Pati 2 Echinacoside ogmante kantite espèm nan rat pa vize reseptè androjèn ipotalamik la

KLIKE LA POU PATI 1

Pou plis enfòmasyon tanpri kontakte:Joanna.jia@wecistanche.com

Diskisyon

Dosye etnofarmakolojik ak etid anvan nou an13 konfime saCistanche tubulosaEkstrè efektivman ogmante nivo òmòn sèks ak amelyore kalite espèm.ECHkòm youn nan konpoze prensipal yo nanCistanche tubulosa19,20, ka ogmante kantite espèm ak ogmante sekresyon LH ak T (figi 1). Nan etid sa a, nou te demontre saECHte distribye nan ipotalamus la olye pou yo tèstikul yo sijere yon efè endirèk nan ECH sou tèstikul yo. Vreman vre, ECH dirèkteman anpeche aktivite ipotalamik AR, AR translokasyon nan nwayo a, ak HPG-aks ekspresyon jèn ki gen rapò ak tou bay pwoteksyon kont BPA-pwovoke domaj repwodiktif.

Nan etid sou pwodiksyon gonadotwofin imen, nivo òmòn sèks yo byen kontwole pa aks HPG ak yon bouk fidbak negatif21. Savwa, T sekresyon ogmante ansibleman an repons a ogmantasyon konsistan ak soutni nan nivo LH san an repons a yon mank de fidbak androjenik negatif nan pitwitè a ak ipotalamus. Nan etid sa a,ECHogmante sekresyon LH nan ansefal plis pitwitèr ak pwodiksyon testostewòn nan tèstikul ak nivo mRNA nan LHR ak Gnrhr nan ansefal plis pitwitèr (Fig. 1 ak Fig. 4), sijere keECHka afekte aks HPG fidbak negatif. Se pa etonan, AR tèt li jwe yon wòl enpòtan nan règleman fidbak nan nivo T ak LH22,23. Paradig aks HPG gason an santre sou testostewòn bay represyon negatif fidbak nan nivo tou de ipotalamus la ak glann pitwitè24,25. Etid anvan yo te itilize Foxg1-Cre pou elimine jèn ki enterese nan pitwitè a men pa ipotalamus la pou detèmine enpòtans relatif de rejyon yo. Rezilta yo te demontre ke siyal AR nan pitwitè sourit gason an se dispansab anrapò ak règleman ki depann de testostewòn nan sekresyon LH26. Pou rezon sa a, nou te chwazi konsantre sou AR ipotalamik pou plis etid.

Cistanche deserticola gen anpil efè, klike isit la pou konnen plis

Kòm yon reseptè òmòn nikleyè esteroyid, aktivite AR a reglemante pa ligand esteroyid T a, ki obligatwa nan ki inisye translokasyon nikleyè ak fonksyon regilasyon transkripsyon AR27 la. Nan etid sa a, nou te montre saECHtretman an anpeche AR translokasyon soti nan sitoplasm nan nan nwayo nan ipotalamus la, (figi 3). Anplis, etid PK a te montre saECHka penetre ansibleman nan ipotalamus la olye ke nan tèstikul yo, ki sijere ke plis ECH travèse Baryè San-Sèvo a, petèt atravè andositoz, olye ke Baryè Testis San an. Anplis de sa, nou demontre pa ELISA endirèk kapasite konbine nan ECH ak AR sijere ke ECH ka dirèkteman mare nan AR la. Sa a te plis sipòte pa rezilta nan molekil debakadè tès la ki endike ke sit obligatwa sitatif pou ECH egziste nan Met-894 ak Val-713 nan pòch la AR (Fig. 5D). Sa a sipòte konklizyon lòt moun ke AR patisipe nan règleman an nan yon bouk manje negatif e ke yon rediksyon nan entèraksyon AR-T nan sèvo a rezilta nan ogmante sekresyon LH23,28,29.

Steroidogenesis se yon pwosesis esansyèl kontwole byen sere pou devlopman spermatogenesis ak patisipasyon pwoteyin esteroyid (StAR)30 ak anzim esteroyid tankou CYP11A1, CYP17A1, 3 -hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3), ak 17 -hydroxysteroid. dehydrogenase (HSD17) ki konvèti kolestewòl nan testostewòn31. Nou te montre ke nivo yo mRNA nan jèn yo kode anzim sa yo siyifikativman ogmante akECHtretman tandiske ekspresyon StAR mRNA pa t chanje. Sa a sijere keECHpa te gen okenn efè sou transfè kolestewòl nan manbràn enteryè mitokondri a, tandiske li ka jwe yon wòl nan pwomosyon konvèsyon kolestewòl nan testostewòn. Lè sa a, konklizyon an ka trase saECHtretman siyifikativman ogmante konte espèm pa ogmante sentèz testostewòn ak sekresyon.

