Pati 1: Echinacoside Inhibit Glutamate Liberasyon Pa Siprime Voltage-Depandan Ca2 plis Antre ak Pwoteyin Kinase C nan Tèminal Nè Cerebrocortical rat.
Mar 05, 2022
Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 ak Su Jane Wang 3,*
Résumé:
Sistèm glutamatergic la ka patisipe nan efè terapi neuroprotectant.Echinacoside, yon glikozid phenylethanoid extrait nan zèb medsin Chinwa aHerba Cistanche, gen efè neuroprotective. Etid sa a te envestige efèechinacosidesou 4-aminopyridine-evoke glutamate lage nan tèminal nè serebrocortical rat (synaptosomes). Echinacoside inibit Ca2 plis -depandan, men se pa Ca2 plis -endepandan, 4-aminopyridine-evoke lage glutamate nan yon fason ki depann de konsantrasyon. Echinacoside te redwi tou ogmantasyon 4-aminopyridine-evoke nan cytoplasmic lib Ca2 plis konsantrasyon men li pa t chanje potansyèl manbràn sinaptozomal la. Efè inhibition echinacoside sou 4-aminopyridine-evoke glutamate lage te anpeche pa o-conotoxin MVIIC, yon bloke lajè spectre nan Cav2.2 (N-tip) ak Cav2.1 (P / Q-tip) chanèl. , men li te ensansib nan entraselilè Ca2 plis lage-enibitè dantrolèn ak 7-kloro-5-({2-chlorofenil)-1,5-dihydro-4 ,1-benzodyazepin-2(3H)-yon sèl (CGP37157). Anplis de sa, echinacoside diminye 4-fosforilasyon aminopyridine-pwovoke nan pwoteyin kinaz C, ak inibitè pwoteyin kinaz C aboli efè a nan echinakozid sou liberasyon glutamate. Dapre rezilta sa yo, nou sijere ke efè inhibition nan echinacoside sou evoke glutamate lage ki asosye ak redwi vòltaj-depandan Ca2 plis antre ak repwesyon ki vin apre nan aktivite pwoteyin kinaz C.
Mo kle:echinakozid; lage glutamat; tèminal nè serebral; vòltaj-depandan Ca2 plis chanèl; pwoteyin kinaz C
1. Entwodiksyon
Echinacosidese yon gwo phenylethanoid glycoside prezan nanHerbaCistanche, yon medikaman tradisyonèl Chinwa ki byen koni yo itilize pou trete bliye, enpotans, ak konstipasyon kwonik [1].Echinacosideposede divès kalite byoaktivite tankou antioksidasyon, anti-enflamasyon, antikansè, epatopwoteksyon, ak modulasyon iminitè [2-4]. Miyò, echinacoside gen efè neuroprotective; pou egzanp, li ka pwoteje kont estrès oksidatif oswa neurotoxin-induit neurotoksisite nan prensipal newòn kortik rat, selil neuroblastom SH-SY5Y imen, ak selil feochromocytoma (PC12) [5-8]. Anplis de sa, echinacoside diminye domaj nan sèvo ak amelyore fonksyon mantal nan modèl bèt nan maladi Parkinson la, maladi alzayme a, ak oklizyon atè serebral presegondè [9-12]. Sepandan, mekanis nan kiechinacosidepwovoke neropwoteksyon pa konplètman konprann.
Neuroprotection se yon pwosesis konplèks nan prezève estrikti newòn ak fonksyon sou joure toksik. Rediksyon eksitotoksisite glutamat konsidere kòm yon mekanis potansyèl ki enplike nan neuroprotection nan sèvo. Glutamate, yon neurotransmeteur eksitatè asid amine, gen yon wòl enpòtan nan plizyè fonksyon sèvo [13]. Sepandan, overactivation nan reseptè glutamate anba gwo konsantrasyon glutamate lakòz entraselilè Ca2 plis surcharge, malfonksyònman mitokondriyo, pwodiksyon radikal gratis, ak lanmò newòn [14,15]. Pwosesis patolojik sa a enplike nan anpil maladi nan sèvo ki gen ladan iskemi serebral, blesi twomatik nan sèvo, epilepsi, ak maladi neurodegenerative [16,17]. Pakonsekan, inibitè ki bloke transmisyon fizyolojik glutamatergic yo konsidere kòm potansyèl dwòg neropwotektif. Egzanp remakab sa yo se antagonist reseptè glutamat [18,19]; sepandan, esè klinik pou dwòg sa yo echwe akòz mwens efikasite ak efè segondè endezirab, oswa menm cytotoxik [20,21]. Anplis blokaj dirèk reseptè glutamate, anpèchman lage glutamate ka yon estrateji efikas pou neropwoteksyon. Plizyè neuroprotectants (eg, memantine ak riluzole) kapab redwi liberasyon glutamate nan tisi sèvo rat [22-24].
