PATI 1 Echinacoside pwovoke vasorelaxasyon atè pulmonè rat yo lè li louvri chanèl NO-cGMP-PKG-BKCa yo epi redwi nivo entraselilè Ca2 plis.

Ki jan echinacoside pwovoke detant venn?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Depatman Farmakoloji, Lekòl Syans Lavi ak Biopharmaceutique, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Lachin; 2 Research Center for High Altitude Medicine, Medical College of Qinghai University, Xining 810001, Lachin; 3 School of Pharmacy, Qinghai University for Nationalities, Xining 810007, Lachin; 4 Qinghai Antre-Sòti enspeksyon ak karantèn biwo, Xining 810001, Lachin

Objektif:Vasokonstriksyon nan poumon soutni jan yo gen eksperyans nan altitid wo ka mennen nan tansyon wo nan poumon (PH). Objektif prensipal etid sa a se mennen ankèt sou efè vasorelaxantechinacoside(ECH), yon glikozid fenilethanoid ki soti nan zèb Tibetan Lagotis brevituba Maxim akCistanche tubulosa, sou atè a poumon ak mekanis potansyèl li yo.

Metòd:Bag atè poumon yo te jwenn nan rat Wistar gason yo te sispann nan chanm ògàn ki te ranpli avèk solisyon Krebs-Henseleit, epi yo te mezire tansyon izometrik lè l sèvi avèk yon transducer fòs. Nivo Entraselilè Ca2 plis yo te mezire nan kiltive selil pulmonè nan misk lis (PASMCs) lè l sèvi avèk Fluo 4-AM.

Rezilta: ECH(30-300 μmol/L) atyè pulmonè rat dekontrakte pa noradrenalin (NE) nan yon fason ki depann de konsantrasyon, epi efè sa a ta ka obsève nan tou de bag andotelyo entak ak endothelium-denuded, men ak yon repons maksimòm siyifikativman pi ba ak yon pi wo EC50 nan bag endothelium-denuded. Efè sa a te siyifikativman bloke pa L-NAME, TEA, ak BaCl2. Sepandan, IMT, 4-AP, ak Gli pa t anpecheECH-pwovoke detant. Anba kondisyon ekstraselilè Ca2 plis -gratis, kontraksyon maksimòm lan te redwi a 24.54 pousan ± 2.97 pousan ak 10.60 pousan ± 2.07 pousan nan bag trete ak 100 ak 300 μmol / L nan ECH, respektivman. Anba kondisyon ekstraselilè kalsyòm aflu, kontraksyon maksimòm lan te redwi a 112.42 pousan ± 7.30 pousan, 100.29 pousan ± 8.66 pousan, ak 74.74 pousan ± 4.95 pousan nan bag trete ak 30, 100, ak 300 μmol/L ECH, respektivman. Apre selil yo te chaje ak Fluo 4-AM, entansite fluoresans mwayen an te pi ba nan selil trete akECH(100 μmol/L) pase ak NE.

Konklizyon: ECHsiprime kontraksyon NE-pwovoke nan atè poumon rat atravè diminye nivo entraselilè Ca2 plis, epi pwovoke detant li yo atravè chemen NO-cGMP ak ouvèti K plis chanèl (BKCa ak KIR).

Mo kle:zèb tibeten;echinacoside; tansyon wo nan poumon; gwo altitid; vasorelaksasyon; NON; BKCa; KIR; bag atè; selil misk lis atè nan poumon yo.

Pou plis enfòmasyon tanpri kontakte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola gen anpil efè, klike isit la pou konnen plis

Entwodiksyon

Vasokonstriksyon nan poumon soutni jan yo gen eksperyans nan altitid wo ka mennen nan tansyon wo nan poumon (PH) ak ipètrofi medyòm [1], ki te idantifye kòm kòz prensipal ipètrofi vantrikul dwat ak ensifizans kadyak [2]. Moun k ap viv nan gwo altitid, swa tanporèman oswa pèmanan, ka prezante tansyon wo nan poumon modere, ak moun ki gen pi gwo sansibilite nan ipoksi ka gen vazokonstriksyon pulmonè egzajere, ki mennen nan divès maladi wo altitid ki asosye ak morbidite enpòtan ak mòtalite, tankou èdèm poumon ki wo altitid ak maladi kè [3].Echinacoside(ECH) (Figi 1) se yonphenylethanoid glikozidyo te jwenn nan yon varyete remèd fèy Chinwa tankou zèb Tibetan Lagotis brevituba Maxim akCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim se yon espès Lagotis spp ki fè pati Scrophulariaceae ak grandi anpil nan yon altitid plis pase 3000 mèt nan Plato Qinghai-Tibet la.ECHgen divès kalite dezirab karakteristik farmakolojik, tankou antioksidatif, anti-enflamatwa, neuroprotective, epatoprotective, ak oksid nitrique (NO) pwopriyete radikal-scavenging [6]. Li kapab tou pwovoke detant andotelyo-depandan nan bag aortik thoracic rat ak geri maladi kadyovaskilè [7]. Sepandan, nan pi bon nan konesans nou an, pa te gen yon etid mennen ankèt sou efè li yo sou ton an vaskilè nan atè poumon. Objektif etid sa a se jan sa a: (1) eksplore si ECH pwovoke in vitro vazorelaxasyon nan atè poumon rat precontracted ak noradrenalin (NE), epi si efè sa a, si genyen, se andotelyo-depandan oswa aji dirèkteman sou misk vaskilè lis. ; (2) pou mennen ankèt sou efè ECH sou aflu kalsyòm ekstraselilè ak lage kalsyòm entraselilè nan selil misk lis atè pulmonè rat (PASMCs); ak (3) yo idantifye chemen posib ak K plis chanèl ki enplike nan detant ECH-induit.

