon, enflamasyon, apoptoz, ak règleman sik selilè. Plizyè prèv endike ke pwopriyete anti-kanserojèn ak anti-enflamatwa ITC yo ta ka sitou akòz kapasite yo pou aktive chemen erythroid 2-faktè nikleyè ki gen rapò ak faktè 2 (Nrf2). Nrf2 se yon faktè transkripsyon redox-sansib ki nan prezans ajan elektwofil ak kondisyon estrès oksidatif transloke nan nwayo a kote li mare eleman repons antioksidan yo (ARE), pwovoke ekspresyon jèn cytoprotective ki enplike nan dezentoksikasyon ak nan modulasyon kondisyon oksidatif ak. pwosesis enflamatwa (Heiss et al 2001). Nan respè sa a, yo te rapòte ke ITC yo kapab ogmante kapasite antioksidan nan selil imen pa pwovoke ekspresyon faz II dezentoksikasyon anzim yo ak pa règleman an moute nan pwodiksyon GSH (Wagner et al 2010). Anplis de sa, li te rapòte egzistans la nan yon kwa-pale ant Nrf2 ak faktè nikleyè (NF)-κB chemen an ki rezilta nan modulation nan enflamasyon (Sturm and Wagner 2017; Lee and Johnson 2004). Nan respè sa a, divès kalite eksperimantal in vitro ak in vivo nan neroenflamasyon te demontre ke ITC yo kapab siyifikativman diminye NF-κB translokasyon ak anpèchman an konsekan nan sitokin proinflammatory ak MMPs (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

Nan papye sa a, nou te envestige efè twa ITC sa vle di Allyl isothiocyanate (AITC), 2-Phenethyl isothiocyanate (PEITC), ak 2-Sulforaphane (SFN) sou liberasyon MMP-2 ak -9 osi byen ke sou pwodiksyon ROS pa astwosit LPS aktive. Rezilta nou yo te pwouve ke PEITC, SFN, ak AITC yo kapab anpeche ekspresyon MMP-9 ak MMP-2 an vitro nan astwosit aktive LPS ak debat pwodiksyon ROS pwovoke pa H2O2. Anplis de sa, nou te demontre ke ITC yo modile twòp ekspresyon MMP yo ak mekanis ki gen rapò ak anpèchman aktivite kinaz pwoteyin ekstraselilè-reglemante (ERK). Rezilta sa yo sijere ke yon rejim ki rich nan legim Cruciferous ka gen benefis potansyèl pou prevansyon ak tretman konplemantè nan maladi newolojik.

Materyèl ak metòd

Pwodwi chimik ak reyaktif

GIBCO (Paisley, Scotland) te bay Dulbecco a modifye Eagle's medium (DMEM), serom fetal bovine (FBS), penisilin, ak streptomycin. Jelatin, DNase 1, poly-L-lysine

(PLL), tripsin, lipopolisakarid (LPS), Trypan Blue ak 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){-2.5-diphenyltetrazolium bromur (MTT) ), Allyl isothiocyanate (AITC) [kod. 377,430, pite 95 pousan (HPLC)], 2- Phenethyl isothiocyanate (PEITC) [kod. 253,731, pite 99 pousan )], 2-Sulforaphane (SFN) [kod. S6317, pite Pi gran pase oswa egal a 95 pousan (HPLC)] yo te bay nan Sigma (St. Louis, MO, USA). 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) te achte nan men Calbiochem. Pwoteyin estanda ak R-250 Coomassie Brilliant Blue te soti nan Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Antikò Anti-glial fibrillary asid pwoteyin (GFAP) (RRID: AB_2294571) yo te achte nan men Serotec (Oxford, UK). Antikò kont kinaz pwoteyin ekstraselilè-reglemante (ERK) 1/2, ak fosforilasyon ERK 1/2 (p-ERK 1/2) te soti nan Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hybond-P PVDF manbràn, amelyore chemiluminescence (ECL) Western Blotting Analiz System, ak anti-sourit-HRP segondè antikò te soti nan GE.

Syans Lavi Swen Sante (Little Chalfont, Buckinghamshire,

UK a). Primer pè espesifik pou MMP-2, MMP-9, ak 18S rRNA te soti nan Sigma Genosys (Cambs, UK). RNeasy mini kit ak QuantiTect Reverse Transcription kit te achte nan men Qiagen (Valencia, CA, USA). Yo te achte reyaktif Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix pou PCR nan men Lucigen Corporation (Middleton, WI, USA).

Deklarasyon etik

Eksperyans ki enplike bèt yo te fèt dapre rekòmandasyon yo nan Gid NIH pou Swen ak Itilizasyon Bèt Laboratwa yo ak apwobasyon Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan University of Bari, Itali (Nimewo Pèmi: 23-98- A).

