Norwogonin diminye estrès oksidatif ki pwovoke ipoksi ak apoptoz nan selil PC12.

Pou plis enfòmasyon:ali.ma@wecistanche.com

Résumé

Background: Norwogonin se yon flavon natirèl ak twa gwoup idroksil fenolik nan estrikti skelèt e li gen ekselan.antioksidanaktivite. Sepandan, efè neuroprotective norwogonin rete klè. Isit la, nou envestige kapasite pwoteksyon norwogonin kont domaj oksidatif pwovoke pa ipoksi nan selil PC12. Metòd: Yo te egzamine viabilite selil la ak apoptoz pa tès MTT ak tach Annexin V-FITC / PI, respektivman. Kontni espès oksijèn reyaktif (ROS) te mezire lè l sèvi avèk DCFH-DA tès. Laktat dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA), akantioksidannivo anzim yo te detèmine lè l sèvi avèk twous komèsyal yo. Ekspresyon jèn ki gen rapò ak pwoteyin yo te mezire pa PCR quantitative an tan reyèl ak Western blotting, respektivman. Rezilta: Nou te jwenn ke norwogonin soulaje blesi ipoksi pwovoke nan selil PC12 nan ogmante viabilite selil la, diminye lage LDH, ak amelyore chanjman ki fèt nan mòfoloji selilè. Norwogonin tou te aji kòm yonantioksidanpa retire ROS, diminye pwodiksyon MDA, kenbe aktivite superoksid dismutase (SOD), katalaz (CAT), ak glutatyon peroksidaz (GPx), epi diminye nivo ekspresyon HIF-1 ak VEGF. Anplis de sa, wogonin te anpeche apoptoz selil yo atravè anpeche nivo ekspresyon caspase-3, cytochrome c, ak Bax pandan y ap ogmante nivo ekspresyon Bcl-2 ak rapò Bcl-2/Bax. Konklizyon: Norwogonin atténue blesi ipoksi-induit nan selil PC12 pa asouvisman ROS, kenbe aktivite yo nanantioksidananzim, ak anpeche chemen apoptoz mitokondriyo a.

Mo kle: Norwogonin,Aktivite antioksidan, Ipoksi, Estrès oksidatif, Apoptoz

Background

Òganis aerobic bezwen oksijèn (O2) pou pwodwi enèji. Ipoksi defini kòm rezèv O2 ensifizan pou kenbe fonksyon selilè nan tisi epi li souvan rive nan kèk sitiyasyon fizyolojik tankou altitid wo [1], ak nan anpil sitiyasyon patolojik tankou konjesyon serebral [2]. Sèvo a se patikilyèman sansib a blesi ipoksi-pwovoke akòz konsomasyon oksijèn segondè li yo, moun rich nan asid gra enstore, ak ba.antioksidankapasite [3]. Ogmante prèv ki endike ke ipoksi ka pwovoke efè negatif sou sèvo a [4-6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia, ak Huiping Ma

Depatman famasi, 940th Lopital Joint Lojistik sipò fòs PLA, Lanzhou 730050, Gansu, Lachin.

Estrès oksidatif ak apoptoz yo konsidere kòm de faktè kontribye nan blesi ipoksi-induit [7, 8]. Yo te rapòte ekspoze ipoksi ogmante pwodiksyon an nan espès oksijèn reyaktif entraselilè (ROS), ki fasilite estrès oksidatif. Twòp ROS, tankou anion superoksid (O2−˙), oksijene idwojèn (H2O2), ak radikal idroksil (HO•), mennen nan chanjman estriktirèl ak fonksyonèl selilè lè yo atake lipid, manbràn, pwoteyin ak ADN, epi imedyatman lakòz domaj selilè. 9].

Klike sou Cistanches pou antioksidan

Ansanm, overproduced ROS tou fasilite ouvèti mitokondriyo pèmeyabilite tranzisyon pò (mPTP) [10] ak transfere pwoteyin pro-apoptoz nan manbràn mitokondriyo ekstèn lan, ki pwovoke depolarizasyon nan manbràn mitokondriyo ak degaje cytochrome c [11]. Chanjman sa yo finalman lakòz apoptoz depandan mitokondriyo [12]. Se konsa, yo kwè keantioksidanak kapasite nan anpeche oswa elimine twòp ROS ka egzèse efè pwoteksyon yo atravè atenuasyon estrès oksidatif ak apoptoz pwovoke pa ipoksi. Anpil etid te pwouve saantioksidansipleman tankou vitamin C [13], izoflavon [8], ak radikal nitroksid [14], ka limite blesi ipoksi-induit nan vitro ak nan vivo. Flavonoid yo se yon klas gwo ak divès nan metabolit segondè plant omniprésente. Yo toujou konsidere kòm yon natirèl ekselanantioksidanak kapasite pou elimine radikal gratis ak anpeche peroksidasyon lipid.