Materyèl ak metòd

Reyaktif

Doktè Peng-fei TU nan Peking University (Beijing, Lachin) te bay ECH dousman ak yon pite ki gen plis pase 98 pousan jan sa detèmine pa segondè-pèfòmans likid chromatografi. Dimethyl sulfoxide (DMSO) te achte nan men Solè Syans & Teknoloji Co, Ltd (Beijing, Lachin); NE, asetilkolin (ACh, pi gran pase oswa egal a 99 pousan), endometacin (IMT), Nω -Nitro-L-arginine methyl ester idroklorid (L-NAME), klori tetraethylammonium (TEA), klori barium (BaCl2), {{ 9}}aminopiridin ({{10}}AP), ak glibenclamide (Gli) ki soti nan Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA); segondè-glikoz Dulbecco a modifye Eagle's medium (DMEM), serom fetal bovine (FBS), ak tripsin soti nan Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, USA); antikò sourit anti-rat prensipal aktin nan misk lis (-SMA) ak antikò kabrit anti-sourit segondè soti nan Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Lachin); Endikatè Fluo Kalsyòm (Fluo 4-AM) ki soti nan Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, USA); ak tout sèl inòganik nan Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Beijing, Lachin). IMT te fonn nan DMSO ak 5 pousan NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM, ak ECH te fonn nan DMSO, ak tout lòt reyaktif yo te fonn nan Krebs-Henseleit (KH) oswa solisyon PBS. Eksperyans preliminè yo te montre ke DMSO nan mwens pase 0.1 pousan (v / v) pa te gen okenn efè sou devlopman tansyon nan bag izole ateryèl poumon.

Bèt eksperimantal

Tout pwosedi ak pwotokòl yo te apwouve pa Komite Swen ak Itilizasyon Animal nan Kolèj Medikal Inivèsite Qinghai. Gason rat Wistar, 6-8 semèn, 250-300 g pwa kò, yo te achte nan Sant Animal nan Lanzhou University (Lanzhou, Lachin) epi yo te kenbe sou yon rejim laboratwa estanda ak dlo tiyo ad libitum nan yon tanperati anbyen nan 22±. 2 degre ak imidite relatif 45 pousan -55 pousan pandan tout eksperyans yo.

In vitro perfusion atè poumon

Preparasyon nan bag atè poumon rat

Rat ki te peze 250-300 g yo te anestezi pa piki entraperitoneal nan pentobarbital sodyòm (40 mg/kg), epi yo te retire kè yo ak poumon yo epi yo te plonje imedyatman nan yon solisyon KH ki frèt ki gen (an mmol/L) : 118 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 MgSO4 · 7H2O, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, ak 11.1 glikoz (pH 7.4). Atè entrapulmonè yo (0.7-1.5 mm an dyamèt) yo te diseke gratis nan tisi konjonktif ki antoure ak adantis ak Lè sa a, koupe an bag apeprè 2-3 mm nan longè. Yo te sispann bag yo nan chanm ògàn ki te ranpli avèk 10 mL solisyon KH a 37 degre epi yo te gaze ak 95 pousan O2–5 pousan CO2 [8], epi yo te mezire tansyon izometrik lè l sèvi avèk yon transducteur fòs (JH-2, Space Medico). -Enstiti Jeni, Beijing, Lachin)

