Estrès oksidatif, metabolis enèji malfonksyònman, ak nerotransmetè destabilize yo te chanje pwofil metabolik serebral la nan yon modèl rat simulation elyoks saturation plonje a 4.0 MPa Ⅱ

Pwosedi ekstraksyon tisi

Pwosedi ekstraksyon metabolit polè soti nan echantiyon tisi se te yon modifikasyon minè jan yo rapòte [18]. Echantiyon tisi ki nan frizè ki te prepese yo te dekonjle sou glas epi yo te sibi omojènizasyon mekanik nan yon sistèm sòlvan methanol-kloroform-dlo ki frèt ak glas (400 μL, 400). μL, ak 285 μL, respektivman, pou chak 100 mg tisi nan sèvo) lè l sèvi avèk yon homogenizer tisi (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Frans). Yo te kenbe omojèn ki te lakòz yo sou glas pou yon peryòd de 30 minit epi answit santrifuje nan 12,000 xg pou yon peryòd de 10 minit nan 4˚C. Lè sa a, sipènatant chak echantiyon an te retire epi liyofilize pou jwenn yon poud ki gen metabolit polè nan yon seche friz (FD-1A{-80, BIOCOOL, Lachin). Apre sa, chak echantiyon poud te rekonstitye ak 550 μL tanpon PBS ki gen 0.1 pousan TSP, epi tout echantiyon yo te byen melanje ak santrifuje nan 12, 000 xg pou yon peryòd de 20 min nan 4˚C. Lè sa a, yon aliquot 500 μL supernatant te transfere nan yon tib NMR 5.0 mm-dyamèt (Norrel, UK). Prensip la fè ekstraksyon nan pwoteyin nan echantiyon an cortical te jan yo dekri deja san okenn modifikasyon. Kantite egzak echantiyon cortical yo te vide nan yon tanpon omojènize (HEPES 25 mmol/L, pH 7.4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1.3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0.1 pousan Triton X-100, aprotinin, pepstatin A ak leupeptin 10 ug/ml chak) epi omojeneize manyèlman nan yon beny glas. Yo te santrifize melanj lan nan 1,000 xg pou yon peryòd de 10 min nan 4˚C, epi yo te itilize supernatant la pou konsantrasyon pwoteyin ki mezire lè l sèvi avèk tès Bradford la.

Klike La a Pou Konnen Fonksyon Anti-Oksidasyon Cistanche

Esè byochimik

Yo te aplike yon tès imunosorban anzim-lye (ELISA) sansib, konpetitif ak twous tès pou quantification anzim metabolik Na-KATPase ak AChE ak nerotransmeteur DA, E, NE, 5HT, ak GABA. ELISA te detèmine tou nivo SOD, MDA, ak GPx nan tisi kortik ak twous tès dapre enstriksyon manifakti a.

Mezi RMN

Kantifikasyon efikas metabolit tisi yo te reyalize lè l sèvi avèk yon platfòm analyse ki baze sou yon espektromèt RMN Bruker Avance-III likid ki gen gwo rezolisyon ki ekipe ak yon sond kriyojenik ki gen gwo sansiblite k ap opere nan yon frekans 600. 17 MHz pou obsèvasyon 1 H nan 298 K. Yo te aplike yon sekans batman (RD-90˚-ACQ) 1 H ZGPR (TOPSPIN vèsyon 3.0, Bruker Biospin) ki genyen yon sèl dimansyon ak dlo. jwenn done RMN pou chak echantiyon. Kat eskanè egare ak 128 transient yo te anrejistre nan yon domèn tan nan 32 K pwen done lè l sèvi avèk yon lajè espèk nan 20 ppm ak yon reta detant nan 10.0 s ak yon tan akizisyon nan 2.73 s. Yon fonksyon eksponansyèl elaji liy nan 0.3 Hz ak zewo-ranpli a 64 K pwen done yo te aplike nan tout dezentegrasyon yo gratis endiksyon (FIDs) anvan transfòmasyon Fourier. Lòt teknik RMN ki genyen de dimansyon ak espektroskopi korelasyon gradyan jaden enpulsyonèl (gCOSY) ak espektroskopi korelasyon total 2D omonukleyèr (TOCSY) yo te anplwaye lè l sèvi avèk pwogram batman kè estanda sou echantiyon chwazi yo konfime plasman chanjman chimik yo. Yo te itilize yon chanjman otomatik echantiyon pou livrezon echantiyon kontinyèl nan tout akizisyon spectre.

