Pati Ⅱ: Ekspresyon twòp nan PKD1 ki lakòz maladi ren polikistik
Mar 16, 2022
Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com
Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté, ak Marie Trudel
Mekanis patojèn ki kache yootozomal dominan maladi ren polikistik(ADPKD) rete pou elisidé. Pandan ke gen prèv ki montre PKD1 (maladi ren polikistik 1) ensifizans jèn ak pèt heterozygosity ka lakòz fòmasyon sis nan sourit, paradoksal wo nivo PKD1 (maladi ren polikistik 1) ekspresyon yo te detekte nan ren pasyan ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan). Pou detèmine si PKD1 (maladi ren polikistik 1) genyen nan fonksyon kapab yon pwosesis patojèn, yon PKD1 (maladi ren polikistik 1) bakteri atifisyèl kwomozòm PKD1 (maladi ren polikistik 1)-BAC) te modifye pa recombination omologe pou sèlman vize yon PKD1 soutni (maladi ren polikistik 1) ekspresyon preferans nan ren granmoun. Plizyè liy transjenik yo te pwodwi ki espesyalman overexpressed PKD1 a (maladi ren polikistik 1) transjèn nan ren yo 2- pou 15-pliye sou PKD1 (maladi ren polikistik1) nivo andojèn. Tout sourit transjenik repwodiktif devlope spor tubulaires ak glomerulaire ak ensifizans ren epi yo te mouri nan ensifizans ren. Modèl sa a montre twòp ekspresyon de PKD1 sovaj (maladi ren polikistik 1) pou kont li se ase pou deklanche cystogenesis ki sanble ak ADPKD imen (otozomal dominanmaladi ren polikistik). Rezilta nou yo te dekouvri tou yon ekspresyon c-Myc nan ren ki te ogmante nan sourit ki soti nan tout liy transjenik, sa ki endike ke c-Myc se yon efektè en vivo kritik nan PKD1 la.maladi ren polikistik 1) chemen molekilè. Etid sa a pa sèlman pwodui yon PKD ki gen anpil valè ak premye （maladi ren polikistik） Modèl pou evalye patojèn molekilè ak terapi, men tou bay prèv ke genyen fonksyon ta ka yon mekanis patojèn nan ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan).
KLIKE LA POU PATI Ⅰ
REZILTA
Pwodiksyon PKD1 (maladi ren polikistik 1)-Ac-BAC pa recombinaison homologue. Pou detèmine si PKD1 (maladi ren polikistik 1) genyen nan fonksyon pou kont li se ase yo pwodui fenotip ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan), nou premye izole yon script jenomik ki gen tout PKD1 la (maladi ren polikistik 1) jèn nan yon bibliyotèk vektè BAC 129/Sv. Bibliyotèk sa a te tcheke pa PCR ak de seri primè pou PKD1 (maladi ren polikistik 1) jèn ki kouvri ekson 1 nan fen 5' ak ekson 39 a 40 nan direksyon fen 3'(Fig. 1). Yon script BAC pozitif pou PKD1 a (maladi ren polikistik 1) te idantifye jèn ki enkli tout kò jèn Tsc2 adjasan an. Yo te karakterize an detay PKD1 (maladi ren polycystic 1) pou asire ke estrikti jenomik la matche ak PKD1 andojèn nan (maladi ren polikistik1) jèn souch sourit 129/Sv ki soti nan insert an ak souch enbred C57BL/6J. Kat jenomik PKD1 a (maladi ren polikistik 1) plas nan BAC a ak nan tansyon enbred sa yo pa analiz Southern blot, ak kat dijesyon anzim restriksyon ak sèt sond ki kouvri tout PKD1 la (maladi ren polikistik 1)jèn, te parèt idantik san okenn prèv rearanjman (figi 1). BAC sa a te genyen yon insert -121-ko ki gen ladan ~ 37 kb nan en ak -39 kb nan yon sekans en nan PKD1 la (maladi ren polikistik1) jèn jan yo detèmine pa elektwoforèz ak sekans.
