Pati Ⅰ Devlopman nan yon analiz imuno koule lateral nan nanopartikul europyòm pou deteksyon NGAL nan pipi ak dyagnostik aksidan nan ren egi

Résumé

1. Background

AKI gen rapò ak rezilta negatif grav ak mòtalite nan pasyan kowonaviris 2019 (COVID-19), kidonk dyagnostik ak entèvansyon bonè yo enperatif. Neutrophil gelatinase-asosye lipocalin (NGAL) se youn nan byomarkè ki pi pwomèt pou deteksyon aksidan nan ren egi (AKI), men metòd deteksyon aktyèl yo pa apwopriye, kidonk metòd pi rapid, pratik ak egzat yo bezwen pou detekte NGAL pou dyagnostik bonè. nan AKI. Isit la, nou te etabli yon rapid, fyab, ak egzat lateral koule imunoassay (LFIA) ki baze sou nanopartikul europium (EU-NPS) pou deteksyon an nan NGAL nan espesimèn pipi imen.

2. Metòd

Yo te itilize yon tès imunofluoresan sandwich doub-antikò lè l sèvi avèk nanopartikul dope europyòm ak konjige antikò monoklonal NGAL (MAbs) kòm etikèt yo te pwodwi pa optimize paramèt fizyon elektrik. Yo te itilize katreventwaz echantiyon pipi pou evalye efikasite aplikasyon klinik metòd sa a.

3. Rezilta yo

Ranje deteksyon quantitative NGAL nan AKI te {{0}} ng/mL, ak sansibilizasyon deteksyon an te 0.36 ng/mL. Koyefisyan varyasyon (CV) nan analiz entra ak entè-essai te 2.57-4.98 pousan ak 4.11-7.83 pousan, respektivman. Pandan se tan, koyefisyan korelasyon ant europium nanoparticules ki baze sou lateral fliyoresans imunoassays (EU-NPS-LFIA) ak analizè ARCHITECT la te enpòtan (R2=0.9829, n=83, p <0.01).

4. Konklizyon

Kidonk, yo te etabli yon tès quantitative operasyon pi rapid ak pi fasil nan NGAL pou AKI, ki trè enpòtan ak siyifikatif nan dyagnostik AKI bonè, sijere ke tès la ka bay yon avètisman bonè nan rezilta a nan maladi a.

Mo kle

netrofil jelatinaz-asosye lipokalin (NGAL), antikò monoklonal, imunoessai koule lateral, blesi nan ren egi (AKI),Efè Cistanche a.

Klike la a pou w konnenki benefis ki genyen nan Cistanche

Entwodiksyon

Maladi kowonaviris 2019 (COVID-19) gaye anpil sou yon echèl atravè lemond ak dezas grav [1]. Agi blesi nan ren (AKI) gen yon pi gwo pousantaj morbidite ak mòtalite nan konplikasyon komen pou maladi grav ak konte apeprè 5-7 pousan nan pasyan entène lopital nan mond lan[2].- Plizyè etid yo te evalye devlopman nan AKI kòm plis. fòtman ki gen rapò ak pi mal rezilta ak pousantaj mòtalite COVID-19, ki dekri ensidans AKI ki varye anpil ant 0.5 ak 36.6 pousan nan pasyan COVID-19[3]. Deteksyon bonè ak tretman egzak nan AKI ka aplike pi bon estrateji prevantif ak anpeche deteryorasyon fonksyon ren ak ensifizans ren, efektivman genyen pwogresyon nan COVID-19 pasyan entène lopital[4]. Pami yo, lipokalin netrofil jelatinaz ki asosye (NGAL) te rekonèt kòm youn nan kandida biomaketè pwomèt pou deteksyon AKI. NGAL se yon glikoprotein 25 kDa ki asosye ak jelatinaz ki soti nan netrofil epi anjeneral egziste nan yon nivo pi ba nan tisi imen tankou lestomak, kolon, ak ren, men ekspresyon li ogmante dramatikman nan serom ak pipi lè ren an te ak aksidan ischemik oswa nefrotoksik. [5].

