Pati 2: Règleman epijenetik Jenn Circadian Per1 kontribye nan chanjman ki gen rapò ak laj nan memwa ipokanp

Kontakte: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Pls klike isit la pou pati 1

Knockdown nan Per1 afekte alontèmmemwanan sourit jèn.Apre sa, teste si wi ou non regilasyon Per1 nan ipokanp dorsal la nesesè pou alontèmmemwafòmasyon, nou enfuze siRNA vize Per1 nan ipokanp dorsal jèn sourit 48 èdtan anvan 10-min fòmasyon OLM. Perfusion nan Per1 siRNA pwodui yon rediksyon enpòtan nan pwoteyin PER1 nan ipokanp dorsal la, jan yo mezire 2 èdtan apre sesyon tès final la (figi 4d, Figi siplemantè 5). Knockdown relativman modès sa a nan pwoteyin PER1 (~30 pousan) te pwodwi gwo pwoblèmmemwafòmasyon pou OLM; sourit ki te enfuze ak Per1 siRNA pa te montre okenn ogmantasyon enpòtan nan DI ant fòmasyon ak tès epi yo te montre siyifikativman mwens preferans pou objè k ap deplase pandan tès la pase sourit kontwòl (Fig. 4e) san okenn efè sou eksplorasyon total objè nan tès la (Fig. 4f) epi pa gen okenn diferans nan mouvman pandan sesyon yo abitye pre-fòmasyon (Siplemantè Figi 8c). Sa a montre, pou premye fwa, dezòd lokal yon jèn revèy sirkadyèn debaz seleksyonman nan ipokanp la ka afekte.memwafòmasyon.

Per1 twòp ekspresyon amelyorememwanan sourit ki aje. Finalman,pou detèmine si twòp ekspresyon Per1 nan ipokanp dorsal la ase pou amelyore ki gen rapò ak laj.memwaandikap yo, nou te kontwole lokalman Per1 lè l sèvi avèk de metòd konplemantè. Premyèman, nou te itilize yon lentivirus ki eksprime Per1 sovaj ak yon tag epitop v5 (pLVX-v5Per1) (Fig. 5a, Fig. Siplemantè 6a). Pou konfime ke plasmid sa a twòp eksprime Per1, nou transfekte selil HT22 ak pLVX-v5Per1 oswa pLVX-EV epi nou mezire ekspresyon mRNA Per1. Nan tou de 24 ak 48 èdtan apre transfèksyon, Per1 mRNA te siyifikativman ogmante nan selil transfekte ak pLVX-v5Per1 parapò ak selil transfekte ak plasmid kontwòl la (Fig. 5b). Transfeksyon pLVX-v5Per1 te mennen tou nan yon ogmantasyon siyifikatif nan mRNA pou Per2 (yon manm fanmi revèy Peryòd ki reyaji avèk Per1) nan 24 èdtan (Siplemantè Fig. 6b), byenke ogmantasyon sa a te pi piti anpil pase ogmantasyon obsève nan Per1 (nan 24 h, Per1: 466-pliye ogmantasyon sou EV, Per2: 1.6-pliye ogmantasyon sou EV). Per1 twòp ekspresyon pa te afekte transkripsyon jèn ki pi pre Hes7 en a, sepandan (figi siplemantè 6c).

Pou detèmine si Sur-ekspresyon Per1 amelyorememwapèfòmans nan sourit ki aje, pLVX-v5Per1 te enfuze nan ipokanp dorsal 18-mo sourit 2 semèn anvan konpòtman an. Sourit pLVX-v5Per1 te montre siyifikativman amelyorememwapou OLM nan tès parapò ak kontwòl pLVX-EV (vektè vid) (figi 5c). Sèlman sourit pLVX-v5Per1 te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan preferans pou objè a k ap deplase nan rès parapò ak fòmasyon ki pa gen okenn diferans gwoup obsève nan eksplorasyon total nan tès (figi 5d) oswa nan mouvman pandan abityasyon (figi siplemantè 8d).

Apre konpòtman, yo te trete tisi ipokanp nan yon tisi bèt pou sekans RNA pou konfime prezans transkripsyon pLVX-EV ak pLVX-v5Per1 nan gwoup ki apwopriye yo nan vivo (figi siplemantè 7a, b, f, g).

Pou konpleman apwòch sa a, nou te itilize tou CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) sistèm33 pou kondwi aktivasyon transcriptional Per1 nan ipokanp dorsal la. Sistèm sa a konsiste de twa konpozan lentiviral: yon katalitikCas9 inaktif (dCas9) kole ak yon domèn deklanchman transkripsyon VP64 ak yon tag GFP (dCas9-VP{64-GFP), yon RNA yon sèl gid (sgRNA) modifye ki vize Per1 ak de aptamè RNA MS2 ki kapab. rekrite twazyèm eleman an, yon MS2- doub transcriptional activator (MS2-p65-HSF1) pwoteyin fizyon(figi 5e). Bèt kontwòl yo te resevwa yon sgRNA kontwòl ki manke sekans 20 nukleotid ki nesesè pou vize sistèm SAM a nan Per1 (ki refere kòm ctrl sgRNA). Asanble konpozan sa yo nan pwomotè Per1 pèmèt twa domèn efèktè (VP64, p65, ak HSF1) pou kondwi transcription Per1. Pou konfime, efikasite Fig. 5 Ekspresyon Per1 nan dorsal ipokanp amelyore andikap ki gen rapò ak laj nan kote objè a.memwa. yon Chema konstriksyon lentiviris yo itilize pou eksprime v{{0}}tagged Per1 (pLVX-v5Per1) konpare ak kontwòl vektè vid la (pLVX-EV). b Per1 mRNA te ogmante siyifikativman 24 ak 48 èdtan apre transfèksyon pLVX-v5Per1 nan selil HT22 konpare ak selil transfekte ak EV (ANOVA de-fason: Gwoup x Timepoint entèraksyon (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" tès="" post="" hoc="" sidak="" yo,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" sourit="" yo="" te="" bay="" perfusion="" ipokanp="" nan="" plvx-v5per1="" te="" montre="" siyifikativman="" pi="" bon="" memwa="" pou="" olm="" pase="" sourit="" yo="" te="" bay="" viris="" kontwòl="" plvx-ev="" (anova="" de-fason:="" viris="" x="" entèraksyon="" sesyon,="" (f(1,29))="" {{34="" }}.15,="" p=""><0.05), tès="" post="" hoc="" sidak="" yo,="" **p=""><0.01, ***p=""><0.001, n="16," 15,="" tout="" gason).="" d="" eksplorasyon="" total="" te="" sanble="" pou="" tou="" de="" gwoup="" yo="" nan="" tès="" la="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" chema="" sistèm="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" ki="" itilize="" pou="" kondwi="" transkripsyon="" per1.="" top:="" konpozan="" endividyèl="" nan="" sam.="" anba:="" konpozan="" reyini="" nan="" pwomotè="" per1,="" kondwi="" transcription="" per1.="" f="" per1="" mrna="" te="" siyifikativman="" ogmante="" 48="" èdtan="" apre="" transfèksyon="" nan="" eleman="" crispr-sam="" nan="" selil="" ht22="" konpare="" ak="" selil="" transfekte="" ak="" sgrna="" kontwòl="" la="" (anova="" de-fason:="" gwoup="" x="" timepoint="" entèraksyon="" (f(1,8)="14.77)." ,="" p=""><0.01), tès="" post="" hoc="" sidak="" yo,="" **p=""><0.001, n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" sourit="" yo="" te="" bay="" perfusion="" ipokanp="" nan="" sistèm="" crispr-sam="" ak="" sgrna="" vize="" per1="" te="" montre="" siyifikativman="" pi="">memwapou OLM konpare ak sourit kontwòl EV ak sgRNA kontwòl (ANOVA de-fason: viris x entèraksyon sesyon (F(1,30)=5.83, p <0.05) ,="" tès="" post="" hoc="" sidak="" yo,="" ***p="">< 0.001,="" n="17," 15,="" tout="" gason).="" h="" eksplorasyon="" total="" te="" sanble="" pou="" tou="" de="" gwoup="" yo="" nan="" tès="" la="" (t(30)="0.41," p="0.68)." done="" yo="" prezante="" kòm="" mwayen="" ±="" sem="" nan="" sistèm="" crispr-sam="" la,="" nou="" transfekte="" selil="" ht22="" ak="" tout="" twa="" plasmid,="" rekòlte="" selil="" yo="" 24="" oswa="" 48="" èdtan="" apre,="" epi="" mezire="" ekspresyon="" per1="" mrna.="" pa="" 48="" èdtan="" apre="" transfèksyon,="" per1="" mrna="" te="" ogmante="" anpil="" nan="" gwoup="" la="" te="" bay="" per1="" sgrna="" konpare="" ak="" kontwòl="" (fig.="" 5f),="" ki="" konfime="" ke="" sistèm="" crispr-sam="" nan="" efektivman="" kondwi="" ekspresyon="" per1="" mrna.="" nou="" pa="" obsève="" okenn="" chanjman="" nan="" ekspresyon="" pou="" swa="" per2="" mrna="" (siplemantè="" fig.="" 6e)="" oswa="" hes7="" mrna="" (siplemantè="" fig.="" 6f),="" ki="" endike="" ke="" sistèm="" crispr-sam="" la="" kondui="" surespresyon="" selektif="" jèn="" sib="" la,="">