Idantifikasyon metabolit ak konfimasyon

Siyal NMR ki baze sou kote rezonans endividyèl yo sou spectre yo te idantifye nan pake lojisyèl Chenomx NMR Suite v. 8.4 (vèsyon Evalyasyon). Konfimasyon kèk devwa metabolit yo te pote soti nan konsidere chanjman chimik, konstan kouple ak modèl miltiplisite metabolit kòm enfòmasyon sou kouple eskalè ki sòti nan 1 H-1 H COSY, 1 H-1 H TOCSY, baz done RMN piblik tankou COLMAR ak Metabolom Imèn. Baz done (HMDB), ak literati [18, 19].

Analiz estatistik miltivarye

Pwotokòl pre-pwosesis yo te itilize pou pre-pwosesis chak spectre 1D 1H NMR te menm jan ak sa ki dekri nan travay anvan nou an [20]. 1 H NMR spectre yo te pwogresivman ak debaz korije lè l sèvi avèk MestReNova (Mestrelab Research, SL, Espay), ak rejyon an espèk nan chak metabolit te entegre nan yon sèl bokit. Resonans siyal sòlvan òganik la ak rejyon siyal H2O/HOD rezidyèl yo te retire nan tout espèk 1D 1 H NMR. Yon pwosedi bokit 0.{{30}}03 Hz ak nòmalizasyon nan sòm entansite espèk miltipliye pa 10000 yo te aplike nan tout espèk. Se sèlman pi gwo valè bokit yo nan yon sèl pik yo te chwazi pou analiz pwochen etap la pou evite move entèpretasyon metabolit diskriminan yo akòz siyal sipèpoze yo. Imedyatman, bokit entegral 47 metabolit yo te ekstrè epi yo te sibi analiz done univarye ak miltivarye. Analiz endiskriminasyon pa analiz eleman prensipal (PCA) ak analiz diskriminasyon pa analiz pasyèl pi piti kare-diskriminatif (PLS-DA) ak pwojeksyon ortogonal nan analiz diskriminan estrikti inaktif (OPLS-DA) te fèt lè l sèvi avèk pake lojisyèl SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics). , Umeå, Sweden) echèl nan done divèjans inite yo. Yo te ilistre siplo nòt PCA ak PLS-DA yo ak premye ak dezyèm eleman prensipal yo (t[1], t[2]), alòske trase nòt OPLS-DA yo te itilize t[1] ak eleman ortogonal la (a[1] ]). Paramèt Q2 (cum), R2Y (cum), ak R2X (cum) yo te kalkile pou teste solidite modèl diskriminasyon yo kont overfitting [21]. Jan sa te dekri deja, yon valè evalyasyon kalite Q2 � 0.4 konsidere kòm yon modèl serye. Estrateji sèt fwa kwa-validasyon ak tès pèmitasyon 200 fwa ak premye eleman yo te aplike pou veye kont modèl overfitting ak plis valide fyab ak fyab nan modèl yo. Si liy regresyon Q2 la te gen yon entèsepte negatif ak valè Q2 ki te mete nan pwen ki pi goch la te pi gran pase tout valè Q2 pwen dwat yo nan tès permutation, modèl OPLS-DA etabli a te gaya [22]. Yo te aplike estrateji 10-defo kwa-validasyon an pou pwoteje tèt ou kont surfitting modèl yo. An jeneral, yon estatistik evalyasyon kalite (Q2) � 0.4 konsidere kòm yon modèl serye, jan sa te dekri deja. Koefisyan korelasyon (r) ak valè VIP ki soti nan modèl OPLS-DA yo te itilize pou idantifye metabolit ki te kontribye anpil nan separasyon ant de gwoup yo. Anplis de sa, chanjman pliye metabolit ant gwoup yo te kalkile lè l sèvi avèk yon fonksyon. IA/IB, kote IA ak IB reprezante valè mwayen pou entegral metabolit la nan gwoup A ak B yo, respektivman. Map chalè ak tablo bwat yo te trase pou fasilite konpreyansyon varyasyon metabolit yo nan mitan gwoup yo.

