Pati 1 | Herba Cistanche Ekstrè amelyore Mitochondrial ATP Jenerasyon ATP nan kè rat ak H9c2 selil yo

Kontak: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung ak Kam Ming Ko

Depatman Byochimik, Hong Kong Inivèsite Syans ak Teknoloji, Klè Dlo Bay, Hong Kong SAR, Lachin

Mo kle: ATP,Cistanche deserticola: selil H9c2, kè, mitokondri

Abstrè

Pou mennen ankèt sou baz famasi a ".Yang- envite" aksyon èrbal Cistanche [tout plant la sèkCistanche deserticolaY.C. Ma (Orobanchaceae)], nan medikaman Chinwa, efè yo nan ekstrè a methanol nan Herba Cistanche sou kapasite jenerasyon ATP mitokondrial ATP yo te egzamine lè l sèvi avèk yon modèl kè ekstrè vid ak yon nan situ H9c2 selil. Tretman ak Herba Cistanche ekstrè ogmante kapasite mitokondrial ATP mitokondal ATP nan yon fason dòz-depandan nan rat, evalye pa nan mezi vitro. Eksitasyon kapasite jenerasyon ATP te asosye ak yon amelyorasyon paralèl nan transpò elektwonik mitokondrial sipòte pa pirifye men se pa siksè. Tretman Herba Cistanche tou ogmante konplèks mitokondrial myocardial I ak konplèks III ak aktivite III, ak limit la nan eksitasyon sou aktivite konplèks mwen ke yo te pi gwo. Tretman Herba Cistanche pwodui yon dòz- ak tan-depandan ogmantasyon nan kapasite jenerasyon MItokondrial ATP nan selil H9c2. Rezilta yo endike ke tretman Herba Cistanche kapabogmante jenerasyon ATPnan kè rat eksepsyonèl ak H9c2 selil nan sitiyasyon, petèt nanamelyore fosfò oksidantif.

Cistanche ka amelyore fonksyon kè, desann tansyon an, epi desann lipid san

Entodiksyon

"Envigorasyon Yang," ki anboche amelyorasyon an jeneralize nan fonksyon kò nan medikaman Chinwa, ki enplike itilizasyon enèji nan kondwi divès kalite pwosesis byochimik.

Nan sans sa a, ATP, ki se lajan inivèsèl nan enèji nan fonksyon gaz selilè, se sitou pwodwi nan fosfò oksidantal nan mitodondria. Nou te postila ke "Yang envite" remèd fèyposse kapasite nan ogmante kapasite mitokondrial ATP(Ko et al., 2004). Sa a se sipòte pa resan nou an ke "Yang- envite" men se pa "Yin-nouri" Chinwa tonbe zèb te kapab amelyore kapasite jenerasyon myocardial ATP nan kè sourit (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, plant la sèk parazit (eskli flè a) nan Cistanche deserticola Y.C. Ma (Orobanchaceae), se klase kòm yon'Yang-envite zèb nan medikaman tradisyonèl Chinwa (Chen, 1998), epi li parèt tankou engredyan ki pi popilè nan yon kantite rive Chinwa pou mulations yo itilize pou envigorasyon Yang-envigorasyon '. Nan Lachin ak Japon, Herba Cistanche se lajman itilize pou tretman an nan yon lame nan sentòm defisyans Yang. Etid famasi endike ke Herba Cistanche te kapabechap radikal gratis(Xiong et al., 1996),pwodui sedatif(Lu, 1998),anti(Lee et al., 1990),efè anti-enflamatwa(Lin et al., 2002), akfonksyon iminite amelyorasyon(Wu et al., 2005). Engredyan prensipal aktif nan Herba Cistanche sejès nan kanalizasyon(Ouyang et al., 2003), ki te jwenn yo teanti-bakteri, antiretistres, ak antioksidanpwopriyete (Xiong et al., 1998), osi byen ke efè anti-apoptotik sou ewonn kiltirèl (Tianan & Pu, 2005). Nan etid aktyèl la, yo nan lòd yo mennen ankèt sou baz famasi a nan Yang-envite aksyon nan Herba Cistanche, efè yo nan tretman Herba Cistanche sou kapasite jenerasyon ATP nan mitokondri izole soti nan kè rat ekspoze ak kiltirèl H9c2 kadyolojik nan sitiyasyon yo te egzamine. Pou eksplore mekanis byochimik la kache jenerasyon ATP a - amelyore aksyon, efè yo nan tretman Herba Cistanche sou transpò elektwonik elektwonik ak konplèks I–IV yo te egzamine tou nan kè rat.