Apre sa, 18-mo sourit yo te bay perfusion intra-ipokanp nan lentiviris CRISPR-SAM (Siplemantè Fig. 6d) epi yo te antrene nan OLM 2 semèn pita. Jan yo obsève ak surespresyon pLVX-v5Per1 nou an, CRISPR-SAM-medyatè surespresyon Per1 amelyore anpil.memwapèfòmans nan Per1 sgRNA-enfuze sourit parapò ak bèt kontwòl (figi 5g) san yo pa afekte eksplorasyon total (figi 5h) oswa mouvman pandan abitye (figi siplemantè 8e). Sèlman sourit yo te bay Per1 sgRNA a te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan preferans pou objè k ap deplase nan rès parapò ak fòmasyon, ki endike entak.memwapou kote objè yo (figi 5g). Apre konpòtman, yo te trete tisi ipokanp ki soti nan yon tisi bèt pou sekans RNA pou konfime prezans transkripsyon CRISPR yo nan gwoup ki apwopriye yo nan vivo (figi siplemantè 7c-g). Ansanm, rezilta sa yo demontre ke twòp ekspresyon de Per1 nan ipokanp dorsal la ase pou amelyore andikap ki gen rapò ak laj nan memwa kote objè alontèm. Per1 se, Se poutèt sa, yon jèn kle ki enpòtan pou fòmasyon memwa alontèm, se reglemante pa HDAC3, epi li gen pwoblèm nan sèvo a aje.

Diskisyon

Rezilta nou yo montre ke sipresyon oswa dezòd represyon histon deacetylase HDAC3 ka amelyore andikap ki gen rapò ak laj nan tou de alontèm.memwaak plastisit sinaptik. Anplis de sa, sipresyon HDAC3 retabli ekspresyon eksperyans nan jèn sirkadyèn Per1 nan ipokanp dorsal la. Kòm ekspresyon ipokanp PER1 enpòtan anpil pou fòmasyon memwa alontèm (figi 4) ak ekspresyon de Per1 nan ipokanp la amelyore pwoblèm memwa ki gen rapò ak laj (figi 5), PER1 se yon mekanis potansyèl atravè efase HDAC3 amelyore.memwaak plastisit sinaptik nan sourit ki aje. Plis an jeneral, dezòd Per1 ki gen rapò ak laj ta ka konekte andikap ki gen rapò ak laj nan tou de memwa alontèm ak ritm sirkadyèn, tou depann de estrikti a.

Youn nan konklizyon kle nan etid aktyèl la se ke andikap ki gen rapò ak laj nan ipokanp LTP ta ka amelyore ak sipresyon HDAC3 oswa dezòd. Sa a konsistan avèk dènye travay ki soti nan laboratwa Sajikumar ki montre ke blokaj famasi HDAC3 kapab tou amelyore andikap ki gen rapò ak laj nan LTP34 ipokanp asosyativ. Enteresan, nou te jwenn ke tranch ki soti nan ansyen HDAC3flox/flox ak HDAC3(Y298H) bèt yo echwe pou rive nan menm nivo potansyasyon ak tranch ki soti nan jèn HDAC3flox/flox oswa HDAC3(Y298H) bèt (Fig. 2c, f), ki sijere ke sèvo aje ka gen yon plafon plastisit pi ba pase sèvo jèn. Youn nan eksplikasyon posib pou diferans sa a nan potansyasyon se ke pèt ki gen rapò ak laj nan kontak sinaptik nan CA122 ta ka bese plafon an plastisit nan ipokanp aje a, kòm mwens sinaps ki disponib yo ta vin satire pi vit pase sinaps yo relativman abondan nan jèn DH la. Si sa a se ka a, ranfòse pwotokòl eksitasyon an oswa bay bout eksitasyon espace35 pa ta dwe plis amelyore LTP nan ipokanp aje a, paske pa gen okenn sinaps adisyonèl ki disponib. Travay plis ap nesesè pou detèmine mekanis ki kache diferans sa a.

Rezilta sekans RNA nou yo te demontre ke se sèlman yon ti gwoup jèn ki anfòm kritè pou yo te retabli nan sèvo a aje pa sipresyon HDAC3 (Fig. 3e). Kidonk, olye ke rezime pwofil ekspresyon jèn nan jèn sèvo a, efase HDAC3 nan sèvo ki aje te retabli ekspresyon eksperyans kèk jèn kle ki enpòtan anpil pou fòmasyon memwa alontèm, tankou Per1. Per1 parèt dirèkteman reglemante pa HDAC3, kòm sipresyon fokal nan HDAC3 retabli ekspresyon Per1 eksperyans-induit ak HDAC3 fizikman retire nan pwomotè Per1 an repons a fòmasyon OLM. Pli lwen, ekspresyon Per1 nesesè poumemwa, kòm siRNA-medyatè frape-down nan pwoteyin PER1 nan DH a gen pwoblèm alontèm.memwafòmasyon nan sourit jèn, ak twòp ekspresyon amelyorememwapou OLM nan sourit ki aje. Miyò, tou de sistèm lentiviral yo te itilize pou eksprime Per1 sèlman transfekte yon ti kantite selil nan zòn CA1b nan ipokanp dorsal la (figi siplemantè 6a, d), sa ki fè li nesesè pou konfime prezans sa yo konstwi ak RNA-sekans (gade metòd). ). Kòm travay anvan yo te montre ke rejyon presi sa a nan ipokanp dorsal la se kritik pou OLM36, sa a demontre ke menm yon ti chanjman fokal nan Per1 nan yon estrikti memwa ki enpòtan ka gen enpak sou fòmasyon memwa alontèm. Sa a pwolonje rechèch anvan yo ki montre ke sipresyon ki pa espesifik nan Per1 nan tout sèvo a ka afekte fòmasyon memwa nan jèn sourit6,28,29. Anòmal HDAC3-medyatè represyon nan Per1 nan sèvo ki aje a se poutèt sa se yon evènman kle ki ta ka mennen nan andikap ki gen rapò ak laj nan tou de fòmasyon memwa alontèm ak ritm sirkadyèn. Malgre ke etid sa a klèman demontre ke Per1 se yon jèn enpòtan nan ki HDAC3 kontwole memwa alontèm nan sèvo a aje, lòt jèn gen plis chans kontribye nan efè yo amelyore memwa nan sipresyon HDAC3. Lòt jèn pwopoze pou medyatè efè HDAC3 sou plastisit sinaptik ak memwa gen ladan NF-κB34, FMRP37, ak Nr4a226. Nan etid aktyèl la, nou te idantifye twa lòt jèn (Fig. 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) ki, tankou Per1, montre pwoblèm ekspresyon nan sèvo aje ki amelyore pa sipresyon HDAC3. Ki jan jèn sa yo diferan inikman kontribye nan efè yo amelyore memwa nan sipresyon HDAC3 se kounye a klè. Miyò, tout jèn sa yo koòdone ak chemen CBP/CREB, ki enpòtan anpil pou fòmasyon memwa alontèm38,39 epi li se tou de monte-aval de PER16,28. Kòm PER1 se en nan fosforilasyon CREB6, li posib ke HDAC3-medyatè represyon nan Per1 diminye fosforilasyon CREB, finalman afekte transkripsyon nan jèn CREB medyatè tankou Fmrp40,41, ak manm fanmi jèn Nr4a Nr4a1 ak Nr4a226. Konprann dinamik konplèks ant HDAC3, PER1, ak lòt jwè molekilè sa yo pral yon objektif enpòtan nan rechèch nan lavni.