Estatistik univarye nan entegral metabolit

Mwayèn bokit metabolit nan chak gwoup eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD). Te analiz univarye tou te pote soti lè l sèvi avèk ANOVA (analiz divèjans). Diferans estatistik enpòtan ant gwoup yo te evalye pa yon tès t unpaired nan de ke apre konvèsyon boutèy demi lit nan lojisyèl GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). Diferans estatistik enpòtan yo te defini pa valè p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Sistèm estatistik korelasyon metabolik analiz ak analiz gwoup yerarchize

Kalkil koyefisyan korelasyon Pearson ak analiz gwoup yerarchize yo te fèt dapre entegral relatif metabolit yo nan R Studio (Vèsyon 1.4.1717) ak ti scripts. Pou chak pè gwoup, yo te montre matris korelasyon an nan yon kat jeyografik pixel jan sa dekri nan literati a [21]. Yon ti tan, pou chak varyab nan yon gwoup, korelasyon ak valè p mwens pase 0.05 yo te konsidere kòm korelasyon estatistik enpòtan epi yo te kenbe pou konstwi rezo korelasyon final la pou ilistre relasyon inaktif nan metabolit nan gwoup ak deranje relasyon metabolik ant gwoup yo. Kare ki pi wouj yo endike yon korelasyon pozitif ki pi enpòtan. Kare ki pi ble yo endike yon korelasyon pozitif ki pi enpòtan. Kare blan yo endike korelasyon an ki pa gen okenn siyifikasyon. Analiz de wout metabolik serebral ki pi enpòtan yo ak rezo yo envoke kòm moun ki repond nan HSD yo te fèt lè l sèvi avèk zouti MetaboAnalyst 3.0 la. Pou analiz topoloji chemen ki fèt, yo te chwazi bibliyotèk chemen mamifè Rattus norvegicus (rat). Yo te itilize apwòch sa a tou pou bay estimasyon enpak chemen an, pousantaj dekouvèt fo (FDR), ak valè p.

Rezilta Endis kortik byochimik ki soti nan gwoup HSD ak CON

Pou valide efè chanjman metabolik HSD sou tisi nan sèvo, paramèt byochimik, ki gen ladan metabolik enèji ki gen rapò ak aktivite metabolik anzimatik Na-KATP, AChE, ak LDH, nerotransmeteur DA, E, NE, 5HT, ak GABA, ak lapwoteyin ki gen rapò ak estrès oksidatifnanSOD, MDA, ak Gpx nan tisi cortical ipsilateral rat HSD ak CON yo te detèmine tou (Tablo 1). Konpare ak gwoup kontwòl la, nivo DA, E, NE, ak MDA yo te ogmante anpil, tandiske sa ki nan Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD, ak Gpx te diminye nan modèl HSD. Limit la nan deteksyon nan twous tès yo itilize nan travay la prezan te ki nan lis nan Tablo S3 la nan dosye a nan materyèl siplemantè.

Tablo 1. ELISA te mezire kantite paramèt byochimik nan tisi cortical CON ak bèt HSD pa ELISA ak twous tès yo. (vle di ± SD). endike siyifikasyon estatistik.

