Pati 1: Yon nouvo apwòch pou amelyore potansyèl rejenerasyon nan sikile selil andotelyo ansèyman nan pasyan ki gen maladi ren nan etap fen.

Pou plis enfòmasyon. kontaktetina.xiang@wecistanche.com

Résumé: Selil progenitor endothelial ki sòti nan mwèl zo ki sikile (EPCs) fasilite reparasyon vaskilè nan plizyè ògàn ki gen ladan ren an, men yo piti piti diminye nan etap final la.maladi ren(ESKD) pasyan yo, ki gen rapò ak rezilta kadyovaskilè ak mòtalite ki gen rapò. Se konsa, nou te detèmine si amelyore efè tisi-reparasyon nan mwèl zo imen ki sòti nan selil stromal mesenchymal (BM-MSCs) ak efè yo vasculogenic nan recombinant moun relaxin (RLX) ta ka ankouraje pwopagasyon EPC ak fonksyon. CD34 plis EPC yo te izole nan san an nan pasyan an sante ak ESKD, kiltive jiskaske EPCs an reta te fòme, Lè sa a, ankouraje ak BM-MSC ki sòti nan kondisyon medya (CM; 25 pousan o), RLX (1 oswa 10ng / mL), oswa toude. tretman konbine. Pandan ke RLX pou kont li te ankouraje pwopagasyon EPC, fòmasyon tib kapilè ak geri blesi an vitro, mezi sa yo te pi rapid ak ansibleman amelyore pa efè konbine nan BM-MSC-sòti CM ak RLX nan EPCs ki sòti nan tou de pasyan an sante ak ESKD. Konklizyon sa yo gen enplikasyon klinik enpòtan, yo te idantifye yon terapi konbinezon roman ki ka retabli ak amelyore nimewo EPC ak fonksyon nan pasyan ESKD.

Mo kle: selil progenitor andothelial; maladi ren fen etap; selil souch mesenchymal ki sòti nan mwèl zo yo; detann; geri blesi; anjojenèz; rejenerasyon

Klike la a pou aprann plis sou cistanche pou vann

1. Entwodiksyon

Maladi ren kwonik(CKD) se yon pwoblèm sante mondyal, ki defini kòm yon rediksyon nan to filtraj glomerulè (GFR) mwens pase oswa egal a 60mL/min/1.73m², ki souvan mennen nan etap final (etap V) maladi ren (ESKD; defini kòm GFR mwens pase oswa egal a 15 mL/min/1.73m2)[2]. Karakteristik yo patolojik nan CKD gen ladan atrofi tubulaires ki asosye ak rediksyon nan kapilè ren ak podosit, destriksyon nan selil endothelial ren, ak devlopman nan.fibwoz ren[3,4]. Endothelium nan ren konpwomèt pandan pwosesis sa yo, ki mennen nan anjyogenesis andikape ak fonksyon ren [5]. Swivandomaj nan ren, Selil progenitor endothelial ki sòti nan mwèl zo yo (EPCs) yo rekrite nan sit aksidan pou fasilite reparasyon tisi [6]. EPC yo jwe yon wòl enpòtan nan spirasyon ak pwopagasyon selil andotelyo ren yo, entegrite vaskilè, ak reparasyon andotelyo domaje a. Sepandan, nimewo EPC k ap sikile yo ap redwi piti piti nan pasyan ESKD [7-9], ki gen rapò ak rezilta negatif kadyovaskilè [9,10] ak mòtalite alontèm.

Selil stromal mesenchymal (MSCs) yo te rapòte ankouraje anjojenèz pa ankouraje pwogram EPC. Sepandan, pandan ke MSC yo te evalye nan divès esè klinik [13], kapasite yo nan fasilite rejenerasyon andotelyal ren pa te envestige. Dènye etid ki soti nan laboratwa nou an te idantifye potansyèl terapetik amelyore nan konbine MSC ki sòti nan mwèl zo imen (BM) ak yon ajan anti-fibrotik, sètadi recombinant moun (jèn -2) relaksin (serelaxin; RLX [14) nan amelyore. domaj nan ren,enflamasyonak fibwoz nan modèl preklinik nan maladi. Pandan ke RLX pou kont li ka ankouraje pwopagasyon EPC ki sòti nan san moun ak pwodiksyon oksid nitrique (NO) an vitro, ak vaskulogenèz nan sourit nan vivo[18], li rete enkoni si efè konbine li yo ak BM-MSCs ta ka akselere ak / oswa amelyore EPC- anjyogenesis ki sòti ak geri blesi. Etid sa a konsa, evalye potansyèl la terapetik nan konbine RLX ak BM-MSC-sòti medya kondisyone (CM) sou sante kont ESKD pasyan ki sòti pwopagasyon EPC, anjojenèz, ak geri blesi nan vitro.