Nan etid aktyèl la, nou te itilize de metòd konplemantè pou overexpress Per1 nan sèvo ki aje: ekspresyon de yon konstriksyon Per1 cDNA plen longè lè l sèvi avèk pLVX-v5Per1 ak aktivasyon transcriptional nan andojèn Per1 lè l sèvi avèk sistèm CRISPR-SAM la. Malgre ke pLVX-medyatè twòp ekspresyon te kondwi yon gwo ogmantasyon nan Per1 mRNA (figi 5b), sa a te akonpaye pa yon ogmantasyon nan Per2, yon lòt manm fanmi Peryòd (figi siplemantè 6b). Ekspresyon jèn en Hes7 la, sepandan, pa t chanje pa pLVX-v5Per1 (figi siplemantè 6c). Sistèm CRISPR-SAM la, nan lòt men an, te pwodwi yon ogmantasyon pi sibtil nan Per1 mRNA ki te evite amelyorasyon nan sib swa nan ekspresyon Per2 oswa Hes7 (figi siplemantè 6e-f). Kòm tou de apwòch menm jan an amelyore alontèmmemwanan sourit ki aje, li se fasil ke ogmantasyon nan sib nan Per2 obsève ak pLVX-v5Per1 te kòz la nan amelyorasyon nan obsève nan memwa alontèm.

Efè sikadyen sou alontèmmemwayo tradisyonèlman kwè yo soti nan dysregulation nan SCN a, ki Lè sa a, kondwi chanjman nan estrikti periferik ki enplike nan fòmasyon memwa, tankou ipokanp dorsal la. Yo konnen ti kras sou wòl jèn sirkadyèn endividyèl yo nan DH a, malgre yon koneksyon klè ant ritm sirkadyèn ak fòmasyon memwa alontèm. Memwa byen lye ak tan nan jounen an, kòm kaskad jèn ki gen rapò ak plastisit montre osilasyon sirkadyèn3,6 akmemwaka akeri pi fasil nan sèten peryòd sik sirkadyèn. Pou egzanp, kondisyone pè kontèks akeri pi fò pandan jounen an, lè nivo fosforilasyon MAPK pik3. Pli lwen, li byen dokimante ke aje akonpaye pa yon pann nan ritm sirkadyèn, prezimableman akòz chanjman nan revèy sirkadyèn santral la, nwayo suprachiasmatic (SCN) (pou revizyon1). Ki jan dezòd sa a nan revèy sirkadyèn an gen rapò ak andikap ki gen rapò ak laj nanmemwase yon kesyon ouvè. Rezilta nou yo sijere ke HDAC3 limite eksperyans-induit Per1 nan ipokanp aje a, pètèt kontribye nan andikap yo obsève nan memwa alontèm. Se poutèt sa, represyon epijenetik Per1 ka reprezante yon koòdone enpòtan ant andikap ki gen rapò ak laj nan tou de ritm sirkadyèn ak fòmasyon memwa alontèm.

Nan jèn revèy sirkadyèn kanonik debaz yo, Per1 se yon fason inik pou afekte dramatikman ipokanp alontèm.memwa. Per1 parèt sitou patisipe nan chemen pwodiksyon SCN epi li jwe yon wòl kle nan revèy periferik en SCN a, tankou ipokanp42. Anplis de sa, travay resan sijere ke Per1 ka "gate" fòmasyon memwa espasyal pandan tout sik la jounen / lannwit pa kontwole CREB fosforilasyon6,28,29. Vreman vre, yo te obsève regilasyon ipokanp Per1 mRNA apre kontèks oswa aprantisaj espasyal nan omwen twa lòt etid RNA-seq, ki gen ladan travay nan rat, ki endike ke Per1 se tipikman upregulated apre aprann atravè espès20,43,44. Ansanm ak rezilta etid aktyèl la, travay sa a endike ke ekspresyon PER1 enpòtan anpil pou fòmasyon memwa alontèm ipokanp; rediksyon nan PER1 ki fèt nan mitan lannwit29 oswa ak aje ta ka afekte ipokanpmemwa. Pou dat,

rechèch ki enplike Per1 nanmemwafòmasyon te konte sèlman sou knockouts mondyal ki deranje ekspresyon Per1 nan revèy sirkadyèn debaz la ak lòt rejyon anplis de estrikti ki enpòtan pou memwa tankou ipokanp6,28,29,45,46, ki fè li enposib detèmine si ipokanp PER1 espesyalman obligatwa pou fòmasyon memwa. Vreman vre, sipresyon mondyal Per1 afekte ritm sirkadyèn nan kèk rapò42. Isit la, nou montre pou premye fwa ke diminye ekspresyon PER1 dirèkteman nan ipokanp dorsal la ka afekte.memwanan sourit jèn tandiske surespresyon lokal nan Per1 nan ipokanp dorsal la ka amelyore memwa nan sourit ki aje. Kòm sipresyon selektif HDAC3 (ki kontwole Per1) nan ipokanp dorsal la pa te gen okenn efè sou modèl aktivite sirkadyèn nan etid aktyèl la (figi siplemantè 4), e menm blesi elektwolitik nan ipokanp dorsal la pa ase pou afekte ritm sirkadyèn47, li sanble fasil ke manipile Per1 nan ipokanp dorsal la afekte fonksyon revèy sirkadyèn santral la. Sepandan, li posib ke eksperyans-pwovoke ogmantasyon nan Per1 oswa viris-medyatè twòp ekspresyon nan Per1 ka afekte osilasyon sirkadyèn nan lòt jwè molekilè, tankou lòt jèn revèy, nan newòn ipokanp yo, menm san yo pa afekte modèl aktivite sirkadyèn yo. Konprann ki jan Per1 fonksyone pou chanje fòmasyon memwa, ki gen ladann idantifye potansyèl patnè sa yo, pral sib travay nan lavni.

Ansanm, rezilta sa yo demontre ke jèn sirkadyèn nwayo Per1 jwe yon wòl kle nan lokal yomemwaestrikti yo chanje fòmasyon memwa, yon wòl ki endepandan de fonksyon li nan SCN la. Plis jeneralman, sa a defi ipotèz tradisyonèl ki fè chanjman sirkadyèn nanmemwafòmasyon yo kondwi pa chanjman nan revèy sirkadyèn debaz la epi olye sipòte ipotèz ki fè konnen jèn sirkadyèn yo jwe yon wòl plis otonòm nan selil ipokanp yo, pètèt fòmasyon memwa ki baze sou lè jounen an6.