FIG. 2.Pwodiksyon SBPkdlrAc konstwi ak sourit transjenik. (a) Evènman recombination omològ siksesif yo te fèt sou murin Pkdl-BAC pou entwodui de modifikasyon: eleman regilasyon SB yo mete imedyatman en nan kodon inisyasyon Pkdl la ak yon mitasyon pwen an silans nan EcoRI (RI*) ki te prezante nan exon (eg) 10. Vektè recombination BAC a gen yon orijin replikasyon R6Ky, yon jèn ki reziste anpisilin, yon jèn SacB, yon jèn RecA, ak yon sit inik klonaj Smal kote eleman regilasyon "SB" yo (oswa mitasyon pwen silans exon 10 la) yo te klonaj. ak antoure bra jèn Pkd1. Vektè recombination BAC te electroporated nan selil E, coli (DH10B) ki gen kalite sovaj Pkdl-BAC, epi apre seleksyon an, yon premye evènman recombination omologe te fèt atravè youn nan de bra Pkd1 pou pwodwi BAC kointegrate. Yo te elimine vektè recombinasyon an ak rejyon Pkdl doub nan kointegrate BAC yo nan yon dezyèm etap seleksyon. Pkdl-BAC ki rezoud yo ka swa retounen nan kalite sovaj oswa enkli modifikasyon ki gen entansyon an. Lè sa a, yo ka entwodui rekonbinasyon omològ ki vin apre nan BAC ki fèk modifye a.(b)(ienomc ADN ot SBPkd l-etransgenic mxce te anakZed bv Sou thern blot.AVicToiD1ecLon nan fragman linearize ki te lakòz ensèsyon transgene a nan yon tèt-a-tèt. -a-ke, ak/oswa ke-a-ke oryantasyon. 5'end la te analize pa dijesyon nan ADN jenomik ak HindIII ak ibrid ak pwofonde espesifik transgene SB a (panèl gòch). Tout twa liy sourit transjenik te pwodwi 10 yo te espere .9-kb bann pou ensèsyon tèt-a-ke; bann adisyonèl yo obsève nan liy 39 gen plis chans reprezante yon fragman junction ant SB ak genòm sourit la. Entegrite entèn transjèn nan te kontwole pa plizyè dijesyon anzim restriksyon, epi yon sèl tach reprezantan ADN jenomik dijere ak EcoRI ak ibrid ak sond Pkdl la (ekson 7-15) yo montre (panèl mitan).
SBPKD1 sa a (maladi ren polikistik 1)-Klon BAC te modifye pa de evènman recombination homologue siksesif nan E. coli. Yo te make jèn PKD1 (maladi ren polikistik 1) nan exon 10 lè yo ranplase yon nukleotid (G rive A) pou kreye yon nouvo sit EcoRI nan pozisyon 2355 sou kat jeyografik cDNA a. Mitasyon pwen an silans sa a te pwodwi pou distenge PKD1 (maladi ren polikistik 1) jèn ak transkripsyon BAC a soti nan orijin andojèn. Anplis de sa, nou te ranplase 5'eleman regilasyon nan PKD1 la (maladi ren polikistik 1)-BAC jèn lè w pran avantaj de eleman espesifik epitelyal ren "SB" ki te idantifye deja nan SBM (ki lye ak c-Myc) oswa SBF ki lye ak c-fos) konstwi-trans-jèn pou limite ekspresyon nan ren yo (36, 38)(figi 2a).
Nouvo SBPkdlrAG-BAC sa a te dijere ak NotL, yon sit inik ki sitiye imedyatman en eleman SB yo, ak ClaI nan kò jèn Tsc2, tronke eleman regilasyon Tsc2 ak 5'mwatye kò jèn pou asire mank T'sc2. ekspresyon ekzojèn nan tout tisi yo epi retire sekans vektè BAC prokaryotik (Fig.1 ak 2). Fragman linearize 70-kb NotI-ClaI sa a te izole, pirifye. ak quantifier pou microinjection oosit (36).
BENEFIS CISTANCHE: TRETE MALADI REN
Pwodiksyon ak analiz sourit transjenik SBPkdl-ac. Kat fondatè transjenik ki pote plizyè kopi transjèn SBPkdlrAc toujou devlope PKD. Soti nan kat SBPKD1 la (maladi ren polikistik 1)sourit fondatè RAC detèmine pa analiz Sid, twa SBPKD1 (maladi ren polikistik 1)Liy transjenik TAG yo te etabli ak de a nèf kopi transjèn nan (figi 2b). Karakterizasyon entegrite transjèn nan liy sa yo te kontwole ak 5', entèn, ak 3'sond jan yo montre nan egzanp reprezantan nan Fig.2b. Liy transjenik revele ak 5'"SB" sonde a yon bann nan 10.9 kb ki konsistan avèk SBPkdlrAc la. trans-jene ke yo te entegre nan yon oryantasyon tèt-a-ke ak revele ak sonde 3' yon bann 7.1-kb (Fig.2b). Anplis de sa, sond entèn la te detekte 9.4-kb andojèn PKD1 (maladi ren polikistik 1) ansanm ak 6.9-kb ak 2.5-kb transjèn yo. akòz sit la ensèsyon EcoRI nan exon 10 (Fig. 2b). Sourit sa yo te genyen kopi konplè transjèn ki baze sou analiz estrikti sipèpoze jenomik la.