Lateral flow immunoassays (LFIA) yo te konsidere kòm tès depistaj vle akòz senplisite yo, analiz in-situ, ak fasilite nan travay [6]. LFIA a ak mikropartikil fliyoresan te deja itilize pou deteksyon divès patojèn mikwòb ak plizyè makè enflamasyon [7, 8]. Plizyè nanopartikul roman yo te jeneralman aplike pou amelyore sansiblite nan LFIA, ki gen ladan nanopartikul kabòn, pwen pwopòsyon, koloran fliyoresan, etikèt nano mayetik, ak nanopartikul europium (EU-NPS) [9]. EU-NPS kòm transpòtè ka amelyore 100-pliye sansiblite kontras ak nanopartikil lò koloidal ki make nan LFIA[10]. EU-NPS se yon lavi fluoresans long epi li disponib tou ak yon gwosè patikil mwayèn nan ranje 75-100 nm, gwo chanjman Stokes ki anjeneral plis pase 200 nm se fezab pou evite entèferans limyè gaye ki te koze pa mezire limyè eksitasyon. EU-NPS gen yon bann eksitasyon lajè kidonk li se benefisye ogmante enèji nan eksitasyon, pik emisyon an byen file, background ki ba, ak rezolisyon segondè, yo itilize nan imunoessais kalite sandwich nan dyagnostik medikal dènyèman[11].

Isit la, nou te etabli yon nouvo metòd ak EU-NPS kòm etikèt LFIA pou mezi rapid, sansib, ak bonè nan NGAL nan pipi a ki baze sou de antikò monoklonal (MAbs) 1G1 ak 2F4 ki dekouvri pa laboratwa nou an. Metòd la se yon tès imunofluoresan sandwich doub-antikò lè l sèvi avèk EU-NPS ak MAbs konjige kòm etikèt. MAb 1G1 te konjige ak EU-NPS epi yo te itilize mAb 2F4 pou pran konplèks antijèn EU-NPS-1G1- nan liy T. Rezilta nou yo te montre ke EU-NPS-LFIA ta ka itilize pou deteksyon bonè NGAL nan pipi epi pèmèt amelyorasyon nan tretman pasyan AKI.

Cistanche tubulosa

Metòd

1. Ekspresyon ak pirifikasyon nan NGAL

Sekans jèn NGAL imen an soti nan Genbank (NP{{0}}.2) te sentèz pa Beijing Institute of Genomics (BGI) epi li te ajoute anzim restriksyon HindIII ak XhoI nan tou de bout. Plasmid yo te dijere ak HindIII ak XhoI ak Lè sa a, klonaj nan vektè pSecTag2A. Plasmid yo konstwi yo te sekans konfime san mitasyon ak Lè sa a, transfòme nan selil òvèj Chinwa Hamster (CHO) pa LipofectamineTM2000 la. Apre 8 jou, yo te kolekte supernatant selil la apre filtraj 0.45 μm filtre. Te eksprime NGAL -6 × Pwoteyin li a pirifye ak kolòn Nikèl Nitrilotriacetic Asid (Ni-NTA), epi diferan fraksyon yo te kolekte epi evalye pa sodyòm dodecyl sulfat-polyacrylamide jèl elèktroforèz (SDS-PAGE). Twous Quantification Pwoteyin Asid Bicinchoninic (BCA) mezire konsantrasyon pwoteyin.

Pwoteyin recombinant pirifye a te sibi 12 pousan SDS-PAGE, Lè sa a, adsorbed sou yon manbràn fliyò polyvinylidene (PVDF). Apre yo te bloke manbràn nan nan tanpon tris ak 1 pousan solisyon Tween-20 (TBST) ki gen 5 pousan lèt ekreme nan tanperati chanm (RT) pou 2 èdtan, enkubasyon ak HRP-konjige anti-6×Tag li. antikò (1:5000) nan fè nwa a pou 1 èdtan nan RT, visualized ak Benzidine apre lave ak TBST epi visualized pa Bio-Rad Western blotting sistèm deteksyon (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Izrayèl).

2. Jenerasyon ak pirifikasyon MAbs

Nan premye vaksinasyon an, sourit fi BALB/c yo (ki gen laj 6 semèn, yon total 10) te vaksinen ak 50 µg NGAL-6×pwoteyin recombinant li emulsifye nan yon dòz egal nan adjuvant Freund konplè. ak vaksinasyon aksesional yo te akonpli ak pwoteyin emulsifye nan adjuvant Freund enkonplè a. De piki ipodèmik sou do sourit ak piki intraperitoneal ki vin apre yo espace 21 jou. Echantiyon serik yo te kolekte yon semèn apre twazyèm piki a, epi yo te detèmine tit antiserom nan ak yon tès imunosorban endirèk ki lye ak anzim (ELISA)[12]. Twa jou anvan fizyon, sourit yo te fè vaksen rapèl ak 50 µg NGAL-6×His dilye ak 0.9 pousan NaCl.