Metòd

Sourit. Sourit jèn adilt yo te genyen ant 2 ak 4 mwa nan moman tès la ak sourit ki aje yo te ant 18 ak 20 mwa. Tout sourit yo te C57BL/6J oswa konsève sou yon background C57BL/6 (HDAC3 plis / plis ak HDAC3flox / sourit flox). Sourit yo te gen aksè gratis nan manje ak dlo ak limyè yo te kenbe sou yon sik limyè / fè nwa 12 h. Tout tès konpòtman yo te fèt pandan sik limyè a. Tout eksperyans yo te fèt dapre direktiv Enstiti Nasyonal Sante Ameriken pou swen ak itilizasyon bèt epi yo te apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan University of California, Irvine.

Operasyon. Sourit yo te anestezi ak izoflurane (pwovoke, 4 pousan; kenbe 1.5–2.0 pousan) epi yo mete yo nan stereotaxic la. Zegwi piki yo te bese nan ipokanp dorsal la nan yon vitès 0.2 mm/15 s (AP, -2.0 mm; ML, ± 1.5 mm, DV, - 1.5 mm parapò ak Bregma ). De minit apre yo te rive nan pwofondè sib la, 1.0 ul viris oswa siRNA te enfuze bilateralman nan DH a nan yon vitès 6 ul/h. Pou perfusion lentiviral CRISPR-SAM yo, yo te enfuze yon bwason nan twa viris yo nan yon volim final 1.5 μL pou chak emisfè nan menm vitès la. Zegwi piki rete an plas pou de minit apre piki pou pèmèt viris la difize. Lè sa a, enjektè yo te leve 0.1 mm epi yo te pèmèt yo chita pou yon lòt minit anvan yo te retire nan yon pousantaj de 0.1 mm pou chak 15 s. Perfusion viral yo te fèt 2 semèn anvan analiz konpòtman tandiske siRNA knockdown te fèt 2d anvan fòmasyon13. Pou tout eksperyans piki, bèt yo te plase owaza nan diferan kondisyon piki yo (ak eksepsyon sourit HDAC3 plus / plis ak HDAC3flox / flox, ki te tout sou fòm piki ak AAV-CaMKII-Cre). Pou tout eksperyans konpòtman, bèt ki nan chak kondisyon viral yo te plase owaza nan gwoup kay / antrene ak tout kondisyon (objè, bwat, elatriye) yo te kontrebalanse ant gwoup yo.

Pwodiksyon AAV. AAV2.1-CaMKII-Cre te achte nan men Penn Vector Core (titre: 1.81 × 1013 GC/ml). Pou AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, nou te anplifye HDAC3 sovaj ki soti nan cDNA ipokanp la epi nou te klonaj pwodwi a nan yon pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) ki te modifye anba kontwòl pwomotè CMV ak entron -globin. Tag 3×-FLAG la, eleman IRES, ak hrGFP yo te retire nan vektè a epi ranplase ak yon tag V5, ki pèmèt yon fizyon C-tèminal HDAC3 (plasmid MW91). Pou kreye mitasyon pwen an, nou chanje nukleotid yo nan kòd pou yon rezidi histidine nan plas tirozin nan asid amine 298 (plasmid MW92). Pou kontwòl vektè vid la, sekans kodaj HDAC3 pa t prezan, men tout lòt eleman rete (plasmid MW87). AAV te fèt pa Penn Vector Core ak tit final yo te detèmine pa qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6.48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1.35 × 1013 GC/ml).

Pwodiksyon Lentivirus. Pou sistèm CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM), yo te achte plasmid lentiviral nan men Addgene pou dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) ak MS2- P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) konstwi (tit Pi gran pase oswa egal a 8× 106 TU/ml). Pou sgRNA Per1 a, nou klonaj epi mete yon sekans gid antisans ki koresponn ak eleman CRE nan pwomotè Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) nan zo rèl klonaj Addgene sgRNA(MS2) (#61427). SgRNA kontwòl la te idantik, eksepte ke pa gen okenn sekans gid yo te klonaj nan plasmid la. Lentivirus pou tou de sgRNA Per1 (titre: 6.8 × 107 IFU/ml) ak sgRNA kontwòl (3.5 × 107 IFU/ml) te pwodwi pa USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory.

Pou konstriksyon pLVX-V5Per1 overexpression, nou anplifye tout longè Wildtype Per1 soti nan plasmid Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (#16203) epi klonaj pwodwi a nan yon pLVX-EF1 -IRES-mCherry modifye. zo rèl do (Takara, #631987). Eleman IRES ak mCherry yo te retire epi yo te ranplase ak yon tag V5, ki pèmèt yon fizyon N-tèminal nan PER1 (plasmid MW206). Pou kontwòl vektè vid (EV), sekans kodaj PER1 la pa t prezan men tout lòt eleman yo te rete (Plasmid MW93). Lentivirus pou pLVX-v5Per1 (titre: 1.3 × 108 IFU/ml) ak pLVX-EV (titer: 1.5 × 108 IFU/ml) te pwodwi pa USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory. Tout konstriksyon lentiviral yo te eksprime anba pwomotè EF1 la.

Verifikasyon kilti selil pLVX-v5Per1 ak CRISPR-SAM. Pou verifye ke pLVX-v5Per1 pwodui twòp ekspresyon nan Per1 mRNA, selil HT22 sourit (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) te transfekte ak pLVX-v5Per1 oswa pLVX-EV (Fig. 5a) lè l sèvi avèk Lipofectaine LTX (Invitrogen). Menm jan an tou, pou verifye ke sistèm CRISPR-SAM ka efektivman kondwi transkripsyon Per1, selil HT22 yo te transfekte ak dCas9-VP64 (lenti MS{2-P{65_HSF1_Blast te yon kado nan plasmid Feng Zhang Addgene #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast te yon kado nan Feng Zhang, plasmid Addgene #61426), epi swa Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) oswa sgRNA kontwòl ki pa vize (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2) _zeo zo rèl do se te yon kado nan Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) lè l sèvi avèk Lipofectamine LTX (Invitrogen). Selil yo te rekòlte apre 24 oswa 48 èdtan, lysed, epi mRNA yo te izole jan sa dekri pi wo a. qRT-PCR te fèt jan sa dekri pi wo a lè l sèvi avèk primè Per1, Per2, ak Hes7 ak sonde ki nan lis nan Tablo S4.

siRNA. Pou eksperyans knockdown Per1, Accell SMARTpool ti entèferans RNAs (siRNAs; Dharmacon, GE) vize Per1 yo te dilye nan yon konsantrasyon total final 10 μM nan ddH20 ak enfuze nan DH a (1.0 ul/bò). Accell ki pa vize pisin siRNA te itilize kòm kontwòl (konsantrasyon total, 10 μM) epi yo te enfuze nan menm fason an. Pou eksperyans siRNA, sourit yo te okipe ak abitye jan sa dekri pi wo a epi yo te fè operasyon an jou apre dènye jou abitye. Sourit yo te bay yon jou konplè nan rekiperasyon apre operasyon epi yo te antrene jou apre a (~48 èdtan apre operasyon) pou asire maksimòm sib frape-desann. Pou asire knockdown, sourit yo te sakrifye ~ 1 èdtan apre tès la epi yo te trete pwenson ki soti nan ipokanp dorsal la ak tach lwès yo pou asire knockdown nan pwoteyin PER1.