Preparasyon nan kilti astrosit

Astrosit yo te prepare nan tisi neocortical rat Wistar ki gen yon jou (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Itali). Pou preparasyon an nan astwosit 6 fatra nan 12 pups, chak nan tou de sèks yo te itilize. Yo te elimine bèt yo lè yo te ekspoze a gaz kabonik (CO2) epi yo te touye pa rapid dekapitasyon. Tisi yo neocortical yo te diseke epi yo te itilize pou pirifye nan kilti selil glial prensipal yo swiv metòd la rapòte pa Latronico et al. (2018). Yon ti tan, apre diseksyon an, sèvo rat yo te fin vide meninges ak veso sangen yo, menen mekanik ak dijere ak 0.25 pousan tripsin nan prezans 0.01 pousan DNase. Apre santrifijasyon ak evalyasyon viabilite selil yo, selil yo te plake nan flakon PLL-kouvwi (75 cm2) nan yon dansite 1.5 × 107 selil / flakon nan DMEM, 10 pousan FBS, 100 IU mL -1 penisilin, 100 µg mL -1 streptomycin. , epi kenbe nan 37 degre nan yon 5 pousan CO2. Apre 7 jou, flakon yo te souke pou retire oligodendrocytes ak microglia. Pite astrosit yo, ki te jwenn pa trypsinization (0.25 pousan trypsin/0.02 pousan EDTA), te evalye pa imunostaining pou GFAP.

Tretman astrosit LPS aktive ak Allyl isothiocyanate, Phenethyl isothiocyanate oswa 2-Sulforaphane

Astwosit konfluyan, simen nan 96 plak byen, yo te ankouraje ak 10 µg mL -1 nan LPS ak ansanm trete ak konsantrasyon diferan nan Allyl isothiocyanate (AITC), 2- Phenethyl isothiocyanate (PEITC) oswa 2- Sulforaphane (SFN) nan DMEM san serom. Astrocytes nan serom-gratis DMEM ak LPS-aktive astrocytes reprezante kontwòl negatif ak pozitif, respektivman. Anplis de sa, depi solisyon stock AITC (100 µM), PEITC (67 µM), ak SFN (56.4 µM) te fè nan DMSO, yon koub dòz-repons nan DMSO, dilye nan mwayen kilti nan menm konsantrasyon sòlvan ki prezan nan echantiyon yo analize, te kouri pou estime toksisite konpoze. Apre 20 èdtan nan enkubasyon nan 37 degre, 5 pousan CO2 supernatant yo te kolekte epi estoke nan -20 degre jiskaske yo itilize tandiske selil yo te sibi tès MTT pou evalye viabilite selil yo.

MTT tès viabilite selil

Sitotoksisite AITC, PEITC, ak SFN sou astwosit yo te detekte lè l sèvi avèk MTT [{{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,{{5 }}diphenyl tetrazolyum bromide] tès. Egzamen sa a baze sou rediksyon MTT pa mitokondrial succinate dehydrogenase nan selil solid, nan yon pwodwi formazan ble ensolubl ki ka mezire espektrofotometrik. Yon ti tan, apre tretman pou 20 èdtan ak AITC, PEITC oswa SFN, yo te retire mwayen kilti a epi selil yo te chaje ak 0.5 mg mL-1 nan MTT. Apre enkubasyon pou 2 èdtan nan 37 degre, yo te retire 5 pousan CO2 mwayen ak kristal formazan yo nan selil yo te solubilize ak 90 pousan etanòl. Apre souke plak yo pou 15 minit pou jwenn solubilizasyon konplè kristal, yo te detèmine kantite pwodwi formazan pa absòbe optik nan 560 nm ak yon longèdonn referans 690 nm. Viabilite selil yo te eksprime kòm yon pousantaj nan kontwòl (CTRL), reprezante pa selil ki pa trete, ki te fikse nan 100 pousan. Pou chak konpoze, yo te jwenn yon koub dòz-repons nan viabilite selil.

Deteksyon espès oksijèn reyaktif

Deteksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) te fèt pa chaje astrosit ak 10 μM nan 2′,7′-dichlorofluorescein dyacetate (DCFH-DA) nan fenol wouj-gratis DMEM nan 37 degre pou 30 min. Lè sa a, DCFH-DA te retire nan pwi ak selil yo te trete pou 1 èdtan ak AITC (400 μM), PEITC (10 μM) oswa SFN (25 μM) nan fenol wouj-gratis DMEM nan prezans H2O2 nan konsantrasyon final la nan 100 μM. . Selil trete sèlman ak DCFH-DA oswa ak H2O2 reprezante negatif (CTRL) ak kontwòl pozitif (H2O2), respektivman. Apre enkubasyon selil yo te rense ak PBS ak lysed ak

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0.5 pousan, pH 7.5,

answit santrifuje nan 10,000×g, 4 degre pou 10 min. Supernatant yo te kolekte epi analiz espektrofluorimetri yo te fèt nan 525 nm anba eksitasyon nan 485 nm. Rezilta yo te nòmalize nan kontni total pwoteyin ak pwodiksyon ROS te eksprime kòm yon pousantaj relatif nan entansite fotoluminesans (PL) kont kontwòl pozitif.