Selil larat sourit iminitè izole yo ak selil myelom SP2/0 melanje nan yon rapò 3:1 pou fusion nan yon chanm fizyon platinum elektwòd LF498-3 (BEX Co., Ltd, Japon) jan sa dekri. nan literati a [13]. Yon ti tan, yo te lave selil melanje a de fwa ak 10 mL tanpon electrofusion (0.3 M mannitol, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, pH 7.2), epi re-sispann nan yon konsantrasyon 2 × 1 07 selil/mL. Fizyon an te konplete lè l sèvi avèk yon vòltaj kouran altènatif 50 V nan 0.8 MHz pou 20 s, yon vòltaj batman kè dirèk nan 450 V nan 2 repetisyon pou 0.5 s, ak post-fusion te 50 V nan 0.8 MHz pou 7 s. Finalman, yo te deplase sispansyon selil elektrik trete a soti nan chanm fizyon an nan 4.5 mL prechofe RPMI 1640 (20 pousan serom fetal bovine) pou 30 minit nan 37 degre, Lè sa a, kiltive nan 96-plak byen epi enkube ak 5 pousan. CO2 nan 37 degre. Apre 24 èdtan, hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) te konplete nan chak pi. Supernatant kilti selil yo te tès depistaj pa ELISA apre 9 jou fizyon, ak kantite klon ibridòm kalkile te. Sourit BALB/c yo te enjekte lwil oliv parafin davans ak 1 × 106 selil ibridòm NGAL, ascite yo te pirifye pa kolòn Pwoteyin A.

3. Idantifikasyon MAbs

Sousklas imunoglobulin antikò yo te analize lè l sèvi avèk twous idantifikasyon antikò subclass la. ELISA endirèk la analize MAb espesifik yo lè l sèvi avèk pirifye recombinant NGAL{{0}}×pwoteyin li ak PCT- 6×pwoteyin li. Yo te detèmine entèraksyon ant antijèn ak antikò ak sistèm BIAcore T200 (GE Healthcare, Stockholm, Sweden) nan tanpon HBS-EP (0.005 pousan surfactant P20, 10 mM Hepes, pH 7.4, 3 mM EDTA, 150). mM NaCl). Antijèn NGAL la te adsorbed sou chips biocapteur CM5 rive nan 400-480 inite repons (RU) pa yon twous kouple amine. Antikò yo (2F4 ak 1G1) yo te dilye nan tanpon HBS-EP yo te tou dousman pase sou chip la ak 50 µL / min pou 5 min, respektivman, epi imedyatman HBS-EP tanpon yo te enjekte sou chip la pou kontwole faz la disosyasyon pou 4 min. . Bato detèktè yo te rejenere ak solisyon Glycine (pH 3.0) apre faz disosyasyon an. Pou chak analit pase sou chip la, repons espesifik nan kanal koule antijèn yo ka soustraksyon repons ki pa espesifik nan kanal koule kontwòl la. Koub obligatwa saturation ekipe yo te trase baze sou konsantrasyon nan analit pou repons obligatwa ekilib yo kalkile KD.

Pirifye anti-NGAL MAb yo te analize nan 12 pousan SDS-PAGE nan kondisyon ki pa diminye ak kondisyon diminye. Yon ti tan, echantiyon an te melanje ak 5 x ki pa diminye tanpon oswa 5 x pwoteyin chaje tanpon epi chaje sou 12 pousan SDS-PAGE. Espesifik anti-NGAL MAbs te detèmine pa Western Blot. Pwoteyin NGAL yo te fè nan 12 pousan SDS-PAGE, Lè sa a, adsorbed sou yon manbràn PVDF ki te aktive pa tranpe nan metanol pou 15 s, ak Lè sa a, sibi kondisyon yo elektwoforèz nan 100 V pou 2 èdtan. Apre bloke nan tanpon Tris-HCl ak 1 pousan solisyon Tween-20 (TBST) ki gen 5 pousan lèt ekreme nan RT pou 2 èdtan, yo te enkube manbràn nan ak sourit anti-NGAL MAb kòm antikò prensipal yo nan 4 degre. Nan denmen, manbràn la te lave ak TBST epi enkube ak anti-sourit konjige HRP IgG nan fè nwa a pou 1.5 èdtan nan RT. Finalman, manbràn an te visualisée pa sistèm deteksyon Western blot de améliorée chemiluminescence (ECL).