Lè nou konsidere wòl glutamate nan eksitotoksisite ak pwofil neropwotektif echinakozid la, etid prezan an te itilize tèminal nè izole (synaptosomes) ki pirifye nan kòtèks serebral rat la pou mennen ankèt sou efè echinakozid sou liberasyon glutamat ak plis eksplore mekanis potansyèl yo. Preparasyon tèminal nè izole a se yon modèl ki byen etabli pou etidye règleman presinaptik liberasyon nerotransmeteur pa dwòg nan absans nenpòt efè post-sinaptik [25]. Lè nou itilize modèl sa a, nou evalye efè echinacoside sou lage glutamat, potansyèl manbràn, presinaptik Ca2 plis aflu, ak aktivite pwoteyin kinaz C. Dapre revizyon nou an nan literati a, sa a se premye rapò ki dokimante mekanis nan ki echinacoside inibit liberasyon glutamate andojèn nan nivo presinaptik.
2. Rezilta yo
2.1. EchinacosideAnpeche 4-Aminopyridine-Evoke Glutamate Liberasyon soti nan Tèminal nè Serebrocortical Rat nan Redui Vesicular Exocytosis
Figi 1 montre efè echinakozid ki depann de konsantrasyon sou liberasyon glutamat 4-aminopyridine-evoke nan sinaptosom serebrokortik rat pirifye. Nan sinaptozom enkubasyon ak 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopiridin evoke yon lage glutamat nan 7.4 ± {{1{{20}}}}.1 nmol/mg/5 min, ki te redwi. pa 1, 5, 10, 30, ak 50 uM echinacoside a 6.5 ± 0.2, 5.8 ± 0.3, 4.8 ± 0.2,
4.1 ± 0.1, oswa 2.3 ± 0.4 nmol/mg/5 min, respektivman (F(5,24)=67.1, p=0. 000). Valè IC50 pou anpèchman echinacoside-medyatè nan 4-aminopyridine-evoke glutamate lage, ki sòti nan yon koub dòz-repons, te 24 uM. Anplis, lage glutamat la evoke pa 1 mM 4-aminopiridin nan yon solisyon ekstraselilè Ca2 plis -gratis ki gen 300 uM etilèn glikol bis (-aminoetil etè)-N,N,N/,N/-asid tetraacetic (EGTA) te 2.1 0.2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000),
ak eleman Ca2 plis-endepandan sa a nan 4-aminopyridine-evoke glutamate lage pa te afekte pa 20 uM echinacoside (1.8 ± 0.2 nmol/mg/5 min; p {{1) 0}}.58; Figi 1). Nan sinaptosom ki te trete ak 0.1 uM bafilomycin A1, yon inibitè transporteur vesikulèr [26], 4-aminopyridine-evoke lage glutamat te redwi siyifikativman (2.2 ± 0.2 nmol/mg/). 5 min; F (2,12)=249.518, p=0.000). Nan prezans bafilomycin A1, 20 uM echinacoside echwe pou pou anpeche siyifikativman liberasyon glutamate (2.1 ± 0.2 nmol/mg/5 min; p=0.94; Figi 1). Kontrèman, 10 uM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA, yon inibitè repaksyon glutamate) [27], ogmante 4-aminopyridine-evoke glutamate lage a 11.8 ± 0.4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, p=0.000). Menm nan prezans DL-TBOA, 20 uM echinacoside inibit 4-aminopyridine-evoke lage glutamate siyifikativman (7.7 ± 0.2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.000; Figi 1).