2. Materyèl ak Metòd

2.1.EPC Izolasyon ak Kilti soti nan san periferik

Lè yo resevwa yon fòm konsantman pasyan ki siyen, yo te ranmase anviwon {{0}} mL san ki soti nan kontwòl gason ki an sante nan Sèvis San Lakwa Wouj Ostralyen an. Kontrèman, sèlman ~5 mL maksimòm san pasyan gason ESKD yo te ranmase nan Sant Medikal Monash akòz kondisyon sante yo. Tout echantiyon san yo te trete nan 24 èdtan apre tan koleksyon an. Tout echantiyon san yo te dilye ak 1 × solisyon balanse sèl Hank (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) nan yon volim total de 20 mL. Lè sa a, san an te ak anpil atansyon kouch sou 15 mL Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Upsala, Sweden) nan yon tib Falcon 50 ml (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) epi santrifuje nan 400 ×. g pou 40 minit nan tanperati chanm pou separe rad buffy la ak lòt konpozan lè l sèvi avèk yon metòd separasyon gradyan dansite jan yo dekri deja [19,20]. Apre separasyon gradyan an, yo te retire kouch anwo a ki gen plasma ak plakèt lè w mete yon pipèt serolojik ak anpil atansyon, kite rad buffy ki gen selil mononikleyè ki soti nan san periferik (PBMCs) san deranje, ki fòme ak selil ansèn endothelial (EPCs). Yo te repoze granules la nan 2 ml Endothelial Cell Growth Media (EGM) -2 Microvascular (MV)Bullet Twous (pwodwi #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); complétée ak 5 pousan serom fetal bovine (FBS), 0.04 pousan idrokortizon, 0.4 pousan faktè kwasans fibroblast imen (hFGF), ak 0.1 pousan faktè kwasans endothelial vaskilè (VEGF), R3-faktè kwasans ensilin-like (IGF). )-1, asid ascorbic, faktè kwasans epidèm imen (hEGF), ak silfat gentamicin/amphotericin (GA-1000), pou kiltive EPC izole. Selil yo te konte lè l sèvi avèk yon CountersM Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) anvan yo te simen sou plak kilti fibronectin-kouvwi / flakon.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 selil/koloni) lè l sèvi avèk tès inite ki fòme koloni (CFU).

2.2. Preparasyon nan medya kondisyone (CM) soti nan kiltive BM-MSC

Kòm adisyon nan BM-MSCs nan kilti EPC ta konpwomèt pwen final yo ki asosye ak EPC yo dwe mezire, li te deside ke li ta pi bon analize efè yo nan BM-MSC-sòti CM sou fonksyon EPC, jan yo te itilize anvan pou analiz la. nan lòt pwen final [19]. Yon ti tan, BM-MSC yo te grandi nan Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Ostrali), konplete ak 16 pousan serom fetal bovine (FBS) ak 1 pousan 200 mM. L-glutamin, ak 1 pousan penisilin / streptomycin. Yon fwa selil yo te rive nan ~ 80 pousan konfluans, BM-MSC yo te plis sub-kilti ak plake nan yon plak 12-byen nan yon dansite nan ~ 0.5 × 10 degre pou chak pi epi konsève nan kilti pou 24-48 h. pou asire atachman selilè. Pou prepare medya kondisyone (CM) soti nan BM-MSCs, yon ti tan selil yo te lave twa fwa ak pre-chofe 1 mL nan 1 × HBSS. Apre etap lave yo, 500 μL serom ak kwasans selil endothelial san faktè (EBM); Pwodwi #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) te ajoute nan selil yo epi kenbe nan kilti nan 5 pousan CO, 37 degre pou yon lòt 24 èdtan. Nan fen peryòd enkubasyon sa a, yo te kolekte CM epi santrifuje nan 400 × g pou 10 minit pou retire nenpòt debri selilè. CM nan aliquot 500 μL yo te estoke nan -80 degre jiskaske itilizasyon nan lavni.