Deteksyon jelatinaz

Aktivite jelatinaz nan supernatant selil yo (SNs) te detekte pa analiz zimografik jan yo rapòte pa Latronico et al. (2013). Yon ti tan, yon kantite SN, ki koresponn ak apeprè 10 µg nan pwoteyin total, te solubilize ak 30 µl nan tanpon echantiyon Laemmli san -mercaptoethanol. Echantiyon yo te kouri nan yon 7.5 pousan jèl polyacrylamid copolymerized ak 0.1 pousan (wt / v) jelatin. Apre kous elektwoforetik la, jèl yo te rense de fwa ak 2.5 pousan Triton X-100/10 mM CaCl2 nan 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 epi yo te enkube pou 24 èdtan nan 37 degre nan 1 pousan Triton X-100 /50 mM Tris–HCl/10 mM CaCl2, pH 7.4. Jèl yo te tache ak Coomassie briyan ble R-250 epi yo te depoze nan metanol / asid acetic / H2O (4:1:5 v / v). Aktivite jelatinaz te vizyalize kòm yon bann klè nan dijesyon sou yon background ble nan jèl la epi yo te quantifye pa analiz imaj densitometrik enfòmatik lè l sèvi avèk Image LabTM Software (Bio-Rad Laboratories). Jelatinaz

aktivite te eksprime kòm dansite optik (OD) × mm2, ki reprezante zòn nan optik anba koub yo ki pran an kont tou de klète ak lajè nan zòn nan liz substra. Done yo te eksprime lè l sèvi avèk ekwasyon sa a: pousan anpèchman=[100 - (OD echantiyon/OD kontwòl pozitif) × 100].

Ranvèse transkripsyon-polymerase chèn reyaksyon (RT-PCR)

Astwosit, simen nan 6 plak byen, yo te aktive ak LPS (10 µg mL-1) ak ansanm trete ak ITCs nan maksimòm konsantrasyon ki pa toksik. Apre 20 èdtan nan enkubasyon RNA total yo te ekstrè soti nan astwosit lè l sèvi avèk Qiagen RNeasy mini twous la dapre enstriksyon manifakti a. ADN konplemantè (cDNA) te sentèz soti nan 500 ng nan RNA lè l sèvi avèk QuantiTect Reverse Transcription kit la dapre enstriksyon manifakti a. Yo te itilize yon total de 25 ng nan pwodwi transkripsyon ranvèse pou anplifye yon fragman 591 bp lè l sèvi avèk primè espesifik (sans 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisans 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) pou sekans MMP-2 rat la ak yon fragman 541 bp lè l sèvi avèk primè espesifik (sans 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; anti-sans 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) pou rat MMP -9 sekans. An paralèl, anplifikasyon yon fragman 308 bp nan rat 18S rRNA (sans 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisense 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), yon jèn referans entèn relativman invariant, te fèt. . Ansanm Jadendanfan yo, ki deja valide nan lòt etid (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) espesyalman rekonèt sèlman jèn yo nan enterè jan sa endike nan anplifikasyon nan yon gwoup sèl nan gwosè a espere nan PCR la. pwodwi yo. Anplifikasyon PCR la te fèt pou 25 sik chak ki gen ladann denaturasyon nan 94 degre, rkwir nan 59 degre, ak ekstansyon nan 72 degre. Apre anplifikasyon, pwodwi yo te analize nan 1.5 pousan jèl agaroz. Apre analiz densitometrik jèl yo, anplifikasyon jèn sib yo te nòmalize nan ekspresyon 18S rRNA, ak rezilta yo te eksprime kòm yon pousantaj anpèchman an konparezon ak kontwòl pozitif jan yo rapòte pou quantifikasyon jelatinaz.

Deteksyon fosforilasyon ERK 1/2 pa analiz Western blot

ERK 1/2 te detekte pa analiz immunoblot jan yo rapòte nan Latronico et al. (2018). Yon ti tan, konfluan prensipal