Pou envestige efè pwoteksyon nanECHsou blesi espèm, bisphenol A (BPA), yon disruptor andokrin ekzojèn tipik, yo te itilize kòm yon modèl domaj repwodiktif gason nan sourit32.ECHtretman efektivman refè konte espèm, mobilite espèm, T ak LH nivo diminye pa BPA (Fig. 6A, B), sijere ke ECH ka diminye blesi espèm.

Konpare ak pwodwi chimik yo atifisyèlman sentèz pou terapi ranplasman òmòn,ECHse yon konpoze natirèl ki pa ormon ki afekte fidbak negatif sou aks HPG, kidonk ogmante sekresyon LH, T, ak bon jan kalite espèm. Chemen mekanik sa a ka pwoteje sistèm repwodiktif gason an e konsaECHka konsidere kòm yon potansyèl ajan pwoteksyon natirèl repwodiktif. Sepandan, règleman òmòn yo konplèks e souvan mennen nan efè sistemik. Jan sa endike nan Fig. 7, ECH ogmante sekresyon T ak LH ak inibit aktivasyon AR, ki ka mennen tou nan konsekans sou lòt sante oswa maladi ki asosye wout tankou osteyopowoz33 ak depresyon nan gason34, Se poutèt sa, efè konplè ECH yo ta dwe pi lwen. envestige.

Ansanm, rezilta nou yo montre saECHmare nan AR a nan ipotalamus la epi li anpeche transfè AR a soti nan sitoplasm nan nwayo a. Done nou yo sijere ke ECH mare nan sit ki nan pòch AR nan asid amine Met-894 ak Val-713. Sa a ka eksplike ogmantasyon nan nivo T ak AR kòm yon repons sistemik pou balanse nivo òmòn yo pa ankouraje sekresyon LH ak yon ogmantasyon ki vin apre nan pwodiksyon T ak konte espèm (Fig. 8).

Metòd

Deklarasyon Etik.

Etid sa a te fèt an konfòmite strik ak Gid yo pou bèt eksperimantal etabli pa Ministè Syans ak Teknoloji (Beijing, Lachin). Tout pwotokòl eksperimantal yo te revize ak apwouve pa Komite Etik Anyang Enstiti Teknoloji.

Bèt eksperimantal.

Sourit Kunming ki gen kat semèn (22 g-25 g) te jwenn nan sant bèt nan katriyèm inivèsite militè medikal (Xi'an, Lachin). Yo te kenbe bèt yo nan kondisyon kontwole nan yon tanperati 22 degre ± 2 degre, 70 pousan ± 4 pousan imidite ak 12 èdtan limyè-fènwa-siklèt, ak aksè gratis nan manje ak dlo.

Tretman eksperyans.

Eksperyans 1. Sourit yo te owaza divize an sis gwoup, sèt sourit nan chak gwoup (n=7).ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Lachin) yo te administre lè l sèvi avèk yon tib entragastric, epi yo te bay testostewòn propionate (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Lachin) pa piki miskilè yon fwa chak jou pou 14 jou dapre konsepsyon eksperimantal sa a: Gwoup kontwòl: saline nòmal (10mL/kg), gwoup ECH(L) (5mg/kg), gwoup ECH(M) (20mg/kg),ECH(H) gwoup (80mg/kg), TP (15mg/kg) ak enzalutamide (AR inibitè, yon fwa chak jou chak lòt jou pou 14 jou; 20mg/kg; CAS: 915087-33-1; Aladin, Shanghai, Lachin).

Apre 2 semèn tretman, sourit yo te anestezi ak etè dyetil pou kolekte echantiyon san pou analiz nivo òmòn yo. Lè sa a, sourit yo te diseke pou separe ipotalamus la, ansefal plis pitwitèr, tèstikul, ak epididim cauda. Yo te mete echantiyon cauda epididymis nan saline nòmal ak 5 pousan BSA pou evalyasyon kalite espèm, epi ipotalamus la, ansefal plis pitwitèr, ak tèstikul yo te jele nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 degre pou plis envestigasyon.