Kounye a, pi plis ak plis atansyon yo te peye nan klas sa a nan konpoze akòz efè benefisye yo sou sante moun. Yo te montre flavonoid yo posede yon pakèt aksyon famasi, tankou aktivite anti-enflamatwa, antinociceptive, ak neuroprotective, elatriye, tout sa yo ka atribiye a aktivite antioksidan yo [15]. Anpil etid te endike ke flavonoid montre efè pwoteksyon ekselan sou echèk ipoksi-induit. Pou egzanp, rutin gen yon gwo efè neropwotektif kont lanmò selil ganglion retin pwovoke pa ipoksi [16]. Yon etid resan montre tou ke rutin ka soulaje domaj ipoksi ki pwovoke klori cobalt pa anpeche estrès oksidatif ak apoptoz nan selil H9c2 [17]. Anplis, Liu et al sijere ke nobiletin (3′,4′,5,6, 7,8-hexamethoxy flavon) diminye blesi myokad I/R atravè aktive Akt/GSK-3 chemen nan selil H9c2. [18]. Anplis de sa, acacetin ka pwoteje cardiomyocytes rat ak H9C2 cardiomyoblasts kont blesi ipoksi / reoxygenation-induit atravè AMPK-medyatè aktivasyon nan chemen an siyal Nrf2 [19].

Norwogonin (5,7,8-trihydroxy flavone, Fig. 1) se yon flavon pharmacologically aktif ki separe ak rasin Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" an Chinwa), yon zèb tradisyonèl Chinwa yo itilize pou trete grip ak kansè. [20, 21]. Sepandan, etid limite yo te rapòte sou aktivite yo byolojik nan norwogonin akòz nivo ki ba li yo nan plant natirèl. Yo nan lòd yo adrese pwoblèm sa a, yo rapòte plizyè metòd sentèz nan norwogonin [22, 23].

Etid anvan nou an te etabli tou yon metòd senp pou jwenn norwogonin nan chrysin nan kat etap [24]. Rechèch sa yo te enfliyanse pozitivman plis evalyasyon aktivite byolojik norwogonin yo. Etid yo te revele ke norwogonin posede antioksidan [25], antikansè [26, 27], antiviral [28], ak aktivite antimikwòb [29] osi byen ke inibit pwodiksyon an stimulé cyanide nan ROS [30]. Sepandan, si norwogonin gen kapasite pwoteksyon kont aksidan ipoksi-induit rete enkoni. Objektif etid la se te mennen ankèt sou efè pwoteksyon norwogonin kont estrès oksidatif ak apoptoz ipoksi pwovoke nan selil PC12.

Metòd

Materyèl ak reyaktif

Norwogonin (pite pi gran pase oswa egal a 98 pousan) te sentèz dapre metòd nou te rapòte deja [24]. Rutin (pite pi gran pase oswa egal a 96 pousan) te achte nan men Ci Yuan Biotechnology co, Ltd (Xian, Shannxi, Lachin). Norwogonin ak rutin te fonn nan esteril dimethyl sulfoxide (DMSO), ki estoke nan - 20 degre, ak dilye nan mwayen kilti selil la imedyatman anvan ou itilize. Dulbecco a modifye Eagle's medium (DMEM), serom fetal bovine (FBS), streptomycin, ak penisilin yo te achte nan men Solarbio co., Ltd. (Beijing, Lachin).

Twous yo nan malondialdehyde (MDA), laktat dehydrogenase (LDH), superoksid dismutase (SOD), katalaz (CAT), ak glutatyon peroksidaz (GPx) yo te jwenn nan Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, Lachin). 2′,7′-dichloride-hydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) ak (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolyom bromur) tetrazolyòm (MTT) te jwenn nan Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Antikò prensipal pou faktè ipoksi-induzibl -1 (HIF-1 ), faktè kwasans endothelial vaskilè (VEGF), lenfom selil B -2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} Pwoteyin X ki asosye (Bax), Caspase-3, Cytochrome C, ak -aktin yo tout te achte nan men Abcam (Cambridge, UK). Antikò segondè yo te jwenn nan konpayi ZsBio (Beijing, Lachin).