Engredyan yo efikas nan Cistanche ka gaye divès kalite oksijèn aktif gratis radikal

Materyèl ak metòd

Pwodwi chimik, kilti selil, ak materyèl èrbal

ATP, ADP, ak 3-[4,5-dimethylthiozol-2-2-2,5-5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) yo te achte nan Sigma Chimik Co. (Sen Lwi, MO, USA). Yo te jwenn solisyon Luciferase (ATPlite) nan PerkinElmer (Boston, MA, USA). Mwayen modifye Eagle a (DMEM) ak sewòm bovine fetis (FBS) yo te achte nan GIBCO BRL Lavi Teknoloji (Grand Island, NY, USA). H9c2 liy selil te achte nan ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche te apwovizyone pa yon dilè èrb lokal (Lee Hoong Kee). Zèb la te otantifye pa foto a, ak yon echantiyon koupon (HKUSTY00301) te depoze nan Depatman Byochimik, Hong Kong Inivèsite nan Syans ak Teknoloji (HKUST).

Fè ekstraksyon èrbal

Herba Cistanche (100g) te koupe an ti moso ak Lè sa a, ekstrè pa chofaj anba reflèks nan 300 mL methanol nan 65 ◦C pou 2 h. Pwosedi a te repete de fwa. Ekstrè a pisin te sèch pa evakye solvant lan anba presyon redwi, ak ekstrè a methanol nan Herba Cistanche te jwenn nan yon sede nan 39% (w / w). Analiz chimik endike ke methanol ekspozisyon an nan Herba Cistanche gen saponin total, flavonoid total, lignans total, ak polysaccharides nan konsantrasyon 1.62% (w / w), 0.08%, 0.15%, ak 75.6%, respektivman.

Swen bèt

Gason adilt Sprague-Dawley rat (8-10 semèn; 250-300g) yo te konsève anba yon 12-h sik / limyè nan yon chanm lè / imidite-kontwole nan apeprè 22◦C ak pèmèt manje ak dlo anons nan Fasilite Swen Bèt yo nan HKUST. Pwotokòl eksperimantal yo te apwouve pa Komite Rechèch Pratik nan HKUST.

Tretman dwòg

Bèt yo te divize an gwoup, ak senk a sis bèt nan chak. Nan gwoup tretman yo, rat yo te administre rat yo ak ekstrè methanol nan Herba Cistanche (fonn / sispann nan dlo) ogmante dòz chak jou (0.031–0.5 g/kg) pou 3 jou. Bèt kontwòl yo te resevwa dlo sèlman. Ven-kat èdtan apre dènye dòz la, kè a te jwenn soti nan fenomèn-anestezi ak sibi analiz byochimik.

Preparasyon nan fraksyon mitokondrial ak mezi nan kapasite jenerasyon ATP (ATP-GC) ansyen rete vivan

Kè kite echantiyon tisi ventrikilè yo te egziste ak rense ak glas-frèt tanpon istorik (0.32 M sikwoz, 1 mM EDTA, 50 mM Tris / HCL, pH 7.4). Fraksyon kadyak mitokondrial yo te prepare pa santrifugasyon diferansyal nan tanpon isotonik nan 4◦C. Yon 10% (w / v) kadyak omojèn te prepare pa omojèn tisi a minse ak yon omojèn Teflon-vè nan 4000 rpm pou 20-30 konplè konplè. Omojèn nan te santrifye nan 600 × g pou 10 min pou retire debri nikleyè ak selil. Supernatant la te Lè sa a, santrifye nan 8000 × g pou 30 minit sediman mitokondri a (Evan, 1992). Pellets yo te respekte nan 1 mL nan tanpon an isotonik ak rekonstwi fraksyon yo mitorik. Mitokondrial ATP-GC nan bèt ki pa trete te mezire pa metòd la nan Leung et al. (2005)

Polysaccharides ka retade dejenerasyon fizyolojik nan ògàn yo ak dejenerasyon an nan mòfoloji selil