Kote objè ak rekonesans objèmemwatravay. Pou kote objè ak objè memwa rekonesans travay, sourit yo te okipe pou 2 min / jou pou 4 jou ak Lè sa a, abitye nan kontèks la pou 5 min / jou pou sis jou youn apre lòt nan absans objè yo. Pandan fòmasyon, sourit yo te ekspoze a de objè ki idantik (100 ml beaks, fèblan epis, oswa detantè chandèl an vè) epi yo te pèmèt yo eksplore pou 10 minit. Pandan tès la retansyon (24 èdtan pita pou alontèmmemwaoswa 60 m pita pou memwa kout tèm), sourit yo te pèmèt yo eksplore pou 5 min. Pou kote objèmemwa, youn nan de objè yo konnen yo te deplase nan yon nouvo kote. Pou rekonesans objèmemwa, kote objè yo rete konstan men youn nan objè yo te ranplase ak yon nouvo atik. Abitiyasyon pou memwa rekonesans objè te kòmanse omwen yon semèn apre yo fin fè tès OLM epi yo te itilize yon nouvo kontèks ak objè ki pa abitye48. Eksplorasyon te fè nòt lè tèt sourit la oryante nan direksyon objè a epi li te rive nan 1 cm oswa lè nen an manyen objè a. Yo te anrejistre tan total eksplorasyon (t) epi yo te eksprime preferans pou atik roman an kòm yon endèks diskriminasyon (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plis tfamiliar) x 100 pousan). Pou sesyon fòmasyon yo, yo te itilize objè ki deziyen pou deplase nan tès la kòm objè nouvo pou pèmèt DI fòmasyon ak tès yo ka konpare dirèkteman. Sourit ki te eksplore tou de objè yo pou mwens pase 2 s pandan tès oswa 3 s pandan fòmasyon yo te retire nan plis analiz. Sourit ki te montre yon preferans pou yon objè pandan fòmasyon (DI> ± 20) yo te retire tou. Sesyon abitid yo te analize (pou detèmine distans vwayaje ak vitès) lè l sèvi avèk lojisyèl analiz konpòtman ANY-labirent (Stoelting Co). Tout abitye, fòmasyon, tès, ak nòt yo te fèt pa eksperimantè avèg nan gwoup eksperimantal yo.

Kontèks pè kondisyon. Pou kondisyone laperèz kontèks, yo te okipe sourit yo an premye pou 5 jou. Pandan akizisyon, sourit yo te ekspoze nan kontèks la pou 2 min ak 28 s ki te swiv pa yon chòk 2 s (0.75 mA), yon pwotokòl ki tipikman pwodui memwa alontèm solid12,20. Sourit yo te rete nan kontèks la pou yon lòt 30 s anvan yo te retire. Sourit yo te sakrifye 60 m apre fòmasyon ansanm ak kontwòl kay ki te okipe men yo pa antrene. Konpòtman konjelasyon yo te mezire lè l sèvi avèk lojisyèl Ethovision 11 (Noldus)12.

Elve plis-labirent. Plis-labirent la te fèt pa yon eksperimantè avèg nan gwoup eksperimantal yo. Yon semèn apre fini ORM, yo te teste yon seri sourit sou plis-labirent la. De bra nan labirent la te louvri (30 × 5 cm) ak de bra yo te fèmen (30 × 5 × 15 cm), ki konekte pa yon platfòm santral (5 × 5 cm). Labirent la te elve 40 cm anwo etaj la. Sourit yo te teste pou 5 minit sou aparèy la, ki te fèt nan mete chak sourit sou platfòm santral la fè fas a youn nan bra yo louvri. Ant matyè yo, yo te netwaye labirent la ak 70 pousan etanòl. Pousantaj tan ki pase nan bra fèmen ak louvri yo te bay nòt lè l sèvi avèk nenpòt lojisyèl labirent.

Analiz ritm sirkadyèn. Jenn ({{0}}mo) ak aje ({18-mo) HDAC3 plis / plis ak HDAC3flox/flox sourit yo te elve ak loje anba yon sik 12 h limyè/fè nwa (LD). De semèn apre perfusion AAV-CaMKII-Cre (ki dekri pi wo a), sourit yo te transfere nan yon chanm izole LD antrennman 12 h pou 7 jou. Lè sa a, sourit yo te transfere nan yon chanm analiz aktivite limyè-pwoteje, kote aktivite locomoteur yo te analize lè l sèvi avèk detektè mouvman gwo bout bwa optik (Philips Respironics). Yo te kontwole aktivite a pandan 2 semèn nan antrennman sik LD nan chanm ki pwoteje limyè a anvan sourit yo te chanje nan fènwa konstan (DD) pou yon lòt 3 semèn. Siveyans aktivite kontinye pandan faz DD a pou detèmine si sipresyon HDAC3 nan DH a te afekte ritm sirkadyèn andojèn yo. Done yo te kolekte lè l sèvi avèk Minimitter VitalView 5.0 epi yo te itilize lojisyèl Clocklab (Actimetrics) pou detèmine kòmansman aktivite gratis. Valè Tau yo te kalkile lè yo jwenn pant aparisyon sa a epi kalkile pi piti kare yo anfòm ak lojisyèl Clocklab49,50.

Imunohistochimi. Apre yo te fini konpòtman an, yo te retire sourit yo pa dislokasyon nan kòl matris epi yo te retire sèvo yo epi yo te jele nan glas izopentan. Yo te rasanble ven mikromèt nan tout kanpis dorsal anch la, yo te monte sou glisad epi yo te estoke nan -80 degre. Glisad yo te fikse ak 4 pousan paraformaldeyid (10-min), pèmeabilize nan 0.{01 pousan Triton X-100 nan 0.1 M PBS (5-min) , ak bloke pou 1 h ak 8 pousan serom kabrit nòmal (Jackson). Glisad yo te enkube lannwit lan (4 degre) nan antikò lapen pou HDAC3 (1:250, Abcam, script Y415, ab32369) oswa V5 (1:1000, Abcam, ab9116), oswa poul antikò pou GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Nan jou ki vin apre a, yo te lave glisad epi yo te enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak kabrit anti-lapen Alexa 488 (HDAC3 ak V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) oswa kabrit anti-poul Alexa 488 (GFP). ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) nan fè nwa. Lè sa a, glisad yo te lave ak PBST ak enkubasyon pou 50 m nan NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), yon tach nissl fliyoresan. Pou koupe otofluoresans ki pa espesifik51, yo te lave tranch yo nan PBS ak 0.01 pousan Triton, rense yo nan dlo, epi yo te enkube pou 10-min nan 10 mM CuSO4 nan 50 mM tanpon amonyòm acetate. Tranch yo te ankò rense nan dlo, lave nan PBS, ak coverslipped ak VectaShield Antifade aliye mwayen (Vector Laboratories).

Tout imaj yo te akeri ak yon eskanè Olympus VS110 ak yon objektif apokromatik 20x (ouvèti nimerik 0.75) ak lojisyèl eskanè VS110. Tout gwoup tretman yo te reprezante sou chak glisad ak tout imaj sou yon glisad yo te kaptire ak menm tan an ekspoze anba kondisyon ki pa saturasyon. Entansite imunolabeling te kwantifye ak ImageJ lè w pran echantiyon dansite optik kouch selil la nan CA1 epi soustraksyon yon echantiyon fliyoresans background nan menm imaj la. Pou tout eksperyans AAV, bèt ki echwe pou eksprime viris la nan zòn CA1 nan ipokanp dorsal la te eskli nan analiz yo. Eksperimantè ki te avèg nan kondisyon eksperimantal yo te fè imaj ak quantifikasyon.