Eksperyans 2. Sourit yo te owaza divize an 10 gwoup, senk bèt pou chak gwoup.ECH(20mg/kg) yo te administre oralman epi yo te anestezi sourit yo nan chak gwoup ak etè dyetil nan moman 0.5 h, 1h, 1.5h, 2h, 2.5h, 3h, 4h, 6h, 9h, ak 12h apre administrasyon pou koleksyon echantiyon. Plasma te kolekte epi kè a te ekspoze. Perfusion nan saline nòmal nan vantrikul gòch yo te fèt pa yon aparèy perfusion jiskaske fwa a ak poumon yo te blanchi. Yo te kolekte dis ipotalami ak tèstikul pou detèmine konsantrasyon tisi ECH yo.

Eksperyans 3. Sourit yo te owaza divize an 4 gwoup, sèt nan chak gwoup.ECHak BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Lachin) yo te administre lè l sèvi avèk yon tib entragastric yon fwa chak jou pou 6 semèn dapre konsepsyon eksperimantal sa a: gwoup nòmal (lwil mayi, 10 mL / kg, bw / d) , gwoup modèl: gwoup BPA (BPA 200 mg/kg, bw/d, lwil mayi), ak gwoup eksperimantal: BPA plis ECH gwoup (BPA 200mg/kg; ECH 20mg/kg). Apre 42 jou tretman, sourit yo te anestezi ak etè dyetil epi yo te kolekte echantiyon san yo pou analiz nivo òmòn yo. Epididim tèstikul ak cauda yo te separe epi kolekte. Yo te itilize epididim cauda pou evalyasyon kalite espèm yo epi yo te jele tèstikul la nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 degre pou plis envestigasyon.

Detèminasyon kalite espèm. Preparasyon sispansyon espèm. Epididymid Cauda yo te mens nan 5 mL nan saline nòmal ak 5 pousan BSA ak enkubasyon pou 5 min nan 37 degre pou pèmèt sa yo gaye nan mwayen an. Nimewo espèm: Dapre metòd yo dekri nan Yokoi (2003), sispansyon espèm dilye a (1:10; v/v; sispansyon espèm / 10 pousan metanol) te transfere nan chak chanm konte nan yon emositomèt epi yo te pèmèt yo kanpe pou 5 min. ak Lè sa a, konte anba yon mikwoskòp limyè (Nikon, Instruments Inc., Japon) nan agrandisman X200.Vitabilite espèm: Yo te melanje yon total de 20μL nan sispansyon espèm ak yon volim egal nan tach eosin-nigrosin pou 2min; espèm yo ki pa tache yo te konte anba yon mikwoskòp limyè nan 200x agrandisman.Motilite espèm: Yo te mete yon total de 10μL nan sispansyon espèm sou yon glisad vè epi yo te anrejistre kòm swa mobil oswa imobil anba yon mikwoskòp limyè nan 200x agrandisman.

Detèminasyon nivo òmòn yo. Nivo testostewòn (T) ak LH yo te quantifye nan serom, ansefal plis pitwitèr, ak omojèn tèstikul lè l sèvi avèk radioimmunoassay (RIA) twous (Beijing Sino-UK Enstiti Teknoloji Byolojik, Beijing, Lachin). Yon ti tan, anti-testostewòn oswa anti-LH IgG antikò (100 μL) ak 125-I-konjige anti-sourit antikò yo te ajoute nan echantiyon oswa estanda a (100 μL), epi melanje sou yon rokeur lannwit lan nan 4 degre. Apre lave twa fwa ak PBS-Tween 20 (500 μL), melanj yo te santrifuje (3500rpm / min) nan 4 degre pou 15min. Valè CPM precipitates yo te evalye pa radyoimmunoassay enstriman (Beijing Sino-western Technology Co Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Beijing, Lachin) ak konsantrasyon yo nan T ak LH yo te kalkile dapre fòmil la nan yon estanda. koub. Te T ak LH koyefisyan varyasyon se 2.8 pousan ak 3.2 pousan nan gwoup echantiyon, ak 2.1 pousan ak 2.8 pousan nan gwoup estanda, respektivman.

Detèminasyon ekspresyon jèn pa PCR quantitative an tan reyèl. Total RNA te izole nan jele testikil ak ansefal plis tisi pitwitè lè l sèvi avèk yon twous RNA Senp Total RNA (Tiangen, Beijing, Lachin). Quantitative PCR an tan reyèl (q RT-PCR) te pote soti pou aplikasyon an nan cDNA lè l sèvi avèk 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Lachin). Pwosedi PCR la konsiste de 95 degre pou 30 segonn ki te swiv pa 35 sik 95 degre pou 15 segonn, 58 degre pou 30 segonn, ak 72 degre pou 30 segonn. Analiz koub k ap fonn yo te fèt sou pwodwi PCR yo pou verifye spesifik primè ak pite pwodwi yo. Yo te fè yon koub disosyasyon pou chak plak pou konfime pwodiksyon yon sèl pwodwi. Yo te kalkile abondans relatif chak mRNA. Yo montre premye PCR yo itilize pou etid la nan Tablo 2.