Mezi transpò mitokondrial elektwonik

Mezi transpò elektwonik nan mitokondri izole, ki baze sou rediksyon an nan MTT, kòm pou chak [1]ki te fòme jan sa dekri pa Cohen et al. (1997). Mitochondria te prepare nan yon konsantrasyon pwoteyin nan 1 mg / mL ak yon tanpon enkubasyon (250 mM sikwoz, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4). Yon aliquot (40 μL) nan mitochondria a te melanje ak 100 μL chak nan 15 mM pyruvate oswa 0.5 mM siksesè ak 0.42 mg / mL MTT. Melanj reyaksyon an te inibé nan 37 ◦C pou 10 min ak tranbleman tè dou. Apre enkubasyon an, melanj lan reyaksyon te sispann pa adisyon a nan 100 μL lysis tanpon (10%, w / v, sodyòm dodecyl silfat, ak 45% dimethylformamide, ajiste nan pH 4.7 ak asid asid glasyal). Apre kanpe pou 5 min, lekti absòbe nan melanj lan reyaksyon yo te pran ak yon lektè plak mikwo-rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ak rapòte kòm diferans ki genyen ant 570 nm ak 630 nm. Done yo te eksprime kòm yon pousantaj nan valè a vle di nan kontwòl la (sètadi, Herba Cistanche-trete) gwoup.

Kilti selil

H9c2 selil, yon liy selil pèmanan sòti nan kadyak myoblasts (Hescheler et al., 1991), yo te kiltire kòm monolayers nan DMEM konplete ak 10% (v / v) FBS. Mwayen an gen glikoz (4.5 g / L) ak glutamine (4.5 mM), konplete ak NaHCO3 (17 mM), penisilin (100 IU / mL), ak streptomycin (100μg / mL). Tout selil yo te grandi anba yon atmosfè de 5% (v / v) CO2 nan lè nan 37 ◦C. Mwayen an te ranplase pa mwayen fre chak 2 oswa 3 jou. Yon stock nan selil yo te grandi nan yon 75 kilti kilti 75 ak fann anvan konfli nan yon rapò soustraksyon nan 1:10. Pou ATP-GC aza, selil H9c2 yo te grenn nan yon dansite de 2.5 × selil 104 / byen nan yon plak 24-byen. Apre atachman selil a, Herba Cistanche ekstrè (fonn nan saline fosfat-afebli; PBS) te aplike nan mwayen an, ak selil yo te enkoni pou ogmante peryòd (2-16 h) nan tan. Kontwòl (selil trete) yo te bay PBS la sèlman.

Mezi ATP-GC nan sitiyasyon

Apre peryòd endike nan enkubasyon ak Herba Cistanche ekstrè nan ogmante konsantrasyon (50-300 μg / mL), atravè ATP-GC a te fèt. Mwayen yo te trete ak selil yo ak chif (50 μg/ml) nan yon tanpon enkubasyon (120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0.1 mM MgCl2, 0.5% BSA, pH 7.4) pou 3 min nan 37 ◦C. Apre aspire digitonin, glutamate (5 mM), malate (5 mM), ak ADP (60 μM) te ajoute nan selil yo pou jenerasyon mitokondrial ATP, ki te kontwole nan ogmante entèval tan sòti nan 0 a 15 min. Reyaksyon an te sispann pa adisyon a nan 60 μL nan asiklorik (30%, w / v), ak melanj reyaksyon yo te lè sa a santrifye nan 600 × g pou 10 min nan 4◦C. Yon aliquot (120 μL) nan supernatant la te melanje ak 90 μL nan 1.4 M KHCO3 pou netralizasyon. Melanj yo te santrifye ankò nan 600 × g nan 4 ◦C, ak sipènatan yo te mezire pou kontni ATP kòm te dekri pi bonè. ATP-GC nan selil yo ki pa trete yo te estime pa kalkile zòn nan anba koub la nan graf la (AUC1) konplote ATP pwodwi (nmol / mg pwoteyin) kont (0-15 min) ak eksprime nan inite abitrè. Pou Herba Selil ki trete yo, valè AUC1 pou ogmante fwa incubation (3, 5, 7, 10, ak 15 min) te nòmalize nan yon valè kontwòl respektif nan echantiyon ki pa trete eksprime kòm kontwòl pousan. Lè sa a, zòn nan anba koub (AUC2) nan valè yo kontwòl pousan graf kont tan enkubasyon (3-15 min) te kalkile ak eksprime nan inite abitrè. Done nan Herba Cistanche–trete gwoup yo te eksprime kòm yon pousantaj nan kontwòl la soti nan ekwasyon an:

[AUC2(HerbaCistanche − trete)/AUC2(untreated)] ×100%

Mezi konplèks I–IV ak sentèz site Aktivite

Mitochondrial transpò elektwonik chèn transpò (ETC) konplèks I- Aktivite III yo te mezire pa metòd spectrophotometric lè l sèvi avèk substrats konplèks-espesifik (NADH pou konplèks Mwen, siksesè pou II konplèks II, ak decylubiquinol pou konplèks III) jan sa dekri (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al., 2005; Mak et al., 2001). Aktivite IV konplèks te mezire lè l sèvi avèk yon cytochrome cytochrome c oxidase twous soti nan Sigma. Mitochondrial site aktivite sentete te mezire pa metòd la Srere (1969).

Pwoteyin asasina

Pwoteyin konsantrasyon nan fraksyon mitodonal ak selil lysates yo te detèmine lè l sèvi avèk yon aza pwoteyin Biorad twous lè l sèvi avèk albumin sewòm bovine kòm estanda (0.038–0.600 mg/ml).

Analiz estatistik

Tout done yo te eksprime kòm vle di ± erè estanda nan vle di (SEM). Yo te analize pa yon fason pou yon sèl-fason pou divèjans (ANOVA). Post hoc konparezon miltip yo te fè ak LSD. Valè P valè<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Rezilta

Efè tretman Herba Cistanche sou myocardial mitokondrial ATP-GC nan rat

Jan yo montre nan Figi 1, tretman ak Herba Cistanche ekstrè nan dòz jiska 0.5 g / kg ogmante mitokondrial MYP-GC nan yon fason dòz-depandan nan rat, ak degre nan eksitasyon ke yo te 89% nan yon dòz 0.5 g / kg.

Efè tretman Herba Cistanche sou transpò elektwonik mitokondrial nan kè rat

Limit transpò elektwonik nan mitokondri izole te mezire pa siveyans rediksyon an nan MTT. substra itilize pou aza a te swa pirifye oswa siksè.

Figi 1.Efè tretman Herba Cistanche sou kapasite jenerasyon MItokondrial ATP nan kè rat eksepte vivan

Chak ba reprezante vle di ± SEM, ak n = 5. Bèt yo te oralman trete ak Herba Cistanche nan dòz la chak jou pou 3 jou. KApasite jenerasyon ATP te mezire jan sa dekri nan "Materyèl ak Metòd." Done yo te eksprime nan kontwòl pousan ki gen rapò ak valè (AUC2) nan gwoup la kontwòl respektif ki pa trete. ∗Significly diferan soti nan gwoup la kontwòl respektif san trete; siyifikativman diferan soti nan Herba Cistanche–trete gwoup la nan 0.5 g/kg.

Figi 2. Efè tretman Herba Cistanche sou transpò elektwonik mitokondrial nan kè rat

Chak ba reprezante vle di ± SEM, ak n = 5. (a) Pyruvate-sipòte (b) siksè sipòte transpò elektwonik mitokondrial te mezire pa rediksyon MTT, jan sa dekri nan "Materyèl ak metòd." Done yo te eksprime nan pousantaj la nan valè kontwòl san trete [pyruvate-sipòte: OD570nm− OD630nm = 0.0206 ± 0.0001 (SEM), n = 5; sipòte siksesè: gason, 0.255 ± 0.015, n = 5]. ∗Significly diferan de respektif la san trete gwoup kontwòl; yon siyifikativman diferan de 0.5 g / kg gwoup.

Jan sa montre nan Figi 2a, Herba Cistanche tretman dòz-depann sou limit la nan elektwonik mitodonal transpò ki sipòte pa pirifye nan kè rat, ak eksite a pi bon obsèvab nan dòz 0.5 g / kg. Sepandan, pa gen okenn chanjman enpòtan nan limit mitokondrial transpò elektwonik ki te sipòte pa siksesè yo te detekte nan Herba Cistanche–trete kè rat (Fig. 2b).

Pou Pati 2,klike la a.