PKD1 (maladi ren polikistik 1) genyen nan fonksyon nan sourit transjenik SBPkdl-Ac adilt. Ekspresyon SBPkdl-AG la. transjèn ak PKD1 (maladi ren polikistik 1) yo te envestige jèn nan divès ògàn. Kantifikasyon nivo transkripsyon ki soti nan transjèn ak / oswa jèn andojèn yo te fèt pa analiz Northern blot (figi 3a). Kòm espere, transgene ak transkripsyon jèn andojèn yo te gen menm longè (14.2 kb). Dapre ekspresyon kontwòl GAPDH, ren ki soti nan tout liy sourit SBPkd 1 A te toujou ogmante ekspresyon transkripsyon an konpare ak PKD1 nòmal (maladi ren polikistik 1) nivo nan ren granmoun (n=3) ki gen menm laj. Transjèn ren ak ekspresyon andojèn pou diferan liy transjenik yo parèt yon seri 2- a 15-pliye pi wo pase kontwòl ren PKD1 andojèn.(maladi ren polikistik 1)nivo (Fig.3a). Patikilyèman, liy transjenik39 (n=4) te montre pi wo PKD1 (maladi ren polikistik 1) nivo pase liy 3 (n=3) ak 41 (n=4).Anplis de sa, PKD1 (maladi ren polikistik 1)nivo ekspresyon yo mezire pa analiz Northern blot ki gen rapò ak sa yo jwenn pa PCR an tan reyèl lè l sèvi avèk primè nan ekson 1 ak 2 (figi 3b).
FIG.3.Analiz ekspresyon ren nan sourit SBPkdlrA. (a) Analiz ekspresyon de Pkd1 endogenous (endo) ak SBPkdlrA transgene (Tg) transkripsyon nan ren ki soti nan twa liy transjenik pa Northern blotting. Yo te konpare de echantiyon ki soti nan chak liy transjenik, 3,39, ak 41 ak transkripsyon Pkdl ren andojèn sourit nòmal kontwòl laj matche ak ki soti nan menm background jenetik (C5BI 6I × CBA/DE, echantiyon RNA nan ren yo te jwenn nan sourit transjenik anvan yo). maladi ren nan etap final la. Transkripsyon ki soti nan endo ak Tg yo tou de -14.2 kb nan longè. Yo te obsève yon twòp ekspresyon sistematik nan transkripsyon yo nan ren tout sourit transjenik parapò ak kontwòl ki pa transjenik yo. Yo te itilize GAPDH kòm yon kontwòl entèn. Kantifikasyon ekspresyon ren nan sourit transjenik sa yo te varye ant 2- ak 15-pliye parapò ak nivo Pkd1endogenous soti nan sourit kontwòl abitrèman mete nan 1. (b) Reprezantasyon chematik nan SBPkdl-. transjèn ak primè yo te itilize pou anplifye Pkdl total ki gen ladan andojèn ak transjèn (ekson 1 ak ekson 2) epi sèlman transjèn Pkd1 (B. exon 2) pa PCR an tan reyèl ak semiquantitative RT-PCR, analiz RT-PCR nan ekspresyon transjèn SBPkdlAc la te quantifye nan ren. ak siplemantè tisi ren yo. Yo montre yon evalyasyon semiquantitative reprezantan SBPkdl.Ac transgene (Tg) ki gen ladann yon echantiyon tisi ren (K) soti nan yon sourit nan tout twa liy transjenik (3. 39, ak 41) ak nan tisi ekstrarenal. H, kè; Lu, poumon; B. sèvo; Li, fwa; ak S. larat soti nan yon sourit nan liy 39. Ekspresyon transjèn nan fasil detekte nan ren yo nan tout sourit transjenik, tandiske li se ba a endeslabl nan tisi ekstrarenal yo. Ekspresyon nan transjèn SBPkd1rAc te pwodui yon anplikon 307-bp espesifik, tandiske kontwòl entèn S16 la te pwodwi yon anplikon 102-bp. M,100-bp makè; H, O, kontwòl negatif pou anplifikasyon PCR. (c) an tan reyèl analiz ekspresyon PCR nan SBPkdlr la. Transgene a te detèmine nan plizyè sourit endepandan. Transjèn SBPkdl.Ac ki soti nan twa liy sourit transjenik 3 (n=5), 39 (n =7), ak 41 (n=5) te montre ke liy 39 ak 41 te gen pi wo a. nivo ekspresyon ren yo. Ekspresyon transjèn SBPkdlrAc nan tisi ekstrarenal soti nan sourit (n=3) nan twa liy transjenik yo te evalye pa PCR an tan reyèl. An konparezon ak ren yo nan chak liy transjenik (100 pousan), analiz de tisi ekstrarenal yo te montre ke nivo ekspresyon transjèn yo te toujou pi ba nan 10- a 1,{000-pliye nan sèvo a, kè, fwa, pankreyas. , larat, ak poumon. (d) Ekspresyon jèn c-mc andojèn nan ren SBPkdl.Ac pa semiquantitative RT-PCR. Yon ilistrasyon chematik montre primè yo itilize pou anplifye c-Myc. Kòm espere, ekspresyon de c-Myc se minim nan ren adilt ki pa transjenik (kontwòl). Kontrèman, ogmante ekspresyon de c-Mye detekte nan tout ren granmoun SBPkdlrAc nan twa liy yo, jan yo obsève nan ren SBM transjenik adilt yo itilize kòm yon. kontwòl pozitif. Anplikon c-Myc te 250 bp; anplikon nan S16, yon kontwòl entèn, te 102 bp.M, 100-bp makè.