2.2 Echinacoside Redwi Cytosolic Ca2 plis konsantrasyon men li pa chanje potansyèl manbràn sinaptozomal la.
Depolarizasyon sinaptozom ki te koze pa 1 mM 4-aminopiridin ogmante Ca2 plis konsantrasyon (p=0.000; Tablo 1). Aplikasyon an nan 20 uM echinacoside pa t 'siyifikativman afekte Ca2 fondamantal plis konsantrasyon (t(8)=0.06, p=0.95) men siyifikativman redwi 4-aminopyridine-induit ogmantasyon nan Ca2 plis konsantrasyon (t(10)=6.16, p=0.000). Anplis de sa, 1 mM 4-aminopiridin ogmante nan 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide [DiSC3(5)] fliyoresans (p=0.000). Anplis de sa 20 uM echinacoside pa t chanje potansyèl manbràn repo a (t(8)=0.976, p=0.36) oswa siyifikativman chanje 4-aminopyridine-medyatè ogmantasyon nan DiSC3. (5) fliyoresans (t(8)=-0.014, p=0.99; Tablo 1).
2.3 Redwi Ca2 plis Enflux atravè chanèl Cav2.2 (N-Type) ak Cav2.1 (P/Q-Type) yo ka asosye ak anpèchman 4-Aminopiridin-Evoke Glutamate Liberasyon pa Echinacoside.
Figi 2 montre ke 2 uM o-conotoxin MVIIC, yon N- ak P/Q-tip Ca2 plis bloke kanal, redwi 4-aminopyridine-evoke glutamate lage soti nan 7.4 ± {{10}}. 2 a 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 min (t(9)=25.35, p=0.000). Nan prezans o-conotoxin MVIIC, efè 20 uM echinakozid sou 4-aminopyridine-evoke glutamate lage pa te siyifikatif (1.8 2 ± plis 0.2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06,p=0.32). Dantrolene (10 uM), yon inibitè nan lage entraselilè Ca nan andoplasmik la
retikul [28], redwi 4-aminopiridin-evoke lage glutamat (5.6 ± 0.3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, p=0.000). Sepandan, nan prezans dantrolèn, 20 uM echinakozid te kapab toujou anpeche lage glutamate siyifikativman (3.3 ± 0.2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Rezilta menm jan an te obsève lè l sèvi avèk 100 uM 7-kloro-5-({2-klowofeni){-1,5-dihydro-4,1-benzotiazepin -2(3H)-one (CGP37157), yon bloke manbràn pèmeyab nan mitokondriyo Na plis /Ca2 plis echanj. Nan senk preparasyon sinaptozomal yo te egzamine, 20 uM echinakozid konbine avèk 100 uM CGP37157 te redwi 4-aminopyridine-evoke glutamate lage pa 48.3 pousan ± 5.2 pousan (F(2,13) = 136.79, p {{{ 49}}.000), menm jan ak anpèchman pa echinacoside pou kont li (46.2 pousan ± 2.3 pousan; p=0.89; Figi 2).
2.4 EchinacosideAnpeche 4-Aminopyridine-Evoke Glutamate Liberasyon pa siyal atravè Protein Kinase C
Jan sa montre nan Figi 3, 10 uM 2-[1-({3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimid (GF109203X), yon inibitè jeneral pwoteyin kinaz C [29], redwi 4-aminopyridine-evoke glutamate lage (F(2,13) = 19.46, p=0.{{17} }}). Nan GF109203X-trete sinaptosomes yo, 20 uM echinacoside redwi 4-aminopyridine-evoke glutamate lage pa sèlman 5.5 pousan ± 1.8 pousan (p=0.89), mwens pase sa pa echinacoside pou kont li (42.4 pousan ± 2.3). pousan ; p=0.000). Rezilta menm jan an te jwenn ak 5,6,7,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3 ,4-c]karbazòl-12-propanenitrile (Go6976), yon selektif pou Ca2 plis -depandan pwoteyin kinaz C izoform (, I, II, y) [29]. Nan prezans 3 uM Go6976, 20 uM echinacoside redwi liberasyon glutamat pa 11.9 pousan ± 2.9 pousan (p=0.59), ki vle di yon rediksyon enpòtan konpare ak sa ki pa echinacoside pou kont li (42.4 pousan 2.3 pousan ; p {{{ 65}}.000; Figi 3). Kontrèman, 3 uM rottlerin, yon inibitè C6 pwoteyin kinaz kinaz Ca2 plis endepandan [30], pa t chanje siyifikativman 4-aminopiridin (1mM)-evoke lage glutamat (p=0.45). Men, nan prezans rotttlerin, 20 uM echinacoside efektivman lakòz yon anpèchman mwayèn nan 37.1 pousan ± 5.6 pousan nan liberasyon an (F(2,13) = 19.72, p=0.{{88 }}), menm jan ak sa pa echinacoside pou kont li (p=0.41; Figi 3). Anplis de sa, inibitè pwoteyin kinaz mitogen aktive 2-(2-amino-3-metoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-yon sèl) (PD98059) ) (50 uM) ak pwoteyin kinaz A inibitè N-[{2-(p-bromocinnamylamino)etil]{-5-isoquinolinesulfonamid (H89) (100 uM) redwi 4-aminopiridin-evoke glutamat lage (p=0.000). Menm nan prezans PD98059 oswa H89, 20 uM echinacoside efektivman redwi liberasyon an (F(2,13) = 52.3, p=0.000; Figi 3).