Metabolit idantifye nan spectre 1 H NMR nan echantiyon tisi nan sèvo

Fig 3 montre twa reprezantan 1 H NMR spectre nan cortical a (Fig 3A), ipokanp (Fig 3B), ak striatum (Fig 3C) nan yon rat HSD. Yon pakèt metabolit enpòtan yo te idantifye dapre done 1 H NMR nan echantiyon tisi nan sèvo, epi yo se anyon asid òganik (lactate (Lac), malonate (Maln), succinate (Suc), malat (Mal), fumarate (FMA). ), 2-hydroxybutyrate (2-HB), acetate (Ace), fòma (Pou), taurin (Tau), ascorbate (Asc), 2-hydroxybutyrate (2HIB)), asid amine (Leucine (Leu), isoleucine (Ile), valine (Val), alanine (Ala), glisin (Gly), tirozin (Tyr), fenilalanin (Phe), aspartate (Asp), glutamin (Gln), glutamate (Glu) , treonin (Thr), serin (Ser), lizin (Lys), asparagin (Asn)), nerotransmeteur (-aminobutyrate (GABA)), metabolit ki gen rapò ak enèji (kreyatin (Cre), adenozin trifosfat (ATP), adenozin monofosfat ( AMP)), metabolit fosfolipid ki gen rapò (Ophosphoethanolamine (PEA), O-phosphocholine (Pcho), sn-glycero-3-phosphocholine (GPC)), ak lòt moun (myo-inositol (MI), nikotinamid adenine dinukleotid (NAD plis). ), asid nikotin (Nic), N-acetylaspartate (NAA), nikotinamid-adenine-dinukleotid fosfat (NADP plis), UDP-N-galaktoz (UDPGa), uridin (Uri), uracil (Ura), cystidine (Cyt) , uridine 5'-monofosfat (UMP), inozin 5'-monofosfat (IMP), inozin (Ino), kolin (Cho), machin nitine (Machin), glutatyon (GSH). Tablo S1 montre enfòmasyon detaye sou plasman metabolit yo.

Chanjman pwofil metabolik revele pa analiz metabolomik

PCA, yon apwòch analiz eksploratwa ak san patipri nan spectre 1 H RMN ki soti nan tout ekstrè nan sèvo atravè diferan rejyon nan sèvo, te premye te fè pou revele tandans metabolik prensipal yo ki te kondwi pa ekspoze ipèrbarik nan yon 400 msw. anviwònman saturation elyoks. Yon tracé PC1 kont PC2 te jwenn nan PCA (S1A–S1C Fig) nan done bokit entegral revele yon sèten diskriminasyon ak kèk sipèpoze ant de klasifikasyon yo. Ankèt ki sipèvize sou modèl PLS-DA (S1A'–S1C' Fig) ak OPLS-DA (Fig 4A–4C) montre diskriminasyon klè nan klas pwofil metabolik ant gwoup yo. Fig 4 montre simityè nòt nan modèl OPLS-DA pou rejyon cortical (A), rejyon ipokanp (B), ak rejyon striatum (C), ki montre klè diskriminasyon ant gwoup HSD yo ak kontwòl yo. Gwo varyasyon an eksplike ak bonte nan prediksyon an reflete pa valè yo nan R2X ak Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig 4A–4C) ak trase tès pèmitasyon (Fig 4'-4C'A) te endike a. solidite nan modèl yo sipèvize pwodwi yo. Koefisyan korelasyon (r) ki soti nan simit S-liy yo, enpòtans varyab nan pwojeksyon (VIP), ak valè p nan tès nonparametric univariate yo te kolekte pou evalye metabolit enpòtan ki responsab pou modèl diskriminasyon klas yo. Se poutèt sa, satisfè nenpòt youn nan twa kritè yo (valè absoli r ki pi gran pase 0.50, valè VIP ki pi gran pase 1.0, ansanm ak valè p mwens pase 0.05), nou chwazi yon panèl metabolit estatistik enpòtan. (Tablo 1) responsab pou separasyon ant gwoup CON ak HSD yo. Nan Tablo 1, valè pliye-chanjman ki pi gran pase 1 endike yon nivo ogmante nan gwoup HSD a, pandan y ap valè pliye-chanje mwens pase 1 endike yon nivo diminye nan gwoup HSD la. Valè SD mwayèn nan metabolit diskriminatwa yo ki nan lis S2 Tablo. Sèvi ak analiz gwoup yerarchize metabolit yo ak metòd lyen an mwayèn, kat chalè ki pwodui (figi 5A–5C) ak dendrograms pèmèt yon pi bon vizyalizasyon nan twa chanjman metabolik rejyon sèvo ki te koze pa ekspoze ipèrbarik nan yon anviwònman oksijèn elyòm ki satire.