Kantifikasyon nivo ekspresyon transjèn yo espesyalman te fèt pa PCR an tan reyèl ak RT-PCR semiquantitative nan twa liy transjenik yo nan laj granmoun lè l sèvi avèk primè nan rejyon an 5'untranslated (B, -globin pwomotè) ak nan exon 2 nan PKD1. (maladi ren polikistik 1)(Fig.3b). SBPKD1 a (maladi ren polikistik 1) Ekspresyon RAC nan sourit transjenik yo te konpare ak pwodwi jèn pwoteyin ribosomal S16 kòm yon estanda entèn. Kondisyon yo itilize pou anplifikasyon semiquantitative RT-PCR yo te nan seri lineyè a. Ekspresyon transjèn pa PCR an tan reyèl ak RT-PCR semiquantitative toujou e espesyalman te montre ekspresyon ki pi wo a nan ren nan tout liy transjenik ki gen rapò ak lòt ògàn (Fig. 3b ak c). Nivo ekspresyon ren pou yon echantiyon endividyèl yo te repwodiktif ak nenpòt nan teknik deteksyon yo itilize. Nivo ki pi wo nan PKD1 (maladi ren polikistik 1) ekspresyon ren transjèn yo te mezire pou liy 39 ak 41. Pou kontwole si ogmante ekspresyon PKD1 (maladi ren polikistik 1) te soti nan transjèn oswa jèn endojèn nan, yo te konpare menm gwoup sourit ki soti nan twa liy transjenik yo pou PKD1 ren. maladi ren polikistik 1) ekspresyon transjèn ak pou ren PKD1 (maladi ren polikistik 1) total (transjèn ak andojèn) ekspresyon pa PCR an tan reyèl. Enteresan. liy 39 ak 41 parapò ak liy 3 te montre ke ogmante PKD1 (maladi ren polikistik 1)ekspresyon ren transjèn te sanble ak oswa pi wo a PKD1 (maladi ren polikistik 1) ekspresyon total ren, lonje dwèt sou transjèn nan kòm responsab espesyalman pou ekspresyon pwovoke sa a. Nan divès ògàn (ki gen ladan kè, poumon, sèvo, fwa, pankreyas, ak larat), SBPKD1 (maladi ren polikistik 1) RAC; transgene te montre trè fèb ekspresyon okazyon-ally detekte nan larat ak nan poumon, ak ti ekspresyon detektab nan lòt ògàn (figi 3b). Kantifikasyon pa PCR an tan reyèl demontre yon nivo 10-a 1,000-pi ba nan ekspresyon transjèn nan tisi ekstrarenal parapò ak ekspresyon ren (figi 3c). Eleman regilasyon "SB" transgene SBPkdlrAc te bay ekspresyon preferansyèl ren; distribisyon ògàn patikilye sa a te detèmine tou lè yo itilize nan transjèn ki lye ak c-Myc (SBM) ak c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, yon efèktè en nan PKD1 (maladi ren polikistik 1) siyal chemen nan SBPkdlrAc: sourit. Pou jwenn yon insight sou mekanis patojèn intraselilè sourit transjenik SBPkdlrAc, nou te chèche kontwole nivo ekspresyon ren c-Myc ki baze sou obsèvasyon anvan nou an nan déréglementation c-Myc nan ren ADPKD imen (maladi ren polikistik dominan otozomal) (22). Analiz ren yo te fèt nan tout twa liy transjenik 3 (n=4).39 (n=7), ak 41 (n =4) osi byen ke kontwòl (n {{9}). }}). Jan yo montre nan Fig.3d, gen yon ekspresyon sibstansyèl nan andojèn c-Mye pwovoke nan sourit SBPkdlrAa parapò ak sourit kontwòl ki gen laj menm jan an. Enteresan, nivo ekspresyon c-Myc nan kèk ren SBPkdlrAG, an patikilye liy 39, te rive nan nivo ki konparab ak sa yo obsève nan modèl sourit transjenik PKD SBM ki te pwodwi pa ekspresyon ren c-Myc.