Figi 4 montre ke 1 mM 4-aminopyridine ogmante fosforilasyon pwoteyin kinaz C nan sinaptosomes (t(4)=-6.871, p=0.002). Lè synaptosomes yo te pretrete ak 20 uM echinacoside pou 10 minit anvan adisyon nan 4-aminopiridin, 4- aminopiridin pwovoke fosforilasyon nan pwoteyin kinaz C konsiderableman diminye (F (2,6)=29.202 , p=0.001).
2.5 Anpèchman echinakozid nan lage glutamat pa enplike yon reseptè asid Gamma-Aminobutyric Kalite A (GABAA)
Nan Figi 5, efè echinacoside sou 4-aminopyridine-evoke glutamate lage nan absans oswa prezans SR95531 (yon antagonist nan reseptè GABAA a) te konpare. Anplis de sa, 100 uM SR95531 pa t 'siyifikativman chanje 4-aminopiridin (1mM)-evoke lage glutamat. Nan sinaptozom SR95531-trete yo, aplikasyon 20 uM echinacoside te lakòz yon anpèchman 43 pousan sou 4-aminopyridine-evoke glutamate lage (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), ki pa t 'siyifikativman diferan de anpèchman ki te pwodwi pa echinacoside pou kont li (40 pousan; p=0.000). Yon rezilta menm jan an te jwenn ak yon lòt antagonist reseptè GABAA, bicuculline (50 uM). Liberasyon ki te mezire nan prezans bicuculline ak echinacoside te siyifikativman diferan de sa yo te jwenn nan prezans bicuculline pou kont li (p=0.000).
3. Diskisyon
Nan etid sa a,echinacoside, yon konpoze aktif nan HerbaCistanche, anpeche 4-aminopyridine-evoke lage glutamat nan tèminal yo nè kòtèks serebral rat. Mekanis ki kache posib pou laechinacoside-medyatè anpèchman lage glutamate yo plis envestige ak diskite isit la.
3.1 Mekanis ki kache nan anpèchman echinakozid lage glutamat
Liberasyon glutamat evoke pa 4-aminopyridine gen ladann de eleman: yon eleman fizyolojik ki enpòtan Ca2 plis -depandan, ki pwodui nan ekzositoz nan vesik sinaptik ki gen glutamate; ak yon eleman Ca2 plis-endepandan, ki soti nan depolarizasyon pwolonje ki lakòz yon chanjman manbràn potansyèl-medyatè nan eta a fiks transpò glutamate nan direksyon deyò, kidonk afekte eflu cytosol glutamate [31]. Isit la, nou te obsève ke echinacoside pa t 'siyifikativman anpéché 4-aminopyridine-evoke glutamate lage nan prezans nan yon mwayen Ca2 plis -gratis (Ca2 plis -liberasyon endepandan). Anplis de sa, bafilomycin A1 (ki diminye kontni glutamat nan vesik sinaptik), men se pa DL-TBOA (ki anpeche tout asid amine eksitatè) yon fason ki pa selektif. soustip transpòtè). Rezilta sa yo sijere ke echinacoside afekte exocytosis Ca2 plus-depandan nan liberasyon glutamate san yo pa afekte Ca2 plis-endepandan cytosolic eflux nan glutamate nan ranvèse nan tèminal nève transpò glutamate manbràn plasma. Nan tèminal sinaptik, Na plis anpèchman chanèl oswa K plis deklanchman chanèl estabilize eksibilite manbràn epi kidonk redwi antre evoke Ca2 plis ak lage nerotransmeteur [32,33]. Se poutèt sa, mekanis potansyèl ki kache nan echinacoside-medyatè anpèchman lage glutamate enplike nan yon rediksyon nan eksibilite sinaptozomal. Sepandan, posibilite sa a se enposib sou baz de obsèvasyon: (1) 4-aminopyridine-evoke manbràn potansyèl depolarization, mezire ak manbràn potansyèl lank sansib DiSC3 (5) pa te afekte pa adisyon a nan echinacoside; epi(2) echinakozid pa t afekte 4-aminopyridine-evoke