astwosit plake nan {{0}}plak byen, yo te fè kiesan nan mwayen san serom pou 24 èdtan, yo te pretrete pou 1 èdtan ak AITC (4{00 μM), PEITC (10 μM), oswa SFN (25 μM) nan fenol wouj-gratis DMEM. Apre eksitasyon pou 2 èdtan ak 10 ug mL-1 LPS, selil yo te lysed ak 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2.5 mM Na-pyrophosphate, 1 mM -glycerophosphate 1 pousan Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fuoride, 20 ug/mL aprotinin, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuoride, 1 mM Na3VO4, pH 7.5. Swasant ug nan pwoteyin total nan chak echantiyon yo te rezoud pa 10 pousan SDS-polyacrylamide jèl elektwoforèz ak pwoteyin yo te Lè sa a, immunoblotted sou manbràn polyvinylidene difluoride. Apre bloke lannwit lan nan 4 degre ak 0.05 pousan Tween 20, 1 pousan lèt, 1 pousan albumin serom bovin nan 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), manbràn yo te sonde lannwit lan nan 4 degre ak yon monoklonal anti-p- ERK 1/2 antikò (1:500). Lè sa a, manbràn yo te lave twa fwa ak 0.05 pousan Tween 20 nan Tris-tampon saline, sonde ak anti-sourit-refor peroksidaz segondè antikò (1:20,000) pou 2-h nan 24 degre ak detekte. ak chemiluminescence amelyore. Pou evalye kantite total ERK, yo te retire manbràn yo epi yo te enkube ak yon antikò espesifik pou ERK 1/2 ki pa fosforil (1:500). Entansite gwoup yo te quantifye pa eskanè densitometrik nan tach ak nivo fosforilasyon nan ERK 1/2 yo te nòmalize nan ERK ki pa fosforil 1/2 epi yo te eksprime kòm yon pousantaj an konparezon ak kontwòl la pozitif (astwosit trete ak LPS), dapre la. ekwasyon sa a:

pousan pERK 1/2=(ODsample/ODpozitif kontwòl) × 100.

Analiz estatistik

Analiz done yo te fè lè l sèvi avèk GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Done yo te eksprime kòm valè mwayèn ± SD. Analiz estatistik te fèt lè l sèvi avèk yon sèl-fason analiz de divèjans (ANOVA) ki te swiv pa Dunnett's Multiple Comparaison post hoc tès.

Rezilta yo

Efè konpoze isothiocyanate sou viabilite astrosit

Eksperyans preliminè yo te fèt pou evalye sitotoksisite AITC, PEITC, oswa SFN. Pou rezon sa a, yo te trete astwosit pirifye pou 20 èdtan ak konpoze ITC yo nan konsantrasyon ant 5 ak 400 µM oswa ak DMSO dilye nan mwayen kilti jan sa dekri nan Seksyon Metòd la. Jan yo montre nan Fig. 1, DMSO a pa t 'toksik nan tout konsantrasyon itilize ki matche ak sa yo nan solisyon ITC yo teste yo. Pami ITC yo envestige, AITC

Fig. 1 Viabilite selil astwosit yo trete ak konpoze isothiocyanate. Astrocytes prensipal konfluyan yo te trete pou 20 èdtan ak Allyl isothiocyanate (AITC), 2- Phenethyl isothiocyanate (PEITC), oswa 2- Sulforaphane (SFN) nan konsantrasyon ki endike yo Lè sa a, sibi tès la MTT. Anplis de sa, depi li nan solisyon yo stock yo te fonn nan dimethyl sulfoxide (DMSO), yon koub dòz-repons nan DMSO, dilye nan mwayen kilti nan menm konsantrasyon nan sòlvan (pousan) prezan nan echantiyon yo ITC te kouri nan chak eksperyans jwenn yon estimasyon serye toksisite ITC. Kontwòl la (CTRL) te reprezante

odè soti nan astrosit ki pa trete nan DMEM san serom. Grafik yo reprezante koub dòz-repons viabilite selil yo, ki eksprime kòm yon pousantaj siviv selil yo an konparezon ak kontwòl. Dòz konpoze ki detèmine viabilite selil ki pi wo a 60 pousan yo te chwazi kòm konsantrasyon maksimòm ki pa toksik. Valè yo vle di ± SD nan n=3 eksperyans ki fèt sou diferan popilasyon selil yo. Mikwograf yo montre rezilta reprezantatif mòfoloji selil yo obsève anba yon mikwoskòp kontras faz (agrandisman 50X) apre tretman ak diferan konpoze yo.

te mwens toksik pou astwosit. An patikilye, AITC pa t toksik pou selil jiska 400 µM pandan ke PEITC ak SFN te toksik nan konsantrasyon ki pi wo a 10 ak 25 µM, respektivman. Obsèvasyon mikwoskopik la konfime rezilta tès MTT la ki montre ke nan konsantrasyon toksik PEITC ak SFN, astwosit yo te redwi nan kantite ak moun ki te rete yo te montre chanjman sitotoksik nan sitoplasm yo.

Efè pwoteksyon nan konpoze ITC sou pwodiksyon ROS nan astrosit ki trete oksijene idwojèn

Pou evalye efè pwoteksyon ITC yo nan direksyon estrès oksidatif, astwosit yo te pre-trete ak PEITC, AITC, ak SFN nan maksimòm konsantrasyon ki pa toksik Lè sa a, ankouraje ak H2O2. Pwodiksyon entraselilè ROS, pwovoke pa H2O2, te teste pa DCFH-DA. Jan yo montre nan Fig. 2, ekspoze a H2O2 amelyore siyal fliyoresan nan