Western blot. Pou verifye PER1 knockdown, Per1 siRNA ak kontwòl siRNA sourit yo te sakrifye 2 èdtan apre tès la ak sèvo yo te jele. Sèvo yo te seksyon coronal ak pwenson DH 1 mm yo te kolekte nan 500 μm tranch. Pwenson yo te omojènize nan tanpon T-PER (Thermo Fisher) ak Halt proteaz ak inhibiteur fosfataz (Thermo Fisher) lè l sèvi avèk yon homogenizer Dounce. Lysates pwoteyin yo te kwantifye lè l sèvi avèk yon analiz Bradford modifye (BioRad) epi yo te chaje 50 ug total de lisat pwoteyin nan chak liy yon jèl NuPAGE Bis-Tris 7.5 pousan (Thermo Fisher). Jèl kouri pou 50 minit nan 200 vòlt ak blots yo te transfere lannwit lan nan 15 V nan 4 degre sou manbràn nitrocellulose (Novexi, LC2001). Nan jou ki vin apre a, manbràn yo te enkube nan tanpon bloke pou 1 èdtan (5 pousan lèt san grès nan saline Tris-tampon ak 0.01 pousan Tween 20), lave (0.1 pousan Tween 20 nan TBS) epi answit enkubate nan antikò prensipal (1:500, lapen anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) nan tanpon antikò prensipal (3 pousan BSA nan TBS ak 0.1 pousan Tween) lannwit lan nan 4 degre. Apre sa, yo te lave manbràn yo epi enkube nan antikò sourit ki konjige ak HRP pou lapen (1:10,000, Jackson Laboratories, spesifik chèn limyè, #211-032-171) pou 1 èdtan. Manbràn yo te lave epi devlope lè l sèvi avèk Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, 34077). Plizyè ekspozisyon fim yo te itilize pou verifye linearite. Yo te lave e retire tach yo pou 10 m avèk Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), lave ankò, epi apre sa re-sonde lannwit lan (4 degre) ak yon antikò lapen pou GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778). ). Tout longè PER1 ak GAPDH tach yo montre nan Figi Siplemantè 5. Dansite optik relatif yo te kalkile apati fim analize lè l sèvi avèk ImageJ (US National Institutes of Health) pa yon eksperimantè avèg nan kondisyon eksperimantal yo. Tout valè yo te nòmalize nan nivo ekspresyon GAPDH.

qRT-PCR. Tisi yo te kolekte nan pwenson DH (ki dekri pi wo a) epi yo te jele nan -80 degre jiskaske pwosesis la. RNA te izole lè l sèvi avèk yon RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) epi yo te kreye cDNA lè l sèvi avèk Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, 04379012001). Jadendanfan ak sond yo te sòti nan Roche Universal ProbeLibrary (Table S4) epi yo te itilize pou multiplexing nan machin Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Tout valè yo te nòmalize nan Gapdh. Analiz ak estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk algorithm propriétaires Roche ak lojisyèl REST 2009 ki baze sou metòd Pfaff52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 yo te enkli nan analiz nou an. Bibliyotèk cDNA pou chak gwoup yo te prepare dapre Gid Preparasyon Egzanp TruSeq RNA (Illumina). Yo te pirifye de san senkant nanogram RNA total ki soti nan chak sourit ak pèl mayetik poly-T oligo-tache ak chalè fragmenté. Lè sa a, premye ak dezyèm seksyon cDNA yo te sentetize ak pirifye. Apre pwent yo te blunted, fen 3 'te adenylated pou anpeche konkatènasyon modèl la pandan ligasyon adaptè. Pou chak gwoup, yo te ajoute yon seri adaptè inik nan pwent cDNA epi bibliyotèk yo te anplifye pa PCR. Kalite bibliyotèk la te evalye pa Bioanalyzer ak quantifike lè l sèvi avèk qRT-PCR ak yon koub estanda prepare nan yon bibliyotèk sekans komèsyal (Illumina). Echantiyon yo te multiplexed, ak chak gwoup konpòtman reprezante nan chak selil koule nan sekansè a. Yo te rasanble 10 nM chak bibliyotèk nan kat bibliyotèk multiplex epi yo te sekans sou yon enstriman Illumina HiSeq 2500 pandan yon sekans 50 bp pou yon sèl lekti, ki te dirije pa Genomic High-Troughput Facility nan University of California, Irvine. Done sekans ki te lakòz pou chak bibliyotèk yo te post-trete pou pwodui fichye FastQ. Done yo te Lè sa a, demultiplexed ak filtre lè l sèvi avèk Illumina CASAVA 1.8.2 lojisyèl ak lojisyèl nan kay la. Lekti bon jan kalite pòv (echwe tès estanda kalite Illumina a) ak lekti kontwòl ki gen siksè ki aliyen ak jenom kontwòl PhiX yo te retire nan analiz yo. Kalite sekans ki rete yo te evalye plis lè l sèvi avèk nòt kalite PHRED ki te pwodwi an tan reyèl pandan etap ki rele baz la nan kouri sekans lan (figi siplemantè 3a).

Aliyman ak jenom referans ak transcriptome. Lekti ki soti nan chak eksperyans yo te separe separeman ak jenom referans ak transcriptome korespondan lè l sèvi avèk kout-li aliyeur ELAND v2e (Illumina) ak Bowtie24. Lekti tou de zouti ki aliyen inikman ak ekson li te ye oswa jonksyon episur ki pa gen plis pase de dezakò sou nenpòt fragman 25 bp nan lekti a te enkli nan transcriptome la. Lekti inikman aliyen, men ak plis pase de dezakò sou nenpòt fragman 25 bp nan lekti a yo te retire nan analiz yo. Menm jan an tou, li ki matche plizyè kote nan genomic referans yo te retire nan analiz la. Pousantaj lekti ki asiyen nan genòm referans ak transkriptòm lè l sèvi avèk pwotokòl sa a rapòte pou chak gwoup replike (figi siplemantè 3b). Sa a te lakòz yon mwayèn apeprè 30 milyon lekti pou chak echantiyon.

Pou verifye prezans plasmid pLVX ak CRISPR-SAM apre perfusion lentiviral, nou te kouri sekans RNA sou echantiyon ipokanp ki soti nan yon ti gwoup twa bèt pou chak gwoup apre konpòtman. Kòm kantite selil ki enfekte ak lentivirus yo nan vivo te twò piti pou detekte seryezman prezans transkripsyon apwopriye yo lè l sèvi avèk RT-qPCR (Siplemantè Fig. 6a, d), nou te itilize RNA-seq kòm yon metòd ki pi sansib pou detekte prezans la. nan relve nòt sa yo. Yo te konstwi yon vèsyon ki ajou nan asanble genomic ak anotasyon genomic lè yo ajoute sekans yo ak anotasyon nan konstriksyon plasmid yo nan genomic orijinal mm10 sourit la ak nan anotasyon an genomic sourit mm10, respektivman. Sèvi ak zouti aliyman lekti TopHat nan Tuxedo Suite54 la, lekti yo te trase nan genòm nan epi sèlman frape ki te inik nan transkripsyon plasmid yo an konparezon ak jenom referans sourit andojèn yo te konsidere kòm "matche lekti" ak konstwi plasmid yo. Lè sa a, kantite lekti matche sa yo te kantite pou chak konstriksyon pou chak echantiyon.

Ekspresyon jèn ak analiz diferans. Nivo ekspresyon jèn yo te kalkile dirèkteman nan rezilta aliyman li pou chak replike. Valè RPKM estanda55, lekti pou chak kilobaz modèl ekson pou chak milyon lekti kat) yo te ekstrè pou chak jèn ki kouvri pa done sekans yo ak chak replike yo itilize nan etid sa a.