Maladi metabolik yo obsève nan diferan rejyon nan sèvo rat HSD yo

Analiz miltivarye mansyone anwo a ak analiz univarye lè l sèvi avèk wotè bokit metabolit yo nan diferan gwoup yo te bay yon gwo tib travay pou idantifye metabolit diskriminatwa ki revele potansyèl chanjman newolojik metabolik ki asosye ak evènman HSD yo. Elevasyon AMP, FMA, Nic, ak Phe ak yon diminisyon nan Ala, Asn, Machin, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura, ak Uri yo te jwenn nan tisi cortical HSD la. gwoup konpare ak gwoup CON (Fig 5A, Tablo 1). Pandan se tan, nan ipokanp la, Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr, ak Ura tou diminye ak AMP ogmante nan gwoup la HSD, menm jan yo te fè nan cortical a. Anplis, Thr ak downregulated Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc, ak DMA yo te eksprime nan ekstrè ipokanp nan gwoup HSD relatif a kontwòl yo (figi 5B, 5D, Tablo 1). Konpare ak gwoup CONS la, sa ki nan Cyt, GABA, Ura, Cho, ak Thr tou diminye menm jan yo te fè nan cortical a ak ipokanp. Anplis de sa, ogmante nivo asid amine ramifye (BCAA, ki gen ladan Leu, Ile, Val), ak Lys ak nivo diminye Gln, NAA, NAD plis, NADP plis, Asp, yon seri metabolit ATP, Tau, IMP, ak Suc, ki tou diminye nan ipokanp la, ak yon lòt de metabolit, Ino ak Pcho, ki tou diminye nan cortical a, yo te obsève nan tisi yo striatum nan rat gwoup HSD (Fig 5C, 5D, Tablo 1). Anpil metabolit sa yo toujou endike chemen molekilè ki enplike ak konpleksite ak divèsite. Valè bokit entegral metabolit diskriminan yo te mezire, epi estatistik siyifikatif pliye-chanjman nan konsantrasyon yo ant heliox-saturation-hyperbaric-ekspoze ak gwoup kontwòl yo rezime nan S2 Tablo ak Tablo 2 pou twa rejyon yo nan sèvo.

Fig 4. Òtogonal pasyèl pi piti kare diskriminan analiz (OPLS-DA) sima nòt ak trase tès pèmitasyon ki fè diskriminasyon efè a nan 400 msw elyoks-saturasyon ekspoze sou 1H RMN spèkt soti nan gwoup kontwòl nan cortical a (CONC, n=8, HSDC, n=8, A ak A') (R2X=0.38; Q2=0.46), ipokanp (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B ak B') (R2X=0.37; Q{2=0.43), ak striatum (CONS, n=8, HSDS, n=8, C ak C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Valè paramèt Q2 nan sima nòt OPLS-DA yo, ki te egal a oswa pi gran pase 0.40, makonnen ak valè Q2 nan pwen ki pi goch la nan modèl pèmitasyon yo te pi gran pase tout valè Q2 ekipe nan pwen dwat yo (pèmitasyon). tès 80 fwa), ki endike ke modèl OPLS-DA etabli yo te valab.

Pcho, ki tou diminye nan cortical a, te obsève nan tisi yo striatum nan rat gwoup HSD (Fig 5C, 5D, Tablo 1). Anpil metabolit sa yo toujou endike chemen molekilè ki enplike ak konpleksite ak divèsite. Valè bokit entegral metabolit diskriminan yo te mezire, epi estatistik siyifikatif pliye-chanjman nan konsantrasyon yo ant heliox-saturation-hyperbaric-ekspoze ak gwoup kontwòl yo rezime nan S2 Tablo ak Tablo 2 pou twa rejyon yo nan sèvo.