Fig. 2 Pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) nan astwosit ki trete ak ITC. Prezans ROS te teste lè w mezire chanjman siyal fliyoresan 2′,7′-dichlorofluorescein (DCFA) jan yo te rapòte nan seksyon Materyèl ak Metòd yo. Astwosit, simen nan 6 plak byen, yo te pre-trete pou 30 min ak DCFA Lè sa a, trete pou 1 èdtan ak 10 μM PEITC, 400 μM AITC, oswa 25 μM SFN nan prezans H2O2 nan konsantrasyon final nan 100 μM. . Astwosit trete ak DCFA pou kont li (CTRL) oswa ak 100 μM H2O2 reprezante kontwòl negatif ak pozitif, respektivman. Siyal fliyoresan detekte nan lisat selil yo te mezire pa yon fliyomèt nan 525 nm anba eksitasyon nan 485 nm. Pwodiksyon ROS la te eksprime kòm yon pousantaj (pousan) entansite fotoluminesans (PL) an konparezon ak kontwòl pozitif. Valè yo vle di ± SD nan n=3 eksperyans ki fèt sou diferan popilasyon selil yo. Diminisyon estatistik enpòtan an konparezon ak H2O2 endike ak asterisk (ANOVA yon sèl-fason ki te swiv pa tès post hoc Dunnet a; *p <>

astwosit an konparezon ak kontwòl (CTRL). Kòm evidans diminisyon entansite fliyoresan DCF, pre-tretman astrosit ak konpoze ITC te kontrekare jenerasyon ROS pwovoke pa H2O2. Pami ITC yo teste, sèlman PEITC ak SFN te kapab siyifikativman redwi pwodiksyon ROS pa apeprè 20 ak 24 pousan, respektivman, an konparezon ak yon kontwòl pozitif (H2O2).

Konpoze isothiocyanate yo anpeche nivo MMP-2 ak MMP-9 nan astwosit ki aktive LPS.

Efè konpoze ITC yo sou nivo MMP-2 ak MMP{-9 yo te evalye sou astwosit aktive ak LPS, ki se konnen yo pwovoke ekspresyon jelatinaz (Gottschall and Deb 1996), epi ansanm trete ak AITC, PEITC, oswa SFN nan seri konsantrasyon ki pa t toksik pou selil yo. Jan yo montre nan Fig. 3a, de gwoup klè nan dijesyon nan 72 ak 92 kDa te prezan sou jèl ki koresponn, respektivman, ak MMP-2 ak MMP-9. Aktivasyon astrosit ak LPS ogmante nivo MMP-2 epi li pwovoke sentèz MMP-9. Tretman ak AITC (Fig. 3b), PEITC (Fig. 3c), oswa SFN (Fig. 3d) detèmine yon dòz ki depann de

rediksyon nivo MMP-9, ki varye selon konpoze yo itilize a. An patikilye, pami ITC yo itilize a, SFN te pi efikas nan anpeche MMP-9 depi li te detèmine 70 pousan anpèchman nan dòz 10 μM ak 100 pousan anpèchman nan dòz 25 μM. Anplis de sa, sèlman SFN nan maksimòm konsantrasyon ki pa toksik te kapab siyifikativman anpeche MMP -2 (Fig. 2d).

Konpoze isothiocyanate yo anpeche ekspresyon jèn MMP-2 ak MMP-9 nan astwosit ki aktive LPS.

Pou detèmine si konpoze ITC yo te etidye yo te kapab anpeche ekspresyon MMP-2 ak MMP{-9, yo te fè RT-PCR sou astwosit aktive LPS ki te trete ak konsantrasyon maksimòm ki pa toksik ITC yo. Jan yo montre nan jèl reprezantan yo nan Fig. 4a tretman an nan astwosit LPS-aktive ak ITC endividyèl yo te kapab debat ekspresyon an ogmante nan MMP-2 ak MMP-9 mRNA. Jan yo montre nan Fig. 4b, analiz quantitative rezilta yo, te pwouve ke, nan maksimòm konsantrasyon ki pa toksik, konpoze ITC yo, detèmine yon anpèchman estatistik enpòtan nan MMP-2 ak MMP{-9 ekspresyon an konparezon. nan yon kontwòl pozitif (LPS). An patikilye, PEITC ak SFN fè egzèsis menm pousantaj anpèchman sou MMP-2 (85 pousan) ak MMP-9 (100 pousan) tandiske AITC te mwens efikas pase PEITC ak SFN nan anpeche MMP{{17} } (65 pousan ) ak MMP-9 (90 pousan ) ekspresyon.

ERK 1/2 patisipe nan anpèchman ekspresyon MMP pa ITC

Piske ERK 1/2 se chemen prensipal transdiksyon siyal ki enplike nan règleman ekspresyon MMP-2 ak MMP-9 nan astwosit ki aktive LPS (Lee et al. 2003), efè konpoze ITC sou yo. aktivasyon kinaz pwoteyin ekstraselilè-reglemante (ERK) 1/2 te teste.