Analiz transkripsyon diferan yo te fèt lè l sèvi avèk Cyber ​​T56,57 atravè chak pè gwoup (homecage kont 60 m apre fòmasyon) pou idantifye jèn ki monte-oswa desann-regleman apre OLM. Anplis de 18-mwa HDAC3 plus/plus ak sourit HDAC3flox/flox ki te antrene pou etid aktyèl la, done sekans RNA yo te trete yon fason ki idantik ki soti nan {{10}}mwa sourit sovaj C57 ( homecage ak OLM-antre nan menm fason ak etid aktyèl la) ki soti nan yon etid anvan20 te itilize pou analiz diferans. Kantite bèt (replike byolojik) pou chak gwoup te: Young HDAC plis / plis HC: 6, Young HDAC3 plis / plis OLM: 6, Old HDAC3 plis / plis HC: 6, Old HDAC3 plis / plis OLM: 6, Old HDAC3flox/flox HC: 8, Old HDAC3flox/flox OLM: 8. Pa gen okenn replika teknik yo te itilize. Papòt p-valè yo itilize pou detèmine ekspresyon diferans lan se 0.05 pou tout gwoup yo. Fo Dekouvèt To (FDR) jan yo mezire pa Benjamini & Hochberg (BH) q-valè yo te itilize pou korije pou tès miltip, ak yon papòt FDR nan 0.15. Ansanm jèn yo te kontwole apre eksperyans (konpare ak homecage) pou 3 gwoup sa yo (jenn sovaj, HDAC aje plis / plis, oswa aje HDAC3flox/flox) yo te kwaze pou detèmine jèn ki komen nan de oswa plis gwoup. Anrichisman chak gwoup pou ekspresyon espesifik tisi yo, tèm Ontoloji Gene58, ak chemen KEGG59,60 yo te evalye lè l sèvi avèk DAVID61, ki baze sou jèn ki eksprime diferan apre konpòtman. Vizyalizasyon done yo te fèt lè l sèvi avèk "matplotlib" pou python ak "ggplot" pou R.

Chromatin imunopresipitasyon. ChIP te fèt sou pwenson DH ki baze sou pwotokòl ki soti nan kit Millipore ChIP11,12,62. Tisi yo te relye ak 1 pousan fòmaldeyid (Sigma), lize ak sonike, epi yo te iminoprecipite chromatin lannwit lan ak 2 ul nan anti-H4K8Ac (Millipore # 17-10099) oswa 4 ul nan anti-HDAC3 (Millipore # {{ 13}}) oswa yon kantite ekivalan serom lapen nòmal (kontwòl negatif H4K8Ac, Millipore) oswa IgG anti-sourit (HDAC3 kontwòl negatif, Millipore). Apre lave, chromatin te eliye nan pèl yo ak ranvèse relye nan prezans proteinaz K anvan pirifikasyon kolòn nan ADN. Premye sekans pou pwomotè chak jèn yo te fèt pa pwogram Primer 3 (Tablo S4). Yo te egzamine senk ul nan opinyon, anti-H4K8Ac IgG / anti-HDAC3 IgG, oswa anti-lapen / sourit IgG imunoprecipitate soti nan chak bèt yo te egzamine an kopi. Pou nòmalize done ChIP-qPCR, nou itilize metòd opinyon pousantaj. Echantiyon opinyon an te ajiste a 100 pousan epi tou de echantiyon IP ak IgG yo te kalkile kòm yon pousan nan opinyon sa a lè l sèvi avèk fòmil 100 * AE ^ (ajiste opinyon - Ct (IP)). Lè sa a, anrichisman pliye te kalkile kòm yon rapò nan ChIP a IgG an mwayèn. Yon koub estanda nan plak detèmine efikasite anplifikasyon (AE).

Preparasyon tranch ak anrejistreman. Sourit jèn (apeprè 3-mwa) ak aje (18-mwa) te enfuze viris la estereyotaksik. Pou premye eksperyans lan, yo te enfuze sourit HDAC3 plus/plus ak HDAC3flox/flox jèn ak granmoun ak AAV-CaMKII-Cre bilateralman nan DH la. Pou dezyèm eksperyans lan, yo te enfuze sourit C57 jèn ak granmoun sovaj ak AAV-HDAC3(Y298H) nan DH nan yon sèl emisfè ak kontwòl AAV-EV nan lòt emisfè a. De semèn apre perfusion (pou pèmèt ekspresyon viris optimal)2, yo te plase tranch ipokanp transverse (320 μm) nan yon chanm anrejistreman koòdone ak likid serebrospinal atifisyèl prechofe (31 ± 1 degre) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM). KH2PO4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, ak 10 mM D-glikoz). Tranch yo te kontinyèlman pèfuze nan yon pousantaj de 1.75-2 ml pou chak minit pandan y ap sifas tranch yo te ekspoze a 95 pousan O2 cho, imidite / 5 pousan CO2. Anrejistreman yo te kòmanse apre omwen 2 èdtan nan enkubasyon.

Potansyèl postsinaptik eksitasyon jaden (fEPSPs) yo te anrejistre nan radyatum stratum CA1b lè l sèvi avèk yon sèl pipèt vè (2-3MΩ) plen ak 2 M NaCl. Batman eksitasyon (0.05 Hz) yo te lage nan pwojeksyon kolateral-komisyonè Schaffer lè l sèvi avèk yon elektwòd eksitan bipolè (fil nikrom trese, 65 μm) pozisyone nan CA1c. Entansite aktyèl la te ajiste pou jwenn 50 pousan nan repons fEPSP maksimòm. Apre yo fin etabli yon liy debaz ki estab, LTP te pwovoke ak yon sèl tren nan senk pete theta, kote chak pete (kat pulsasyon nan 100 Hz) te delivre 200 ms apa (sa vle di, nan frekans theta). Entansite eksitasyon an pa te ogmante pandan TBS. Done yo te kolekte ak nimerik pa NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Analiz estatistik. Analiz estatistik yo te fèt jan sa endike nan tèks la ak lejand figi yo lè l sèvi avèk Prism 6 (GraphPad). Apwòch analitik nou yo baze sou travay ki te pibliye deja12,20,63,64. Pa gen okenn metòd estatistik yo te itilize pou pre-detèmine gwosè echantiyon yo, men gwosè echantiyon nou yo sanble ak sa yo jeneralman yo itilize nan jaden an, ki gen ladan sa yo rapòte nan piblikasyon anvan yo12,20,64,65. Distribisyon done yo te sipoze nòmal, ak divèjans menm jan an obsève nan mitan gwoup yo, men sa a pa te fòmèlman teste. Lè yon eksperyans te gen de gwoup yo konpare, yo te itilize T-tès Student a de ke. Lè yo konpare de faktè, (tankou laj ak jenotip oswa sesyon ak gwoup), done yo te analize ak ANOVA de-fason ki te swiv pa konparezon miltip Sidak apre tès hoc yo. Tout analiz yo gen de ke, ak yon valè de 0.05 obligatwa pou siyifikasyon. Ba erè nan tout figi yo reprezante SEM. Pou tout eksperyans, valè ± 2SD nan gwoup la vle di yo te konsidere kòm outliers epi yo te retire nan analiz yo.

Done disponiblite. Done ki sipòte rezilta etid sa a disponib nan men otè ki koresponn lan sou demann rezonab. Done sekans RNA yo te depoze nan Gene Expression Omnibus NCBI a epi yo aksesib atravè nimewo aksè GEO Seri GSE94832.