Ca2 plis -endepandan glutamate lage, yon eleman nan liberasyon ki depann sèlman de potansyèl manbràn [31]. Si efè a pa koze pa repwesyon eksitasyon sinaptozomal, li ka manifeste atravè yon rediksyon nan aktivite Cav2.2 (N-tip) ak Cav2.1 (P/Q-tip) Ca2 plis chanèl makonnen ak exocytosis glutamate nan la. tèminal nè yo [34-36]. Lè nou itilize fura-2, nou demontre ke echinakozid redwi siyifikativman ogmantasyon 4-aminopiridin evoke nan Ca2 plis konsantrasyon. Anplis de sa, done nou yo montre ke efè inhibition echinacoside sou 4-aminopyridine-evoke glutamate lage diminye soti nan 42.4 pousan 2.3 pousan nan 12.1 pousan 3.9 pousan apre ekspoze a yon blocker nan Cav2.2 (N-tip) ak Cav2. .1 (P/Q-tip) Ca2 plis chanèl. Anplis de sa, nou te obsève ke echinacoside te kontinye siyifikativman anpéché 4-aminopyridine-evoke glutamate lage nan prezans entraselilè Ca2 plis inibitè lage. Rezilta sa yo endike ke represyon an similtane nan Cav2.2 (N-tip) ak Cav2.1 (P / Q-tip) Ca2 plis aktivite chanèl se potansyèlman mekanis ki kache anpèchman echinacoside-medyatè glutamate lage. Sepandan, aktivasyon konbine Cav2.2 (N-tip) ak Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 plis aktivite chanèl pa t 'kapab bloke aksyon an nan echinacoside nèt. Pakonsekan, lòt kalite chanèl Ca2 plis ki pa idantifye oswa lòt wout presinaptik ka patisipe nan anpèchman an. Pou egzanp, reseptè GABAA yo prezan nan nivo presinaptik, epi yo te montre deklanchman yo anpéché Ca2 plis aflu ak glutamate lage [37]. Nan etid la prezan, antagonist reseptè GABAA SR95531 ak bicuculline pa t 'bloke anpèchman echinacoside-medyatè nan lage glutamate, sijere ke reseptè GABAA yo pa patisipe nan rediksyon nan vòltaj-depandan Ca2 plis aktivite chanèl ak nan anpèchman ki vin apre nan lage glutamate. Ca2 plis antre atravè chanèl Ca2 plis depandan vòltaj aktive plizyè pwoteyin kinaz ki asosye ak lage glutamat nan tèminal nè ki gen ladan mitogen-aktive pwoteyin kinaz, pwoteyin kinaz C, ak pwoteyin kinaz A. Isit la, nou demontre ke inibitè pwoteyin kinaz C efikasman antagonize echinacoside la. -medyatè anpèchman lage glutamate; men, mitogen-aktive pwoteyin kinaz inhibitor PD98059 la oswa pwoteyin kinaz A inibitè H89 la te efikas. Anplis de sa, 4-fosforilasyon pwoteyin kinaz C ki te pwovoke aminopiridin te diminye nan sinaptosom apre tretman anvan ak echinakozid nan yon konsantrasyon efikas pou anpeche liberasyon glutamat. Se poutèt sa, chemen an siyal nan echinacoside-medyatè anpèchman lage glutamate a ka enplike pwoteyin kinaz C. Pwoteyin kinaz C se yon sistèm siyal enpòtan entraselilè ki prezan nan nivo presinaptik e li gen yon wòl enpòtan nan èzositoz nerotransmeteur. Pou egzanp, plizyè pwoteyin sinaptik ki enplike nan trafik vesik sinaptik oswa rekritman ak exocytosis, tankou myristoylated alanine ki rich C kinase substrate, yo fosforile pa pwoteyin kinaz C [38,39]. Pwosesis fosforilasyon sa a ka ogmante pa depolarizasyon-stimile Ca2 plis antre, ki fasilite lage glutamate [40]. Pakonsekan, nou ka rezonab espekile ke efè inhibition nan echinacoside sou Ca2 plis antre obsève isit la ka diminye aktivite pwoteyin kinaz C ak kidonk lage glutamate.