Jan yo montre nan Fig. 5 LPS pwovoke yon ogmantasyon estatistik siyifikatif nan nivo fosforilasyon ERK 1/2 (p-ERK) ki te kontrekare pa pre-tretman ak konpoze ITC yo.

Diskisyon

Li se lajman kwè ke estrateji prensipal yo defans kont anpil maladi konpoze sitou nan evite faktè risk ak adopte yon vi ki kòrèk. Gen anpil prèv syantifik ki sipòte ipotèz ke kèk metabolit natirèl, tipikman ki pwodui pa divès kalite fwi ak legim, kapab modil fenomèn patolojik tankou kansè, maladi newolojik, ak lòt maladi miltifaktoryèl. Nan senaryo sa a, isothiocyanates yo (ITCs) te eksite gwo enterè akòz antifonjik, anti-bakteri,

Fig. 3 Efè konpoze isothiocyanate yo sou nivo MMP-2 ak MMP-9 nan astwosit ki aktive LPS yo. Nan yon se rapòte yon reprezantan jèl zimografik nan analiz la nan supernatant kilti soti nan astwosit aktive ak LPS (10 ug mL -1) ak ansanm trete pou 20 èdtan ak AITC, PEITC, oswa SFN nan konsantrasyon yo endike (μM). Kontwòl negatif ak pozitif yo te jwenn nan astwosit ki pa ankouraje ak trete nan mwayen san serom (CTRL) ak LPS-.

selil aktive (LPS), respektivman. Istogram b–d reprezante rezilta (mwayèn ± SD) n {{0}} eksperyans ki fèt sou diferan popilasyon selil yo, ki eksprime kòm yon pousantaj anpèchman MMP an konparezon ak LPS, kalkile apre eskanè densitometri ak analiz enfòmatik jèl. . Diminisyon estatistik enpòtan an konparezon ak LPS endike ak asterisk (ANOVA yon sèl-fason ki te swiv pa tès post hoc Dunnet a; *p <0.05, **p=""><>

antikanserojèn, antimutagenik, antioksidan, ak anti-enflamatwa pwopriyete byolojik (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay and Fahey 2001). Iso-thiocyanates soti nan degradasyon anzimatik nan glikozinolat (GSL) ki se metabolit segondè ki prezan nan 15 fanmi botanik nan lòd Capparales epi yo trè abondan nan fanmi an Brassicaceae (Fahey et al. 2001). GSL yo idrolize pa myrosinase (-thioglucoside glucohydrolase e; EC 3.2.3.147) nan yon varyete konpozan tankou ITCs, nitrite, thiocyanates, epithionitriles, SFGate, glikoz, ak oxazolidines (Li and Kushad 2005). Malgre ke ITC yo te etidye anpil nan jaden an chimyoterapi (Grundemann and Huber 2018), kèk envestigasyon yo te fè sou potansyèl terapetik yo nan maladi newolojik malgre li te demontre kapasite nan SFN ak AITC pou travèse BBB a ak akimile nan parenchyma nan sèvo. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). Nan papye sa a, nou konpare efè twa ITC yo,

prezan nan plizyè legim krisifè souvan konsome, sou pwodiksyon espès oksijèn reyaktif (ROS) ak ekspresyon matris metaloproteinase (MMP) nan yon modèl in vitro nan neroenflamasyon reprezante pa astwosit aktive ak lipopolisakarid (LPS) oswa trete ak H2O2. Astwosit, kalite selil glial ki pi abondan nan CNS la, jwe yon wòl enpòtan nan antretyen omeyostazi nan sèvo epi yo se karakteristik diferan maladi newolojik (Cekanaviciute and Buckwalter 2016; Colombo and Farina 2016). Yo konsidere yo kòm regilatè enpòtan nan repons iminitè natirèl la ak repons yo nan joure danjere, tankou estrès oksidatif, ka agrave reyaksyon enflamatwa ak domaj tisi oswa ankouraje reparasyon tisi. Li se byen li te ye ke astrosit aktive pwodui faktè nerotoksik tankou MMPs ki gen yon wòl kle nan pwomosyon neroenflamasyon ak pèt pwogresif newòn nan maladi newolojik (Hsieh and Yang 2013). Se poutèt sa, modulasyon an nan

Fig. 4 Efè konpoze ITC yo sou ekspresyon MMP-2 ak MMP-9 nan astwosit aktive LPS. Astwosit, simen nan 6 plak byen, yo te aktive ak LPS (10 µg mL-1) ak ansanm trete pou 20 èdtan ak AITC (400 μM), PEITC (10 μM) oswa SFN (25 μM), Lè sa a, sibi RT-PCR. Jèl agaroz reprezantan ekspresyon MMP-2 ak MMP{-9 yo rapòte nan (a). Istogram nan (b) reprezante rezilta (mwayèn ± SD) n=3 eksperyans ki fèt sou diferan selil

evènman ki rive apre deklanchman astwosit yo ka bese repons enflamatwa a ak domaj newòn.