Evalyasyon aktivite bag veso ak evalyasyon fonksyon andothelial

Bag veso yo te pèmèt yo ekilibre pou 2 èdtan anba yon tansyon fondamantal nan 400 mg, pandan tan sa a solisyon an KH te chanje chak 15 min; Lè sa a, 1 μmol / L nan NE te ajoute nan chanm lan pou evalye aktivite a nan chak bag pa detekte pousantaj kontraksyon. Anvan ak apre pwotokòl eksperimantal la, yo te mezire pousantaj kontraksyon (Figi 2A ak 2B). Endothelium te retire nan kèk bag pa dousman fwote sifas entim la ak yon fil asye amann, epi entegrite a te evalye kalitatif pa degre nan detant ki te koze pa ACh (10 μmol / L) nan pousantaj la nan ton kontraksyon pwovoke pa NE (1). μmol/L). Si detant la ak ACh te pi gran pase 80 pousan, andotelyòm nan rete nan bon kondisyon; si detant la te mwens pase 30 pousan, andotelyo a te detwi (Figi 2A ak 2B) [9].

Izolasyon ak kilti rat PASMCs

Distal atè poumon yo te izole nan lòb poumon nan rat, epi andotelyo a ak adventitia yo te retire ak anpil atansyon. Apre tisi yo te mens an moso {{0}}mm, yo te ajoute nan flakon yo imedyatman, yo te kenbe yo nan 37 degre ak 5 pousan CO2 nan yon enkibatè imidite pou apeprè kat èdtan, epi yo te kiltive yo ak DMEM ki gen anpil glikoz. konplete ak 20 pousan FBS, 100 U/mL penisilin, ak 100 U/mL strèptomisin pou apeprè senk jou. Mwatye nan medya kilti yo te ranplase ak medya fre lè selil yo parèt. Lè selil yo te rive nan 80 pousan konfluans, yo te rekòlte ak 0.125 pousan tripsin epi yo te simen nan flakon yo (rapò 1:2) ki gen DMEM ki gen anpil glikoz ki te konplete ak 10 pousan FBS, 100 U/mL penisilin, ak 100 U/mL streptomycin. . Selil ki gen twa a uit pasaj yo te itilize pou tout eksperyans.

Idantifikasyon PASMCs pa imunohistochimi

PASMC yo te pozitif pou tach imunochimik lè yo te obsève karakteristik tipik "ti mòn ak fon". Selil yo te simen nan 6-plak byen ak kouvèti vè. Lè selil yo te rive nan 80 pousan konfluans, yo te fiks nan 4 pousan paraformaldehyde, bloke ak 3 pousan oksijene idwojèn pou 15 min, ak Lè sa a, enkube ak sourit anti-rat prensipal -SMA antikò lannwit lan nan 4 degre. Apre yo te lave twa fwa nan PBS pou 10 min, selil yo te enkube ak antikò bouk anti-sourit segondè nan tanperati chanm pou 45 min, yo te lave ankò twa fwa nan PBS pou 10 minit, epi visualized ak diaminobenzidine.

Deteksyon konsantrasyon kalsyòm intraselilè nan PASMC rat yo

Yo te simen PASMC yo nan {{0}}plak byen ak kouvèti vè. Lè selil yo te rive nan 80 pousan konfluyans, medya kilti yo te ranplase ak DMEM san serom. Vennkat èdtan apre, selil yo te chaje ak 7 μmol/L Fluo 4-AM nan 37 degre pou 30 minit nan yon atmosfè imidite 5 pousan CO2. Yo te lave koloran rezidyèl la ak solisyon Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ki gen sa ki annapre yo (an mmol/L): 1.26 CaCl2, 0.49 MgCl2·6H2O, 0.41 MgSO4·7H2O, 5.33 KCl, 0.44 KH2PO4, 4.17 NaHCO3, 137.93 NaCl, 0.34 Na2HPO4, ak 5.56 D-Glucose, ki pa gen okenn fenol wouj. Selil ki chaje ak Fluo 4-AM yo te ekspoze a youn nan twa kondisyon tretman: (1) gwoup kontwòl la (gwoup kon), kote selil yo te enkube ak DMEM san serom; (2) gwoup NE a, kote selil yo te enkube ak DMEM san serom ki te konplete ak 1 μmol/L NE pou 10 min; ak (3) gwoup NE plis ECH (100 μmol/L) (NE plis gwoup ECH100), kote selil yo te enkube ak DMEM san serom ki te konplete ak 1 μmol/L NE pou 10 min ak 100 μmol/L ECH. pou 20 min. Entansite fliyoresans te obsève ak foto pa mikwoskospi fluoresans (IX71, Olympus, Tokyo, Japon) [11]. Sis jaden vizyon (200 ×) yo te kolekte pou chak echantiyon. Konsantrasyon kalsyòm entraselilè te mezire lè w mezire entansite fliyoresans mwayen ak lojisyèl Image Pro-Plus 6.0.