Yo te jwenn yon twous analiz apoptoz nan Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Lachin). Tout pwodui chimik ak solvang yo te nan klas analyse epi yo te jwenn nan yon founisè komèsyal nan Lachin. Kilti selilè Selil PC12 yo te achte nan men Bank Cell of Chinese Academy of Sciences (TCR 9, Shanghai, Lachin) epi yo te kenbe nan DMEM ak 10 pousan (v/v) FBS, 100 U/mL penisilin, ak 100 U/mL streptomycins. a 37 degre nan yon enkibatè imidite ki gen 5 pousan CO2. Pou evalye cytotoxisite norwogonin, selil PC12 (pasaj 4 ~ 6) yo te pre-enkube ak diferan konsantrasyon (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 mol/L) nan ni wogonin pou 1 h ak Lè sa a, kiltive pou 24 h. Ekspozisyon ipoksi Pou pwovoke modèl blesi ipoksi selilè, selil PC12 yo te sibi yon anviwònman ipoksi (1 pousan O2, 5 pousan CO2, ak 94 pousan N2) nan 37 degre pou 24 èdtan nan yon chanm imidite. Selil kontwòl Normoxic yo te kiltive a 37 degre nan yon enkibatè 5 pousan CO2 pou 24 èdtan.

Pou evalye efè pwoteksyon norwogonin kont blesi ipoksi pwovoke, selil PC12 yo te pre-enkube ak diferan konsantrasyon (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/). L) nan norwogonin pou 1 èdtan anvan tretman ipoksi. Viabilite selil yo te mezire viabilite selil yo pa tès MTT jan sa te dekri anvan [31]. An brèf, selil PC12 (1 × 105 selil / mL) yo te simen nan 96 plak kilti byen. Lè sa a, diferan konsantrasyon nan norwogonin yo te ajoute nan pwi yo. Yo te ajoute yon volim egal DMSO pou kontwole pwi yo. Konsantrasyon final DMSO nan mwayen kilti selil la se 0.1 pousan. Apre enkubasyon nan kondisyon normoxic oswa ipoksi, yo te ajoute 10 μL MTT (5.0 mg / mL) nan chak pi, ki te swiv pa enkubasyon nan 37 degre pou 4 èdtan. Lè sa a, yo te retire supernatant la ak MTT epi yo te fonn pwodwi formazan nan 100 μL DMSO. Yo te mezire absorbans la sou yon lektè microplate SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) nan 570 nm. Rezilta yo te eksprime kòm pousantaj relatif gwoup kontwòl la. Selil PC12 tach ematoksilin ak eozin (HE) ki simen sou kouvèti vè yo te enkube pou 24 èdtan anvan yo te trete yo ak norwogonin nan menm fason ki dekri pi wo a.

Yo te retire medyòm nan epi yo te lave kouvèti vè yo ak PBS frèt, ki te swiv pa fikse ak metanol pou 10 min nan tanperati chanm, ak Lè sa a, lave ak PBS frèt twa fwa pou 5 min. Finalman, selil yo te tache selon pwotokòl HE tach [32]. Yo te fè analiz selil la lè l sèvi avèk yon mikwoskòp OLYMPUS IX73 (100 ×) yo nan lòd yo verifye chanjman mòfolojik selil yo. Imaj dijital yo te jwenn lè l sèvi avèk kamera dijital DXM 1200 C (Nikon) ki asosye ak mikwoskòp la. Kontni ROS Yo te detèmine nivo ROS intraselilè nan selil PC12 lè l sèvi avèk DCFH-DA [33]. Yon ti tan, selil PC12 (1 × 105 selil/mL) yo te simen nan 6-plak byen yo. Apre tretman ipoksi, selil PC12 yo te lave ak PBS epi yo te enkube nan mwayen kilti ki gen 10 μM DCFH-DA pou 30 minit nan fè nwa a 37 degre. Selil yo te obsève ak mikwoskòp fliyoresan Olympus envèse (Tokyo, Japon) epi yo te analize pa yon sitomèt koule Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) ak yon longèdonn eksitasyon 488 nm ak longèdonn emisyon 525 nm. Nivo ROS te eksprime kòm yon pousantaj relatif nan kontwòl. Leakage LDH, kontni MDA, ak aktivite anzim antioksidan selil PC12 (1 × 105 selil / mL) yo te simen nan yon plat 90 mm. Apre tretman ipoksi jan sa dekri pi wo a, yo te kolekte 50 μL kilti supernatant nan chak plat, epi yo te detekte aktivite LDH nan mwayen an lè l sèvi avèk twous esè komèsyal (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Lachin) epi li te eksprime kòm U / mL. Selil PC12 yo te rekòlte ak omojeneize apre yo fin lave de fwa ak PBS frèt. Yo te mezire konsantrasyon nan pwoteyin total pa twous tès pwoteyin BCA. Kontni MDA ak aktivite anzim antioksidan yo te detèmine lè l sèvi avèk twous esè komèsyal (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Lachin).