Anomali ren nan SBPKD1 (maladi ren polikistik 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 pou chak liy) devlope plizyè tubulaires (T) ak spor glomerulaire (G) (Fig.4d, f, ak g). Yo te obsève spor nan tubul ki soti nan rejyon kortik ak medulè yo ansanm ak kolekte tubul ki soti nan papil la (figi 4d ak e). Sourit transjenik parèt ipèrplasi epitelyal tubulaires (tèt flèch) ki enplike tou de tubul sistik ak ki pa sistik ak ipèrtrofi souvan (figi 4g ak h). men gravite a varye ant sourit endividyèl yo. Entèrstitis fibwoz (F). enfiltre lenfoyid perivasculaire, ak jete pwoteyin (P) yo te obsève souvan (Fig. 4d ak e)
Fig. 4
Pou pi presizeman defini sit lokalizasyon ogmante PKD1 (maladi ren polikistik 1)ekspresyon nan ren yo, nou te fè ibridizasyon in situ lè l sèvi avèk ekson 36-45 pwofonde yo te itilize deja (16). Siyal ibridizasyon an te lokalize espesyalman nan selil epitelyal ki kouvri sil ak tib ipèrplastik ak spor glomerulèr. Anplis de sa, kèk siyal yo te wè sou epithelium a nan noncystic oswa yon ti kras dilate tubules, gen anpil chans idantifye tubules predestine sibi chanjman sistik nan lavni (Fig. 4i ak j). Analiz istolojik ren yo te fèt tou sou sourit transjenik nan nesans (n=8), jou apre akouchman 10 (P10) (n=3), P20 (n=5), P35 (n{). {10}}), ak P45(n= 3) an konparezon ak konpayon negatif nan menm gwoup laj la (n =2 a 4). Sa ki enteresan, tout sourit transjenik ki fèk fèt yo te montre dilatasyon tubulaire ak glomerulaire parapò ak kontwole littermates negatif (Fig. 4k ak 1), ki endike ke anomali ren inisye nan matris jan yo obsève nan sourit SBM ak nan ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan) pasyan yo. Dilatasyon nan tubulaires ak glomerular ogmante nan gwosè ak kantite ak laj pwogresif. Pa P35, sourit transjenik parèt pi grav ipèrplasi ak prèv glomerulosclerosis Chanje fonksyon fizyolojik ren nan sourit SBPkdlrsc. Fonksyon fizyolojik nan ren tout sourit transjenik parèt karakteristik ki sanble ak PKD, pandan y ap littermates ki pa transjenik yo pa janm devlope maladi a. Nan kèk mwa apre nesans, bèt ki afekte yo devlope ensifizans ren kwonik. Bèt sa yo te kontwole paramèt fonksyonèl ren pa mezi nan serom ak nivo urin. Azòt ure nan san (BUN) ak kreyatinin, osmolalite pipi, pwoteyin pipi, ak eskresyon iyon (Tablo 1). Tout sourit ki soti nan twa liy yo konpare ak kontwòl parèt defo konsantrasyon, yon konklizyon komen nan ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan). ak konsekans te montre diminye BUN urin. kreyatinin, pwoteyin, ak konsantrasyon fè. Transgenik SBPKD1 (maladi ren polikistik 1)rAc.fondatè ak pitit pitit (n=6) ki soti nan chak liy yo te kontwole kalitatif pou proteinuria sou echantiyon pipi pa SDS-PAGE (Fig. 5). Sourit ki gen plis pase 2 mwa te montre proteinuria nonselective ki te pwogrese ak laj. Anplis de sa, nivo BUN nan serik ak kreyatinin serik yo te ogmante, revele ensifizans ren (Tablo 2). Paske ensifizans ren kwonik souvan mennen nan chanjman nan paramèt ematolojik, yo te egzamine sa yo nan sourit transjenik SBPkdlAc ki gen 3 a 14 mwa (Tablo 2). Sourit transjenik sa yo te anemik kòm evidans siyifikativman diminye kantite globil wouj nan san, ak emoglobin ak ematokrit rive nan mwatye nivo nòmal yo. Lòt paramèt globil wouj, tankou pousantaj retikulosit, pa te afekte, jan yo te espere lè yo te pwovoke pa yon defo ren. Bèt sa yo te toujou mouri nan ensifizans renal nan -5.9± 2.8 mwa ki gen laj (n {{12} }) pou liy trans-jenik 39 ak nan laj pita, -14.6± 3.1 mwa (n{= 20)ak{-11.7 ±6.5 mwa (n=7) ,pou liy 3 ak 41,respektivman.