Analiz estatistik

Done yo te eksprime kòm mwayen ± SD. Lè yo te evalye yon diferans ki apwopriye ak siyifikatif pa tès Dunnett oswa tès Student-Newman-Keuls pou konparezon miltip apre yon sèl-fason analiz divèjans (ANOVA). Yon nivo pwobabilite P<0.05 was="" considered="">

Rezilta Efè vasorelaxant nan ECH sou izole atè poumon

Nan kòmansman eksperyans lan, adisyon kimilatif ECH soti nan 30 a 300 μmol / L pa te gen okenn efè enpòtan sou tansyon fondamantal nan atè a poumon. Apre vasoconstriction NE-induit la rive nan yon plato, ECH te ajoute kimilatif (30-300 μmol / L) nan andotelyo a entak (E plis, Figi 2C) oswa bag endothelium-denuded (E-, Figi 2C). Nan bag andotelyòm entak, adisyon kimilatif ECH te dilate veso yo nan yon fason ki depann de konsantrasyon, ak yon maksimòm.

pousantaj detant maman nan 89.22 pousan ± 0.32 pousan nan 300 μmol / L ak yon EC50 nan 51.60±0.57 μmol / L (Figi 2A ak 2C). Menm jan an tou, nan bag endothelium-denuded, ECH tou dilate veso yo nan yon fason konsantrasyon depann, men ak yon repons maksimòm siyifikativman pi ba nan 67.72 pousan ± 1.69 pousan (P).<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Efè ECH sou lage kalsyòm entraselilè ak aflu kalsyòm ekstraselilè

Bag endothelium-denuded yo te ekspoze a 1 μmol / L nan NE jiskaske kontraksyon maksimòm lan te rive. Anba kondisyon ekstraselilè Ca2 plis -gratis, bag yo te ekilibre nan solisyon Ca2 plis -gratis KH ki gen 0.2 mmol/L EGTA anvan inisyasyon eksperyans yo. Apre twa lave ak solisyon Ca2 plis - ak EGTA-gratis KH, bag yo te pre-enkube ak ECH (30, 100, ak 300 μmol / L) pou 20 min ak Lè sa a, re-ekspoze a 1 μmol / L nan NE. Bag yo pwodui

kontraksyon san soutni ki rapidman retounen nan debaz, konpare ak kontraksyon inisyal yo pwovoke pa NE, ki te sèvi kòm referans. Kontraksyon maksimòm kontwòl la te 33.27 pousan ± 2.94 pousan (Figi 3A ak 3E) men li te siyifikativman redwi a 24.54 pousan ± 2.97 pousan ak 10.60 pousan ± 2.07 pousan nan bag pretrete ak 100 ak 300 μmol / L nan ECH, respektivman (P).<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Wòl diferan inhibiteurs nan ECH-induit rat poumon vazorelaxation atè

ECH-induit rat pulmonè vazorelaxasyon atè yo te envestige nan prezans oswa absans inhibiteur sa yo: L-NAME (eNOS inhibitor), IMT (cyclooxygenase inhibitor), TEA (gwo-konduktans Ca2 plis -aktive K plis inibitè chanèl), BaCl2 ( anndan redresman K plis inibitè chanèl), 4-AP (K depandan vòltaj plis inibitè chanèl), ak Gli (ATP-sansib K plis inibitè chanèl). Bag yo te maksimòm kontrakte ak 1 μmol / L nan NE, ak Lè sa a, L-NAME (100 μmol / L), IMT (10 μmol / L), TEA (1 mmol / L) , BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L), oswa Gli (10 μmol/L) yo te ajoute, respektivman. Yon fwa yo te rive jwenn yon nouvo plato, ECH te ajoute nan yon fason kimilatif soti nan 30 a 300 μmol / L. Koub konsantrasyon-repons yo nan prezans inibitè diferan yo montre nan Figi 4. Efè vasorelaxant ECH sou bag atè poumon ki te kontrakte ak 1 μmol / L nan NE te siyifikativman bloke pa L-NAME (100 μmol / L), TEA ( 1 mmol/L), ak BaCl2 (1 mmol/L), ak detant maksimòm 64.41 pousan ±3.20 pousan, 84.38 pousan ±0.70 pousan, ak 75.27 pousan ±0.93 pousan, respektivman (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Idantifikasyon PASMC rat

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 pousan) (Figi 6A). Myofilaments tache mawon yo te obsève klèman nan sitoplasm nan gwo agrandisman (Figi 6B).

Cistancheechinacosideka rezisteapoptoz

Efè ECH sou konsantrasyon kalsyòm entraselilè nan PASMC rat

NE (1 μmol/L) siyifikativman ogmante konsantrasyon kalsyòm intraselilè (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">