Te kontni an nan MDA prezante kòm pwoteyin nmol / mg. Aktivite SOD, CAT, ak GPx yo te prezante kòm pwoteyin U/mg. Apoptoz selil (Annexin-V/PI tach) Apre tretman ipoksi, selil PC12 yo te rekòlte, lave de fwa ak PBS frèt, ak Lè sa a, sispann ak tanpon obligatwa. Selil yo te trete ak solisyon an Annexin V-FITC ak PI apre pwotokòl manifakti a (Beyotime, Shanghai, Lachin). Koleksyon done yo te fèt lè l sèvi avèk Becton Dickinson FACScan flow cytometer (BD Biosciences, CA, USA). Kantite analiz PCR an tan reyèl yo te ekstrè RNA total selil PC12 yo lè l sèvi avèk Trizol reyaktif (Takara, Dalian, Lachin) epi konvèti an cDNA lè l sèvi avèk PrimeScript TM RT reagent Twous (AK4301,

Takara, Dalian, Lachin). ADNc ki kode HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, kaspas-3, cytochrome C, ak glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) te anplifye pa kantite reyèl. tan PCR lè l sèvi avèk yon Sistèm deteksyon an tan reyèl 7300 (Applied Biosystems, CA, USA). Jadendanfan yo itilize yo te montre nan Tablo 1. Kondisyon yo monte bisiklèt PCR yo te 95 degre pou 30 s, ki te swiv pa 40 sik nan 95 degre pou 5 s ak 60 degre pou 31 s. Nivo mRNA yo te kalkile lè l sèvi avèk metòd 2-ΔΔCt ak nòmalize nan GAPDH, ki se jèn referans la. Western blot PC12 selil yo te rekòlte ak omojeneize nan ajan RIPA. Konsantrasyon total de protéines te quantifiée lè l sèvi avèk twous tès pwoteyin BCA. 30 ug echantiyon yo te rezoud sou 12 pousan elektwoforèz SDS-PAGE ak Lè sa a, transfere nan manbràn polyvinylidene fliyò (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA).

Manbràn yo te bloke ak 5 pousan lèt sèk ki pa gen anpil grès nan tanpon TBST pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak enkubasyon ak antikò prensipal: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, UK), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), anti kaspas-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), anti cytochrome C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) ak anti- -aktin (1:2000, ab8227). , Abcam, UK) nan 4 degre lannwit lan. Lè sa a, manbràn yo te lave ak enkubasyon ak antikò segondè (1:2000, ZsBio, Beijing, Lachin;) pou 1 èdtan nan tanperati chanm. Gwoup imunoreaktif yo te vizyalize lè l sèvi avèk reyaktif kimiluminesans ranfòse (ECL). Entansite relatif gwoup yo te nòmalize nan -actin kontwòl entèn ak analize lè l sèvi avèk Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Analiz estatistik

Rezilta yo te eksprime kòm vle di ± SD sòti nan omwen twa eksperyans endepandan. Yo te analize diferans ki genyen ant gwoup yo lè l sèvi avèk yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA) ki te swiv pa Student–Newman–Keuls apre tès la. Yon valè P < 0.05="" te="" konsidere="" kòm="" estatistik="">