Western blot. Pou analiz ekspresyon AR, yo te fè ekstraksyon ak izolasyon sitoplasmik ak pwoteyin nikleyè lè l sèvi avèk yon Twous Ekstraksyon Sitoplasmik ak Pwoteyin Nikleyè (Beyotime, Nanjing, Lachin) dapre enstriksyon manifakti a. Konsantrasyon yo nan pwoteyin sitoplasmik ak nikleyè yo te evalye lè l sèvi avèk yon Bradford Pwoteyin Test Kit (Beyotime, Jiangsu, Lachin). Echantiyon pwoteyin (80ug) yo te kouri sou yon 12 pousan ak 5 pousan jèl SDS-PAGE epi yo te transfere sou manbràn PVDF. Apre bloke, manbràn yo te enkube ak antikò anti-AR IgG (1:1, 000; Bioss; Beijing Lachin), ak antikò poliklonal sourit anti-GAPDH (1:1, 000; Wuhan Boster). Byolojik

Teknoloji, Wuhan, Lachin) oswa sourit poliklonal anti-Lamin b1 antikò pou 2h. Yo te lave manbràn la twa fwa ak TBST epi enkube ak yon antikò IgG lapen anti-sourit HRP-konjige (1:5, 000; Bioss; Beijing Lachin). Siyal la te vizyalize lè l sèvi avèk ChemiDoc Imaging System (Tanon -3, 500, Shanghai, Lachin).

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) tès.

Yo te kolekte san nan tib an vè eparinize. Plasma a te separe pa santrifujasyon imedya a 6,000 rpm pou 10 min epi estoke nan -20 degre pou plis eksperyans. Echantiyon ipotalamus yo ak tèstikul yo soti nan chak pwen tan yo te pisin ak omojeneize ak metanol. Apre santrifujasyon nan 10, 000rpm nan 4 degre pou 10min, supernatant la te konsantre pa N2 epi rezidi a te fonn nan 50μL metanol epi filtre nan yon filtè 0.45 μm. Yo te enjekte dis μL echantiyon likid la filtre nan sistèm HPLC pou analiz. Koub estanda a konsiste de echantiyon ki gen 50, 100, 250, 500, ak 750 ng/mL nan ECH (Chengdu Pufei De Biotech Co, Ltd, Sichuan, Lachin). Echantiyon kontwòl kalite Plasma ki gen 75ng/mL (ba), 150 ng/mL (mwayen), ak 300 ng/mL (segondè) nan ECH la te prepare kòmsadwa pou mezire presizyon ak presizyon metòd la.

Chromatografi yo te fèt ak yon sistèm HPLC (D2{{10}}{00 Elite seri, Hitachi, Japon) makonnen ak yon detektè UV (L{-2400, Hitachi, Japon). Separasyon te fèt sou yon kolòn Termo-C18 (250mm × 4.6 mm id, 4.6 μm patikil) kenbe nan 25 degre. Faz mobil lan se te yon gradyan ki te prepare soti nan 0.1 pousan asid fosfò ki gen 0.04 pousan trimethylamine (konpozan A) ak metanol (konpozan B). Gradyan lineyè a te jan sa a: 70–90 pousan A sou 0-2 min, 60–70 pousan A sou 2–6 min, 55–60 pousan B sou 6–8 min, epi answit tounen nan 90 pousan A nan 8 minit imedyatman. Pousantaj koule a te 0.8 mL / min. Detektè UV a te opere nan 332 nm. Yo te evalye zòn nan pik kòm mezi analitik.

Etid farmakokinetik nan sourit. Te pénétration nan ECH nan ipotalamus la ak tèstikul yo te sibi analiz pharmacokinetic ak dwòg ak Estatistik lojisyèl (Dwòg ak Estatistik, Matematik Pharmacology Komite Pwofesyonèl nan Lachin). Paramèt farmakokinetik yo te detèmine lè l sèvi avèk metòd ki pa konpatiman ki baze sou teyori moman estatistik. Paramèt farmakokinetik preliminè yo enkli tan pou pik konstan (Tmax), pik konsantrasyon (Cmax), to eliminasyon konstan (Ke), mwatye lavi eliminasyon (T0.5), zòn ki anba koub la (AUC{). {4}}–12), volim distribisyon aparan (Vc), ak clearance (CL) yo te jwenn pou plis analiz. Pwopòsyon sèvo/plasma yo te kalkile dapre valè AUC0-t pou plasma ak sèvo.

ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) sentèz ak idantifikasyon. Yon total de 9.8 mg nan ECH ak 1. 0 mg nan anidrid butanediol yo te fonn nan 2mL piridin, melanje pou 12 èdtan ak brase nan tanperati chanm. Te melanj lan konsantre pa N2 ak rezidi a te konbine avèk 10.8 mg nan N-hydroxysuccinimide (NHS) ak 19.3mg nan dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ak fonn nan 4mLN, N-dimethylformamide (DMF) pou 12h ak vibran nan tanperati chanm. Apre santrifujasyon nan 2,000 g pou 5min nan 4 degre, yo te ajoute supernatant nan 5mL PBS nan ki te fonn 14.4mg ovalbumin (OVA). Nouvo melanj lan te brase pou 24h nan 4 degre. Lè sa a, solisyon reyaksyon an te dyalize kont PBS pou twa jou. Prezans ECH-OVA te konfime pa UV spectre (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) nan yon longèdonn sòti nan 190 a 400nm osi byen ke pa denaturasyon PAGE.

ELISA endirèk (iELISA). Yon plak mikrotiter te kouvwi ak ECH-OVA a (2 ug/100 μL) epi enkube lannwit lan nan 4 degre. Plak la te lave twa fwa ak PBST ak de fwa ak PBS, epi yo te ajoute 5 pousan PBSM (PBS ki gen 5 pousan lèt ekreme) pou bloke sit ki pa mare yo nan 37 degre pou 2 èdtan. Apre plak yo te lave ak PBST ak PBS, pwi yo te divize an 4 gwoup; gwoup eksperimantal, 1 ug AR total pwoteyin / 100μL; gwoup pozitif, antikò lapen anti-OVA (1:1, 000); gwoup negatif, 1 ug albumin serom bovin; ak yon gwoup vid ki gen PBS. Apre enkubasyon pou 1.5 èdtan, plak yo te lave, epi yo te ajoute 100μL / byen nan lapen HRP-konjige IgG (1:1, 000) nan gwoup la pozitif, yo te ajoute 100 μL / byen nan anti-AR ( 1:1,000) bay lòt gwoup yo. Apre enkubasyon pou 1.5 èdtan, yo te ajoute dilution IgG lapen HRP-konjige (1:5,000) nan plak yo. Apre enkubasyon nan 37 degre pou 1 èdtan, plak yo te lave twa fwa ak PBST ak de fwa ak PBS. Lè sa a, TMB te ajoute ak enkube pou 10min nan fè nwa a nan tanperati chanm ak 2M H2SO4 te ajoute yo sispann reyaksyon an. Absorbans la te li nan yon longèdonn 450nm.

Docking molekilè. Yo te fè yon etid debakadè molekilè pou mennen ankèt sou mòd nan obligatwa nan ECH nan konpoze ak reseptè a androjèn imen (AR) lè l sèvi avèk Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Estrikti ki genyen twa dimansyon (3D) AR (PDB ID: 2YHD) te telechaje nan Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). ChemBioDraw Ultra 14.0 ak ChemBio 3D Ultra 14.0 lojisyèl te jwenn estrikti 3D ECH la. Pake AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) te anplwaye pou jenere fichye D' docking yo. Kadriyaj rechèch AR te idantifye kòm sant x: 36.141, sant y: 8.513, ak sant z: 21.304 ak dimansyon gwosè x: 15, gwosè y: 15, ak gwosè z: 15. Yo te mete valè exhaustiveness a 20. Pou vina debakadè, paramèt default yo te itilize si li pa te mansyone. Yo te chwazi pozisyon ki pi byen fè nòt la jan yo jije dapre nòt ancrage Vina yo epi yo te analize vizyèlman lè l sèvi avèk lojisyèl PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org). Analiz done ak metòd estatistik.

Analiz done ak metòd estatistik. Done yo te analize ak lojisyèl estatistik SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Yo te itilize yon ANOVA yon sèl-fason pou konparezon nan mitan gwoup yo. Tès konparezon Tukey a nan diferans enpòtan nan mitan gwoup yo te detèmine. Rezilta yo te eksprime kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD) lè l sèvi avèk Graph Pad Prism lojisyèl v.7 (GraphPad Sofware, Inc, Kalifòni, USA).

Apwobasyon etik ak konsantman pou patisipe. Yo te jwenn apwobasyon etik pou etid sa a nan Komite Etik Anyang Enstiti Teknoloji