Referans

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Chanjman epijenetik nan nwayo suprachiasmatic ak ipokanp kontribye nan bès mantal ki gen rapò ak laj. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC ritm sirkadyen ak fòmasyon memwa. Nat. Rev Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Osilasyon sikadyen nan aktivite MAPK ipokanp ak kan: enplikasyon pou pèsistans memwa. Nat. Neurosci. 11, 1074–1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Sirkadyen modulasyon aprantisaj ak memwa nan sourit ki gen laperèz. Konpòtman. Sèvo Res. 133, 95– 108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Revèy sirkadyèn ak patoloji nan sèvo a aje. Nat. Rev Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 gates modulation sirkadyèn nan siyal memwa ki enpòtan nan ipokanp sourit pa reglemante navèt nikleyè CREB kinase pP90RSK la. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Yon ipotèz epigenetik sou malfonksyònman mantal ki gen rapò ak aje. Front Aging Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. Chanje asetilasyon histon ki asosye ak andikap memwa ki depann de laj nan sourit yo. Syans 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. Anpèchman H3K9me3 amelyore memwa, ankouraje fòmasyon kolòn vètebral, ak ogmante nivo BDNF nan ipokanp ki gen laj. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Kontribisyon epijenetik nan aje kognitif: dispans lespri ak lavi. Aprann Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. HDAC3-inibitè selektif amelyore disparisyon konpòtman k ap chèche kokayin nan yon fason ki pèsistan. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. Kontèks ak pè oditif yo diferan reglemante pa aktivite HDAC3 nan subnuclei lateral ak fondamantal nan amygdala la. Neuropsychopharmacology 42, 1284- 1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. HDAC3 se yon regilatè negatif kritik nan fòmasyon memwa alontèm. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Anpèchman histon deacetylase atravè RGFP966 lage fren yo sou plastisit kortik sansoryèl ak spesifik fòmasyon memwa.J. Neurosci. 35, 13124– 13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. Debouche aktivite katalitik kache nan klas vertebre IIa histon deacetylases. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335– 17340 (2007).

16. Solèy, Z. et al. Fonksyon deacetylase-endepandan HDAC3 nan transkripsyon ak metabolis mande pou korepresè reseptè nikleyè. Mol. Selil 52, 769–782 (2013).

17. Alaghband, Y. et al. Wòl diferan pou domèn deacetylase HDAC3 nan ipokanp la ak cortical prefrontal medyal nan fòmasyon ak disparisyon memwa. Neurobiol. Aprann. Mem. 145, 94– 104 (2017).

18. Nott, A. et al. Histone deacetylase 3 asosye ak MeCP2 pou kontwole FOXO ak konpòtman sosyal. Nat. Neurosci. 19, 1497– 1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histone deacetylase 3 nesesè pou devlopman apwopriye nan sèvo. J. Biol. Chem. 289, 34569–34582(2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. Sou-inite regilasyon BAF53b nan kromatin espesifik newòn ki nesesè pou plastisit sinaptik ak memwa. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Faktè transcription nan memwa alontèm ak plastisit sinaptik. Fizyol. Rev. 89, 121– 145 (2009).

22. Barnes, CA Potansyasyon alontèm ak sèvo a aje. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Baz done UCSC Genome Browser: aktyalizasyon 2016. Asid Nukleik Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Aliyman ultrarapid ak memwa efikas nan sekans ADN kout nan genòm imen an. Genomic Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Analiz ekspresyon ipokanp yo revele asosyasyon selektif nan chemen imedya-bonè, neroenèjik, ak myelinogenic ak andikap mantal nan rat ki gen laj. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Wòl diferans pou Nr4a1 ak Nr4a2 nan kote objè vs rekonesans objè memwa alontèm. Aprann Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Efè privasyon dòmi ak aje sou memwa alontèm ak aleka nan sourit. Aprann Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1 kowòdone ritm ipokanp yo ak pwosesis memwa ak lajounen. Hippocampus 24, 712-723 (2014).

29. Jilg, A. et al. Dinamik tanporèl ekspresyon jèn ipokanp sourit sipòte pwosesis memwa. Hippocampus 20, 377-388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Osilasyon sirkadyèn nan ipokanp sipòte fòmasyon memwa ak pèsistans. Devan Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Ekspresyon jèn ki depann sou eksperyans nan ipokanp rat la apre aprantisaj espasyal: yon konparezon nan jèn imedya-bonè Arc, c-fos, ak zif268. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Modifikasyon Chromatin ak fonksyon yo. Selil 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. et al. Aktivasyon transkripsyon echèl genòm pa yon konplèks CRISPR-Cas9 enjenieri. Nature 517, 583-588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Histone deacetylase 3 anpèchman re-etabli balisage sinaptik ak kaptire nan aje atravè aktivasyon an nan faktè nikleyè kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Prèv sinaptik pou efikasite aprantisaj espas. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Knockout fokal nan ipokanp nan CBP afekte modifikasyon spesifik histon, potansyasyon alontèm, ak memwa alontèm. Neuropsychopharmacology 36, 1545- 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Ogmante potansyasyon alontèm nan sinaps selil granules granules-perforant-perforant mwayen ki te pwovoke pa anpèchman selektif histon deacetylase 3 mande pou Frajil X pwoteyin reta mantal. Neurobiol. Aprann. Mem. 114, 193– 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB ak memwa. Ann. Rev Neurosci. 21, 127–148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Wòl fonksyonèl CREB kòm yon regilatè pozitif nan fòmasyon ak amelyorasyon memwa. Sèvo Res. Toro. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Jèn ki kode pwoteyin frajil X RNA-obligatwa a kontwole pa faktè nikleyè respiratwa 2 ak fanmi CREB nan faktè transcription. Asid Nukleik Res. 34, 1205– 1215 (2006).

41. Wang, H. et al. Wòl CREB nan règleman FMRP pa gwoup I metabotropic glutamate reseptè nan cortical cingulate. Mol. Sèvo 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Chanje ritm konpòtman ak ekspresyon jèn revèy nan sourit ki gen yon mitasyon vize nan jèn Period1 la. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. Chanjman metilation ADN nan jèn plastisit akonpaye fòmasyon ak antretyen memwa. Nat. Neurosci. 19, 102– 110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Reòganizasyon epigenomik ki depann de eksperyans nan ipokanp la. Aprann Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Yon jèn revèy, peryòd, jwe yon wòl kle nan fòmasyon memwa alontèm nan Drosophila. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058– 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Sensibilizasyon kokayin ak rekonpans yo anba enfliyans jèn sirkadyèn ak ritm. Pwosedi. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Osilasyon dijounen aktivite kinaz MAP (pwoteyin ki aktive mitogen) ak adenylyl cyclase nan ipokanp la depann de nwayo suprachiasmatic la. J. Neurosci. 31, 10640– 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Egzamen kote objè ak memwa rekonesans objè nan sourit. Curr. Pwotok. Neurosci. 69, 1–17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Revèy sirkadyèn nan ipotalamus ventromedial la kontwole depans enèji siklik. Selil Metab. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Phenotyping sirkadyèn ritm nan sourit. Curr. Pwotok. Sourit Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Rediksyon nan otofluoresans tankou lipofuscin nan tisi ki gen etikèt fluorescent. J. Histochem. Sitochem. 47, 719–730 (1999).

52. Pfaff, MW Yon nouvo modèl matematik pou quantifikasyon relatif nan RT-PCR an tan reyèl. Asid Nukleik Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaff, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Zouti lojisyèl ekspresyon relatif (REST) ​​pou konparezon gwoup ak analiz estatistik rezilta ekspresyon relatif nan PCR an tan reyèl. Asid Nukleik Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. Jèn diferans ak analiz ekspresyon transkripsyon eksperyans RNA-seq ak TopHat ak Cufflinks. Nat. Pwotok. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Kat ak quantifying transcriptomes mamifè pa RNA-Seq. Nat. Metòd 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T sèvè entènèt: analiz diferans nan done wo-debi. Asid Nukleik Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Yon fondasyon Bayezyen pou analiz done ekspresyon microarray: regilarize t-tès ak enferans estatistik chanjman jèn yo. Bioinformatics 17, 509-519 (2001).