Rezilta yo

Norwogonin pwoteksyon selil PC12 kont blesi ipoksi-induit

Premyèman, pou anpeche aktivite proliferatif norwogonin, sitotoksisite li yo sou selil nòmal PC12 yo te detèmine lè l sèvi avèk yon tès MTT. Jan yo wè nan Fig. 2a, pwopagasyon selilè pa te chanje anpil apre tretman ak norwogonin nan konsantrasyon 1 × 1 0 - 8 -1 × 1 0 - 5 mol / L (P > 0.05 ). Sepandan, viabilite selil siyifikativman diminye lè konsantrasyon nan norwogonin te ogmante a 1 × 10-4 mol / L (P <0.05). rezilta="" yo="" endike="" ke="" norwogonin="" pa="" t="" montre="" toksisite="" oswa="" aktivite="" proliferatif="" sou="" selil="" pc12="" nan="" konsantrasyon="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Lè sa a, nou egzamine efè pwoteksyon norwogonin kont blesi selil PC12 ipoksi pwovoke. Jan yo montre nan Fig. 2b, konpare ak gwoup kontwòl la, viabilite selil la nan gwoup ipoksi a te diminye a 58.71 pousan (P <0.01). konpare="" ak="" tretman="" ipoksi="" a,="" pretrete="" ak="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" ,="" ak="" 1="" ×="" 1{0−="" 6="" mol/l="" norwogonin="" dòz-depandan="" pwoteje="" pc12="" selil="" kont="" blesi="" ipoksi-pwovoke,="" rekipere="" viabilite="" selil="" la="" soti="" nan="" 58.71="" a="" 62.79="" pousan="" (p=""><0.05), 66.68="" pousan="" (p=""><0.01) ak="" 69.88="" pousan="" (p=""><0.01), respektivman.="" pretretman="" ak="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol="" l="" rutin="" tou="" te="" montre="" yon="" efè="" pwoteksyon,="" siyifikativman="" ogmante="" viabilite="" selil="" la="" a="" 63.78="" pousan="" konpare="" ak="" tretman="" an="" ipoksi.="" viabilite="" a="" pretrete="" ak="" 1="" ×="" 10−="" 5="" mol="" l="" norwogonin="" te="" diminye="" a="" 63.43="" pousan,="" ki="" se="" toujou="" siyifikativman="" pi="" wo="" pase="" sa="" yo="" ki="" nan="" gwoup="" la="" ipoksi="" (p=""><0.05). rezilta="" sa="" yo="" te="" demontre="" ke="" norwogonin="" te="" montre="" sitopwoteksyon="" enpòtan="" nan="" konsantrasyon="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" ak="" konsantrasyon="" ki="" pi="" efikas="" se="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l.="" lè="" sa="" a,="" dòz="" sa="" a="" te="" itilize="" kòm="" dòz="" la="" pi="" bon="" nan="" eksperyans="" sa="">

Kapasite pwoteksyon norwogonin te verifye tou pa chanjman mòfolojik. Jan yo montre nan Fig. 2c, selil PC12 san tretman ipoksi te grandi byen ak fòm regilye (fusiform), gwosè inifòm. Apre ekspoze ipoksi, selil PC12 yo te parèt kontraksyon, fòm awondi, desquamation, ak dansite selil redwi. Selil yo pretrete ak norwogonin oswa rutin anvan ekspoze ipoksi te grandi pi byen, kantite selil desquamation diminye, ak fòm selil refè nòmalman. Anplis, kapasite pwoteksyon norwogonin konfime pa flit LDH, ki asosye ak pèt entegrite manbràn selilè a. Jan yo montre nan Fig. 2d, aktivite LDH nan mwayen kilti a te ogmante anpil apre ekspoze ipoksi (P <>

Pretreatman ak norwogonin oswa rutin redwi dramatikman flit LDH, sijere ke norwogonin ak rutin retabli entegrite manbràn selilè a. Norwogonin inibit estrès oksidan ipoksi pwovoke nan selil PC12 ROS ak MDA se de endikatè enpòtan nan estrès oksidan selilè pwovoke pa ipoksi. Jan yo montre nan Fig. 3a ak b, yo te obsève yon kontni siyifikativman ogmante nan ROS ak MDA nan selil PC12 apre ekspoze ipoksi. Norwogonin oswa pretretman rutin siyifikativman anpeche pwodiksyon ROS ak MDA.

Anzim antioksidan, tankou SOD, CAT, ak GPx, yo konsidere kòm sistèm defans prensipal kont estrès oksidatif nan selil yo. Jan yo montre nan Fig. 3c-e, ekspoze ipoksi siyifikativman anpeche aktivite yo nan SOD, CAT, ak GPx nan selil PC12. Tretman ak norwogonin oswa rutin ranvèse chanjman sa yo ak retabli aktivite yo nan anzim antioksidan. Tout rezilta sa yo endike ke norwogonin pwoteje selil PC12 yo kont estrès oksidatif ki pwovoke pa ipoksi.