EFÈ CISTANCHE: TRETE MALADI REN
DISKISYON
Isit la nou rapòte izolasyon ak karakterizasyon yon PKD1 murin (maladi ren polikistik 1)-BAC. PKD1 sa a (maladi ren polikistik 1) jèn yo te make ak eleman regilasyon yo te ranplase yo vize ekspresyon espesyalman nan ren yo pa de evènman recombination omologe siksesif. Sourit transjenik ki te pwodwi ak jèn SBPkdlrAG sa a te montre yon ogmantasyon 2-a 15-pliye nan ekspresyon PKD1 (maladi ren polikistik 1) epi yo te devlope yon fason repwodiktif byen bonè chanjman mòfolojik ren tipik PKD. Ensifizans ren parèt nan mitan laj, ak sourit mouri prematireman nan ensifizans ren. Rezilta nou yo tou endike ke PKD1 (maladi ren polikistik 1) mekanis ekspresyon ki responsab pou fenotip sa a se medyatè pa siyal aktivasyon c-Myc nan vivo. Etid sa a demontre ke PKD1 murin (maladi ren polikistik 1) genyen fonksyon nan ren yo ase pou pwodui yon fenotip ren PKD.
Depi murin PKD1 a (maladi ren polikistik 1) jèn pa kopi jan li ye nan imen (27), nou te dirèkteman idantifye ak izole yon script BAC ki genyen tout PKD1 la (maladi ren polikistik 1) jèn. Konplete karakterizasyon PKD1 murin 129/Sv (maladi ren polikistik 1)-BAC. konparezon endirèk ak de lòt tansyon sourit enbred konfime entegrite PKD1 (maladi ren polikistik 1). PKD1 a (maladi ren polikistik 1)-BACinsert te genyen-37 jiska 39 kb sekans en ak en sekans nan jèn PKD1 (maladi ren polikistik 1). Analiz nou an te demontre ke PKD1 (maladi ren polikistik 1) jèn nan BAC sa a se te yon bon fwa murine kalite sovaj ki ta ka sèvi pou plis etid.
Malgre ke gen gwo prèv ki montre fòmasyon si nan ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan) ka lakòz pèt eterozigoz apre inaktivasyon somatik PKD1 nòmal la (maladi ren polikistik 1) alèl (3.21.32), gen tou prèv sigjesyon pou soutni oswa menm ogmante ekspresyon polycystin-1 nan epithelium a tubulaires sistik (22.29). Dènye obsèvasyon an soulve kesyon si wi ou non ekspresyon de PKD1 (maladi ren polikistik 1) poukont li se yon kòz ase proximite nan cystogenesis. Nan sourit transjenik ki gen PKD1 imen an (maladi ren polikistik 1), TSC2. RAB26. Jèn NTHL1 ak SLC9A3R2, sèlman yon minorite nan sourit devlope spor e pa gen youn ki te gen ekspresyon transjèn detektab nan adilt malgre 30 kopi transjèn nan (31). Nan sourit transjenik sa yo. li te difisil pou etabli yon wòl klè pou PKD1 (maladi ren polycystic 1) twòp ekspresyon nan cystogenesis. Modèl nou an diferan, kòm de a nèf kopi sovaj PKD1 (maladi ren polikistik 1) pou kont li, san jèn vwazen, yo te entegre nan sourit transjenik. Depi jèn PKD1 (maladi ren polikistik 1) gen fonksyon esansyèl nan divès ògàn oswa tisi, jan sa dekri pou anpil sourit ak ablasyon jèn PKD1 (maladi ren polikistik 1), yon ekspresyon sistemik PKD1 (.maladi ren polikistik 1) ta ka mennen nan efè konfizyon adisyonèl. Kontinwe, nou te adrese wòl PKD1 (maladi ren polikistik 1) genyen nan fonksyon lè l sèvi avèk yon apwòch ki vize PKD1 (maladi ren polikistik 1) espesyalman nan ren yo. Pa recombinaison omologe, nou te premye ranplase PKD1 (maladi ren polycystic 1) en rejyon regilasyon an ak "SB" eleman regilasyon ren yo, kidonk anpeche ekspresyon jèn nan diminye nòmalman wè pou PKD1 (maladi ren polikistik 1)nan adilt kòm byen ke potansyèl segondè kòmantè bouk règleman (36,38). Dezyèmman, nou te make murin PKD1 (maladi ren polikistik 1) transjèn (Pkdlr) ak yon mitasyon pwen an silans nan exon 10 men pa t 'insert yon tag epitop pou asire ke yon totalman fonksyonèl pwoteyin "tip sovaj" ak estrikti konsève ak entegrite ta dwe pwodwi. Soti nan BAC modifye sa a, yo te pirifye yon fragman SBPkdlrAG lwen jèn Tsc2 ak vektè BAC pou anpeche entèferans jèn Tsc2, ki kapab tou pwovoke yon fenotip sistik (8.20.28). osi byen ke pou evite efè inhibition nan sekans prokaryotic(5).