Rezilta etid sa a te endike ke nan mitan ITC yo etidye, AITC te mwens toksik paske li pa t lakòz okenn rediksyon nan viabilite selil nan tout konsantrasyon yo itilize. Kontrèman, menm jan ak sa ki te obsève pa lòt otè sou plizyè liy selil glial, PEITC ak SFN te montre toksisite selilè nan konsantrasyon ki pi gran pase 10 ak 25 µM, respektivman (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. .2015).

Nan literati syantifik aktyèl la, gen anpil done kontwovèsyal sou mekanis molekilè ki kache efè ITC yo sou viabilite selil yo. Nan respè sa a, pi fò nan syans yo te sijere ke ITC yo anpeche apoptoz ki pwovoke kwasans selilè, arete sik selilè, jenerasyon ROS nan selil kansè yo men se pa nan selil nòmal yo (Fofaria et al. 2015; Qin et al. al. 2018; Sestili and Fimognari 2015). Nou te jwenn ke SFN ak PEITC, men pa AITC, gen yon wòl pwoteksyon kont estrès oksidatif nan astwosit, tout bon nan konsantrasyon maksimòm ki pa toksik yo te kapab debat pwodiksyon ROS pwovoke pa ekspoze a H2O2. CNS a se patikilyèman vilnerab a estrès oksidatif akòz gwo konsomasyon oksijèn li yo, sistèm antioksidan fèb, ak kontni segondè nan biomacromolecules sansib a oksidasyon. Yo kwè jenerasyon ROS ak domaj oksidatif yo patisipe nan patojèn maladi newolojik tankou maladi alzayme (AD), maladi Parkinson (PD), paralezi amyotwofik lateral (ALS), ak paralezit miltip (MS) (Lee et al. 2015). Se poutèt sa, byenke nan eksperyans in vitro nou yo SFN ak PEITC te kontrekare pwodiksyon ROS nan yon limit modere, nou ta ka sipoze ke nan vivo yon administrasyon pwolonje nan ITCs ka mennen nan yon rediksyon pi enpòtan nan ROS ki, sou tan, ka lakòz yon sans. pou popilasyon ki eksprime kòm yon pousantaj nan anpèchman MMP an konparezon ak kontwòl la pozitif (LPS), kalkile apre optik densitometri ak analiz enfòmatize nan jèl. Diminisyon estatistik siyifikatif nan ekspresyon MMP-2 ak MMP{-9 an konparezon ak LPS endike ak asterisk (ANOVA yon sèl-fason ki te swiv pa tès post hoc Dunnet a; *p <>

prevansyon ak modulasyon maladi nan sèvo. ROS aji kòm yon molekil siyal kritik pou deklanche kaskad repons enflamatwa nan CNS la. Nan respè sa a, li byen li te ye ke ROS kontwole ekspresyon anpil jèn ki enplike nan neroenflamasyon atravè aktivasyon faktè transkripsyon pro-enflamatwa tankou faktè nikleyè-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana et al. 2019). Nan senaryo sa a, MMP yo jwe yon wòl enpòtan ki gen ekspresyon ROS kontwole pa deklanchman NF-κB (Yan and Boyd 2007).

Depi dysregulation MMP kontribye nan patojèn nan anpil maladi neroenflamatwa ak neurodegenerative, anpèchman yo reprezante yon estrateji enpòtan terapetik. Pou rezon sa a, enterè k ap grandi yo te konsantre nan dènye dekad la sou potansyèl dwòg ak konpoze natirèl pou anpeche MMP yo. Anpil etid in vitro te pwouve ke aksyon an anti-enflamatwa ak antioksidan nan plizyè dwòg ak konpoze bioaktif ki prezan nan legim ak òganis maren yo asosye ak kapasite yo nan anpeche ekspresyon MMPs (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. .2015). Nan etid sa a, nou te demontre ke pami ITC yo teste yo, SFN ak PEITC yo te pi efikas nan anpeche MMP-2 ak MMP-9 nivo ak ekspresyon nan astwosit LPS aktive. Anpèchman MMP yo pa ITC yo te rapòte nan lòt etid in vivo ak vitro. An patikilye, Li et al. (2013) te demontre ke SFN kapab bese domaj BBB a lè li anpeche ekspresyon MMP-9 nan yon modèl ansèfalomyélit eksperimantal otoiminitè in vivo. Lòt otè rapòte ke SFN te kapab diminye ekspresyon MMP-9 apre blesi nan mwal epinyè nan sourit (Mao et al. 2010a). Anplis de sa, syans vitro te demontre ke repwesyon pa ITCs nan migrasyon selil ak

Fig. 5 Kinaz kinaz 1/2 (ERK 1/2) ki kontwole siyal ekstraselilè (ERK 1/2) patisipe nan anpèchman ekspresyon MMP pa konpoze ITC. Reprezantan fim otoradyografik nan analiz Western blotting nan lysates soti nan astrosit pre-trete pou 1 èdtan ak AITC (400 μM), PEITC (10 μM) oswa SFN (25 μM), ak Lè sa a, aktive pou 2 èdtan ak LPS (10 ug mL{{ 13}}). Selil ki pa trete ak ki pa ankouraje yo reprezante kontwòl negatif (CTRL). Istogram nan (b) reprezante nivo pERK1/2 envazyon nan selil gliom C6 ki asosye ak anpèchman ekspresyon MMP -9 medyatè pa NF-κB (Lee et al. 2015).