Fig 5. Heatmap ak korelasyon estatistik yo ki sòti nan valè bokit metabolit diskriminatwa ki soti nan cortical a (A, A', echantiyon HSDC yo nan panèl anwo a ak CONC nan panèl ki pi ba a), ipokanp (B, B', HSDH). gwoup manti nan panèl anwo a ak CONH manti nan panèl ki pi ba a), ak striatum (C, C ', echantiyon HSDS kouche nan panèl anwo a ak CONS manti nan panèl ki pi ba a) tisi HSD ak CON rat. Metabolit sou kat chalè a òganize pa gwoupman yerachi ki baze sou resanblans an jeneral nan modèl nivo. Dyagram Venn (D) ki montre sipèpoze metabolit pami konparezon HSDC-CONC, HSDH-CONH, ak HSDS-CONS.

Analiz korelasyon metabolit

Relasyon ant oswa pami metabolit yo te tèlman konplèks nan Figi 5A'-5C'. Pou metabolit enèji yo, korelasyon pozitif pou Lac vs Ala nan HSDC, AMP vs IMP nan HSDH, ATP vs Pcho nan HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA nan HSDS, ak korelasyon negatif pou Lac vs Thr ak GSH vs. Suc nan HSDH, Suc vs Val nan HSDS te prezan nan korelasyon metabolit yo. Pou nerotransmeteur yo, korelasyon pozitif pou GABA vs Machin nan HSDC, GABA vs Cho nan CONH, ak GABA vs Suc / Ino / Gln nan HSDS te prezan nan simit korelasyon metabolit yo. Korelasyon negatif pou GABA vs FMA nan CONC ak GABA vs NAA/Ura/NADP plis nan CONS yo te prezan nan simit korelasyon metabolit yo. Pou metabolit yo ki gen rapò akestrès oksidatif, lakorelasyon pozitifpou GSH vs Asn nan HSDC a ak CONC a, Tau vs Lac nan HSDH a, Tau vs Suc/Ala nan CONH a, korelasyon negatif yo pou GSH vs Suc nan HSDH a, Tau vs Thr nan HSDH a ​​te prezan nan korelasyon metabolit la. trase.

Analiz chemen Metabolomik

Analiz chemen quantitative ki gen ladann analiz anrichisman chemen ak enpak chemen soti nan topoloji chemen revele modulasyon HSD ki gen anpil enpòtans estatistik nan yon seri de chemen metabolik. Nòt enpak chemen yo, ansanm ak to dekouvèt fo (FDR) ak valè p, yo dekri nan Fig 6. Yo te konsidere chemen yo siyifikativman anrichi si valè p yo te pi ba pase 0.05; métabolites profilés (frais) parapò ak metabolit total chemen an (siti match) te pi wo pase 1; ak nòt enpak yo (ki endike enpak metabolit ki afekte anpil nan chemen an ki baze sou mezi topoloji rezo a nan santralite ant relatif) yo te pi wo pase 0. Chemen yo nan cortical a (figi 6A) ki gen pi gwo valè enpak metabolik yo te.fenilalanin, tirozin, epibyosentèz triptofan>metabolis fenilalanin> metabolis pirimidin > metabolis alanin, aspartate, ak glutamat. Chemen nan ipokanp la (figi 6B) ki gen pi gwo enpak metabolik yo se fenilalanin, tirozin, ak triptofan byosentèz > metabolis glutatyon > metabolis glisin, serin ak treonin > metabolis purin > metabolis pirimidin > metabolis alanin, aspartat, ak metabolis glutamat > metabolis butanoat. . Chemen yo nan striatum a (figi 6C) ki gen pi gwo enpak metabolik yo te alanine, aspartate, ak metabolis glutamate> metabolis nikotinat ak nikotinamid> metabolis purin.

Mande plis:

Imèl:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plis 86 15292862950