4. Esay imunosorban lye ak anzim konpetitif (ELISA)

De MAb yo te teste pou kapasite pou rekonèt epitop inik sou NGAL pa cELISA. MAb te konjige ak HRP lè l sèvi avèk HRP Antibody Labeling Kit (Shanghai YSRIBIO endistriyèl co., LTD), konsantrasyon k ap travay nan ki te teste atravè ELISA dirèk. {{0}}byen Plak Mikrotitre yo te kouvwi ak 2 µg/mL antijèn NGAL lannwit lan nan 4 degre, Lè sa a, MAb ki pa gen etikèt (0.2 µg/pi, 2 µg/pi) te mare konpetitivman ak pi bon rapò dilution nan HRP te make MAb ak enkubasyon pou 1 èdtan nan 37 degre. Reyaksyon an anzimatik parèt ak oksijene idwojèn pa substra 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine (TMB) ak sispann pa 2 M asid silfirik nan tout pwi. Absorbans la (OD450 nm) te detèmine pa yon lektè Microplate Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc). Efè bloke MAb yo te kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon sa a: 100×[1-OD_{450 nm}nan (HRP-MAb plis MAb) / OD450 nm nan HRP-MAb]. De MAb rekonèt epitop diferan si efè bloke yo te obsève nan plis pase 40 pousan.

Cistanche ekstrè

5. Konjigezon EU-NPS

Antikò monoklonal Anti-NGAL 1G1 ak 2F4 yo te konjige kovalan nan EU-NPS ak pwosedi estanda nan Bangs Laboratories. Yon ti tan, yo te ajoute 100 µL EUNPS nan 900 µL 0.{05 M MES (pH 7.{{ 32}}) ak gaye pa ultrason, vibre pou 15 min nan RT nan prezans {{40}}.08 M N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) ak 0.05 M 1-({{19 }}Dimethylaminopropyl)-3-etil carbodiimide hydrochloride (EDC). EUNPS aktive a te lave ak tanpon kouple (0.05 mM H3BO3, 0.04 mM Na2B4O7, pH 7.5) epi li te reyaji ak 0.3 mg antikò pou 2.5 èdtan nan RT. Konpoze europiumkonjige a te enkube nan 1000 µL tanpon bloke (10 pousan BSA, 20 pousan tween-20, 0.05 M Tris-HCl) pou 1 èdtan, ajoute nan 1000 µL solisyon stock (10 pousan BSA, 20 pousan trehalose, 20). pousan tween-20, 0.05 M Tris-HCl) pou estoke nan 4 degre.

6. Devlopman LFIA

Bann LFIA yo te konpoze de yon manbràn nitrocellulose, pad konjige, pad echantiyon, ak pad absòbe. Manbràn fib vè yo te tranpe nan tanpon bloke a (20 pousan trehalose, 10 pousan BSA, 20 pousan tween-20, 0.05 M Tris, 3.2 mM EDTA.Na2, pH 8.6) pou 1.5 èdtan. Konsantrasyon 1 mg/mL MAbs (2F4 oswa 1G1) te kouvwi sou liy tès la (TL) nan manbràn nitrocellulose, ak kabrit anti-sourit IgG 1 mg/mL te kouvwi sou menm manbràn NC a nan yon distans 4 mm. fòme yon liy kontwòl kalite (CL), volim espre enstriman dispansè yo te fikse nan 1 µL/cm. Manbràn ak tapi fib vè yo te cheche pou 48 èdtan nan 45 degre anvan yo te teste. Diferan EU-NPS-1G1 ak EU-NPS-2F4 patikil konjige yo te kouvwi sou pad konjige a, epi siyal fluoresans la te mezire pa yon analizè imunofluoresan (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).

7. Koleksyon echantiyon pipi ak pasyan yo

Yon total de 83 echantiyon pipi imen ki soti nan pasyan AKI yo te rekòlte nan Lopital la afilye nan Jilin Medical University. Gid etik yo te respekte entèdi nan eksperyans la epi yo te bay Lopital afilye Jilin Medical University (No. 2018-LW029). Tout matyè yo te resevwa konsantman efòme oral ak alekri an Chinwa pou etid echantiyon pipi yo. Tout eksperyans yo te fèt pa Deklarasyon Prensip Etik Helsinki. Laj mwayèn pasyan 62 ane yo te varye ant 20 ak 80 ane ki pa te enfekte pa COVID-19, epi yo te klase AKI etap 1-3 dapre kritè AKI ki te amelyore rezilta mondyal yo nan maladi ren[14]. Yo te kolekte echantiyon pipi pou analiz NGAL jiska 12 èdtan anvan AKI te dyagnostike ak nan entèval souvan apre operasyon nan plizyè pwen tan (12, 24, 48 èdtan). Pou minimize potansyèl faktè konfonn, echantiyon pipi yo te analize rapidman nan laboratwa chimi klinik la ki gen ladan byochimik pipi (konsantrasyon pwoteyin total <1 g/dL, ure <12 g/dL, glikoz <1 g/dL, kreyatinin pipi <1 g/dL. , albumin < 2.5 g/dL, pH 4.5-9.0) ak te pote soti nan kopi. Nan 30 minit nan koleksyon echantiyon yo, yo te santrifuje nan 3000 rpm nan 4 degre pou 15 min. Yo te bay yon minimòm de 100 µL supernatant nan resipyan esteril epi estoke nan -80 degre pou plis analiz, pou evite sik friz-dekonjle repete.