Mekanis molekilè ITC yo anpeche MMP yo pa klè, epi pa gen okenn etid ki mennen ankèt sou pwopriyete antioksidan ak anti-enflamatwa ITC yo sou kilti astrosit prensipal yo. Plizyè etid sipòte ipotèz ke efè inhibition ITC yo se yon konsekans kapasite yo pou bloke NF-κB pa chemen siyal Nrf2 la. Nan respè sa a, yon etid in vivo prèv ki montre sourit knockout Nrf2 yo te pi sansib a repons enflamatwa NF-κB-medyatè nan mwal epinyè a ak nan ekspresyon an ogmante nan jèn NFκB-depandan ki gen ladan MMP -9 (Mao et al. 2010b). ). Malgre ke chemen NF-κB ak Nrf2 ta ka jwe, nou te demontre ke règleman an nan NF-κB rive tou atravè modulation nan mekanis molekilè ki endepandan pa Nrf2. Vreman vre, nou te jwenn ke AITC, PEITC, ak SFN anpeche aktivasyon ERK1/2 ki jwe yon wòl esansyèl nan kaskad evènman transdiksyon siyal ki finalman kontwole transkripsyon jèn MMP.

Sepandan, prèv eksperimantal ki montre SFN nan maksimòm konsantrasyon ki pa toksik la konplètman inibit tou de ekspresyon MMP-9 ak nivo tandiske AITC ak PEITC inibe nan yon pwolonje maksimòm ekspresyon MMP-9 men sèlman tonbe MMP{{3} } nivo a anviwon 50 pousan , ta ka sijere ke konpoze sa yo modile MMP-9 transkripsyon ak diferan mekanis aksyon. Nan respè sa a, li te rapòte ke SFN, nan adisyon a anpèchman nan deklanchman LPS-induit nan NF-κB, entèfere ak obligatwa nan LPS nan reseptè TLR4 (Koo et al 2013). Efè inhibition SFN sou TLR4 te kapab anpeche deklanchman astwosit pa LPS e sa ka lakòz anpèchman an nan ekspresyon MMP-9 ak yon mank konsekan de pwodiksyon MMP-9.

jwenn apre optik densitometrik fim otoradyografik ak nòmalizasyon nan ERK 1/2 ki pa fosforil. Done reprezante vle di ± SD nan n=3 eksperyans ki fèt sou diferan popilasyon selil yo. Asterisk reprezante valè estatistikman diferan de kontwòl pozitif (Astrocytes aktive LPS), ki te fikse nan 100 pousan (ANOVA yon sèl-fason ki te swiv pa tès Dunnett's Multiple Comparaison post hoc; *p <>

Konklizyon

An rezime, done nou yo endike ke tretman astrosit ak ITC diminye fòmasyon ROS epi anpeche liberasyon MMP-2 ak MMP-9 bay nouvo apèsi sou pwopriyete antioksidan ak anti-enflamatwa ITC yo sou glial. selil yo. Rezilta sa yo sijere ke ITC yo ta ka pwomèt ajan nutraceutical pou devlopman entèvansyon newo-nitrisyon, ki baze sou itilizasyon manje ki an sante, pou prevansyon ak tretman konplemantè maladi newolojik.

Finansman Finansman aksè ouvri pa Università Degli Studi di Bari Aldo Moro ki ofri nan Akò CRUI-CARE.

Konfòmite ak estanda etik yo

Konfli enterè Otè yo pa deklare okenn konfli enterè.

Aksè Lib Atik sa a gen yon lisans Creative Commons Attribution 4.0 Lisans Entènasyonal, ki pèmèt itilizasyon, pataje, adaptasyon, distribisyon, ak repwodiksyon nan nenpòt mwayen oswa fòma, toutotan ou bay otè orijinal la kredi apwopriye. (s) ak sous la, bay yon lyen ki mennen nan lisans Creative Commons, epi endike si yo te fè chanjman. Imaj yo oswa lòt materyèl twazyèm pati nan atik sa a yo enkli nan lisans Creative Commons atik la sof si endike otreman nan yon liy kredi nan materyèl la. Si materyèl yo pa enkli nan lisans Creative Commons atik la epi règleman legal yo pa otorize itilizasyon ou a oswa depase itilizasyon otorize a, w ap bezwen jwenn pèmisyon dirèkteman nan men moun ki gen copyright. Pou wè yon kopi lisans sa a, vizite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.