Kat sourit fondatè SBPkdlrActransgenic diferan ak twa liy endepandan yo te pwodwi ak PKD1 ren espesifik (maladi ren polikistik 1)-enhanced espresyon. Patikilyèman frape se penetrasyon konplè fenotip la nan sourit transjenik sa yo. SBPKD1 a (maladi ren polikistik 1) rAc fondatè ak liy sourit pataje plizyè karakteristik fizyopatolojik an komen ak ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan). Men sa yo enkli devlopman spor nan cortical a, medul, ak glomeruli ansanm ak ipèrplasi epitelyal, fibwoz entèrstisyèl, ak enflamasyon entèrstisyal fokal.
Paske fenotip PKD la te toujou obsève nan tout diferan sourit fondatè transjenik ak entegrasyon transjèn nan genomic sourit la se yon fenomèn o aza, fenotip la pa ka soti nan efè pozisyon kwomozomik men sèlman nan ogmante PKD1 (maladi ren polikistik 1)ekspresyon. Vreman vre, ekspresyon transgene PKD1 (maladi ren polikistik 1) nan tout liy yo te demontre yo dwe restriksyon nan ren. jan yo te obsève deja pou lòt transgenes reglemante pa "SB" eleman yo (36,38). Anplis, sa a ogmante ekspresyon PKD1 (maladi ren polikistik 1) ki te koze pa transjèn nan epi pa yon endirèk PKD1 andojèn (maladi ren polikistik 1) aktivasyon. Pakonsekan, rezilta nou yo bay prèv klè ke genyen nan fonksyon nan yon kalite sovaj fonksyonèl PKD1 (maladi ren polikistik 1) ka pwodwi plizyè spor ren. Sa ki enpòtan, pratik sa yo SBPKD1 (maladi ren polikistik 1) konstitye premye modèl sourit ki te pwodwi pa sèl ekspresyon òtològ sourit PKD1 imen an (maladi ren polikistik 1) jèn.
Sourit SBPkdl-Ac yo demontre ke PKD1 (maladi ren polikistik 1)Surekspresyon se yon mekanis patojèn prensipal nan sistojenèz ren. Sa ki enpòtan, pi wo nivo ekspresyon transjèn yo nan ren yo te parèt korelasyon ak pwogresyon ak severite fenotip la. Nou te jwenn tou ke PKD1 (maladi ren polikistik 1) twòp ekspresyon nan devlopman SBPKD1 (maladi ren polikistik 1)-Ac fenotip gen chans rive nan siyal aktivasyon nan c-Myc nan vivo. Li posib, deklanchman sa a ta ka menm dirèk atravè ke polycystin-1 C-tèminal ki anba klivaj pwoteolitik ak translokasyon nikleyè (7). ta trè konsistan pou sipòte c-Myc kòm yon gwo efèktè en nan PKD1 (maladi ren polikistik 1) siyal wout Rezilta sa a tou korelasyon ak rezilta anvan nou yo nan ogmante ekspresyon c-Myc nan ren nan tout ADPKD imen (maladi ren polikistik otozomal dominan) analize (22), An jeneral, rezilta sa yo endike ke c-Mye se yon medyatè prensipal nan PKD1. (maladi ren polikistik 1)sistojenèz.