Yo te fè mezi nivo NGAL yo lè l sèvi avèk yon twous reyaktif NGAL pipi ARCHITECT (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Iland) lè l sèvi avèk yon fòma sandwich ki pa konpetitif ak deteksyon siyal chemiluminesan. NGAL urin te rekonèt pa yon antikò antifonjik ki te kovalans tache ak patikil paramayetik nan reyaktif mikropartikul, ak konjige a nan yon dezyèm antikò anti-NGAL ki asosye ak akridinium. Apre enstriksyon manifakti a, yo te fè tès kalibrasyon an nan yon seri 0- 1500 ng/mL epi yo te mezire konsantrasyon NGAL la.

8. Echantiyon klinik tès ak analiz

Konsantrasyon seri antijèn estanda NGAL (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000, ak 3000 ng/mL) yo te prepare lè l sèvi avèk FBS pou ranfòse reyaksyon espesifik byokonjige, chak konsantrasyon te fè twa replike. Apre echantiyon klinik yo te ajoute sou kousinen echantiyon yo, rezilta entansite fliyoresans sou liy T (HT) ak liy C (HC) te anrejistre pa lektè a. Deteksyon quantitative te konplete pa rapò HT/HC pou elimine efektivman diferans bann (T ak C) ak echantiyon matematik efè matris estanda[15]. Yo te trase koub estanda a kont chak konsantrasyon nan rapò NGAL ak HT/HC.

9. Analiz estatistik

Analiz regresion Passing-Bablok ak trase BlandAltman te fèt pa analiz divèjans (ANOVA) nan lojisyèl MedCalc ak SPSS 17.0. Tout done yo te montre kòm valè mwayèn ak devyasyon estanda (mwayèn ± SD).

Grenn Cistanche

Referans

1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Acute Kidney Injury nan COVID-19: Eksperyans Chinwa a. Seminè nan nefroloji 2020, 40(5):430–442.

2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Rezilta pasyan gravman malad ak blesi ren egi lè l sèvi avèk kritè Rezo Acute Kidney Injury. Critical care medicine 2011, 39(12): 2659–2664.

3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: Trete avèk siksè twa pasyan ki gen blesi ren egi segondè akòz COVID-19 pa dyaliz peritoneal. : Ka rapò ak revizyon literati. Peritoneal dialysis international 2020, 40(5):496–498.

4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: Acute kidney injury and nephrotic sendwòm segondè nan COVID-19-glomerulosclerosis segmantal fokal ki asosye. Nefrologia 2021.

5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: yon zouti k ap parèt pou predi gravite AKI fasil detekte pa yon tès klinik. Swen kritik 2010, 14(4): 318.

6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Imunokromatografi anzim - yon imunoassay quantitative ki pa bezwen enstriman. Chimi klinik 1985, 31 (7): 1144-1150.

7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Pèfòmans nan fliyoresan europium (III) nanopartikul ak repòtè lò koloidal nan analiz lateral koule bio afinite. Biochimi analyse 2012, 428 (1): 31-38.

8. Swanson C, D'Andrea A: Esay koule lateral ak lank tou pre-enfrawouj pou deteksyon multiplex. Chimi klinik 2013, 59 (4): 641-648.

9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Devlopman yon gwo sansiblite pwopòsyon pwen ki baze sou fluorescent trempe lateral koule tès pou deteksyon an nan zearalenone. Chimi analitik byoanalitik 2019, 411 (10): 2169-2175.

10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Lanthanide ki make bann imunokromatografik pou deteksyon rapid Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosensors bioelectronics 2014, 51:29-35.

11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: Validasyon reyaksyon deteksyon ligaz mikwosfè fliyoresan tès pou deteksyon Plasmodium falciparum rezistans medyatè. nan Uganda. Malarya Journal 2014, 13:95.

12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: Pwodiksyon monoklonal antikò ak devlopman yon tès imunosorban endirèk konpetitif anzim ki lye pou tès depistaj T-2 toksin nan lèt. Toksik 2018, 156:1–6.

Moli Yin1 , Yuanwang Nie2 , Hao Liu2 , Lei Liu1 , Lu Tang1 , Yuan Dong2 , Chuanmin Hu1 ak Huiyan Wang1

1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Lachin.

2 Akademi laboratwa, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Lachin.