Rezilta nou yo soti nan PKD1 la (maladi ren polikistik 1) Modèl genyen-of-fonksyon, ansanm ak murin PKD1 (maladi ren polikistik 1) haploinsuffisance ak pèt fonksyon, endike ke nenpòt PKD1 (maladi ren polikistik 1) dysregulation ta ka mennen nan cystogenesis (2.19.23-26.31.40). Dezekilib grav PKD1 (maladi ren polikistik 1) nan sourit pwovoke pa PKD1 (maladi ren polikistik 1) ablation oswa transjenik twòp ekspresyon ki te koze kòmansman bonè ak pwogresyon rapid nan spor ren ak afekte yon gwo pwopòsyon nan tubules. Kontrèman, yon PKD1 ki pi modere (maladi ren polikistik 1) move balans tankou haploinsufficiency te mennen nan yon pwogresyon pi dousman nan PKD ak plis spor fokal. Devlopman paradoks aparan nan yon fenotip menm jan an pa mwayen disregulation opoze polycystin-1 ka eksplike pa rezilta komen an, sètadi yon move balans konsantrasyon pwoteyin relatif ki ta ka chanje fòmasyon an oswa fonksyon an nan yon konplèks polycystin multiprotein aktif. Ansanm, rezilta nou yo ak rezilta lòt envestigatè yo diskite ke mekanis fòmasyon sis nan ADPKD (maladi ren polikistik otozomal dominan) gen anpil chans rive nan twa mekanis patojèn: genyen nan fonksyon, pèt nan fonksyon, ak efè dòz jèn.
Roman SBPkdlrAc la; sourit yo konstitye yon modèl pwisan nan sistogenesis ren ki ka bay gwo apèsi sou fizyopatoloji PKD, PKD1 (maladi ren polikistik 1) chemen transduction siyal, ak patnè kominike. Etid la nan modèl sa a ka mennen tou nan devlopman nan nouvo estrateji terapetik retabli balans pwoteyin nòmal nan PKD1 la.maladi ren polikistik 1) konplèks multimerik.
Cistanche trete maladi ren ak amelyore fonksyon ren
REFERANS
1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, M E. De Paepe, M. Surrette, AM. Beau. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos, and M. Trudel. 2000. Koreksyon jenetik maladi falsifòmasyon: apèsi lè l sèvi avèk modèl sourit transjenik Nat. Med.17-182.
2 Boulter, C, S.Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle, ak R. Sandford. 2001.Kadyo-vaskilè, skelèt. ak domaj ren nan sourit ak yon dezòd vize nan PKD1 la (maladi ren polikistik 1)jen. Pwosedi. Natl.Acad. Sci. USA 9812174-12179.
3. Brasier, JL, ak EPHenske.1997. Pèt lamaladi ren polikistik(PKD1）rejyon kwomozòm 1φp13 nan selil kis ren sipòte yon modèl pèt fonksyon pou patojèn sis. J. Clin. Investig.99: 194-199.
4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR.Petry,TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker,R ML Hakim,G. ML Landes,KW Klinger,F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino, and N. A Doggett.1995.Anay sis of the genomic sekans for themaladi ren polikistik otozomal dominanjèn predi prezans yon repetisyon leucine ki rich. Hum Mol, Genet.4-575-58.
5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy, ak F.Costantini. 1985. Ekspresyon espesifik yon jèn globin etranje nan selil erythroid sourit transjenik Nature 337-380.
6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst,GG Germino, ak M.-C. Gubler.2002.Ekspresyon transkripsyon PKDI ak PKD2 ak pwoteyin nan anbriyon imen an ak pandan devlopman nòmal nan ren. Am. J.Pathol. 160973-983.
7.Chaurvet,V, X Tian, H.Husson, DH Grimm,T.Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya,S.Somlo, ak MJ Caplan.2004 Mechanical stimuli pwovoke klivaj ak nikleyè translokasyon tèminal pobeystin-1 C.J. Cin.Investig 114:1433-1443.
8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson, ak DJ Kwiatkowski 2000. Molekilè avanse jenetik nan tuberous sclerosis. Hum. Genet10797-114.
9. Consortium, EPKD1993. Idantifikasyon ak karakterizasyon jèn sclerosis tuberous la sou kwomozòm 16.Cell75:1305-1315.
10. Consortium, EPKD1994.Themaladi ren polikistik 1jèn kode tout bagay ki transkrizib nan yon rejyon ki kopi sou Selil kwomozòm 16 7781-894.
11. Consortium, L PK D 1995.Maladi ren polikistik: estrikti konplè PKD1 la (maladi ren polikistik1) jèn ak pwoteyin li yo. Se 81:289-298
12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V.DAgati, and M. Trudel.2002. c-Myc-pwovoke apoptoz nanmaladi ren polikistikse endepandan de entèraksyon FasL/Fas. Kansè Res. 62:2210-2214.
13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Yon modèl glomerulopathy drepanopati imen. Kidney Int. 46:1337-1345.
14. GengL,Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei,F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders, ak J.Zhou. 1996.Idantifikasyon ak lokalizasyon nan Polyester, PKD1 a (maladi ren polikistik 1) pwodwi jèn. J. Clin. Investig. 98-2674-2682