2.3. Esay Fonksyonèl

2.3.1. Tretman nan kiltive EPCs an reta

Yon fwa yo te rekòlte EPC yo an reta, yo te fè tès fonksyonèl. Tout eksperyans yo te fèt nan pasaj 3-6. Yo te fè tès fonksyonèl pou mennen ankèt sou efè (i) 25 pousan BM-MSC ki sòti nan medya kondisyone (25 pousan CM)[20];(ii)1 [RLX-1] oswa 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX (ki reprezante nivo sikilasyon H2 relaxin yo jwenn nan fanm ansent [21]); oswa (i) efè konbine 25 pousan CM ak 1 oswa 10 ng/mL RLX; (iv) 20 pousan FBS te itilize kòm yon kontwòl pozitif sou pwopagasyon ak fòmasyon tib (anjyojenik) potansyèl EPC yo an reta ki sòti nan pasyan kontwòl. . Gwoup tretman yo te konpare ak selil ki pa trete.

2.3.2.Viabilite ak pwoliferasyon essai

Yo te detèmine viabilite ak potansyèl proliferasyon EPCs an reta yo lè l sèvi avèk {{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolyum bromide (MTT) tès selon enstriksyon manifakti a (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Ostrali). Yon ti tan, ~5 × 103 selil pou chak pi yo te simen nan 96-plak byen (BD Falcon, North Ryde, NSW, Ostrali), apre sa, selil yo te trete ak BM-MSC ki sòti CM, RLX (10 ng/). mL), oswa yon konbinezon CM ak RLXat 1 oswa 10ng/mL pou 24 èdtan. Nan fen peryòd enkubasyon an, yo te ajoute 10 μL nan reyaktif etikèt MTT (0.5 mg/mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Ostrali) ak enkubasyon nan 37 degre Cand 5 pousan CO2 pou yon lòt 4 èdtan. Selil yo te solubilize pa adisyon a 100 μL nan solisyon solubilizasyon an (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Ostrali), epi yo te detèmine potansyèl pwopagasyon EPC yo an reta lè yo mezire absòbe chak echantiyon nan 590 nm lè l sèvi avèk yon plak mikwo. lektè (Bio-strateji, Balwyn North, VIC, Ostrali) ak analize ak lojisyèl SoftMax Pro pou Windows OS (Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Chak nan gwoup tretman yo te fèt ak analize nan sis kopi.

2.3.3. Esè fòmasyon tib

Efè divès kalite tretman pou ankouraje potansyèl anjyojenik EPCs an reta yo, lè l sèvi avèk yon tès fòmasyon tib yo te detèmine lè l sèvi avèk tès μ-angiogenesis la （Abidi, Fitchburg, WI, USA）. Yon ti tan, yo te ajoute 10 μL nan faktè kwasans redwi (GFR) Matrigel （Pwodwi #356231, Corning, Tewksbury, MA, USA） nan pi enteryè a nan μ-Slide nan twous anjyogenesis la (Abidi, Fitchburg, WI, USA). ). Kilti konfluyan nan EPCs yo an reta yo te simen sou selil yo kouvwi ak trete ak BM-MSC-sòti CM, RLX (10 ng / mL), oswa yon konbinezon de CM ak RLX nan 10 ng / mL. Yo te aplike yon volim total de 50 μL nan sispansyon selil ki gen ~ 1 × 104 selil nan chak pi. Imaj yo te pran imedyatman epi yo te make kòm 0-èd tan-pwen an. Kapasite nan selil yo anba tretman divès kalite

yo te obsève tib fòm epi yo te pran imaj yo nan 2-24 èdtan apre simen selil yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp limyè. Yo te detèmine kantite tib, longè tib, ak kantite pwen branch yo lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ la.

2.3.4.Tès gerizon blesi

Efè divès tretman yo sou potansyèl rejeneratif EPCs yo an reta yo te detèmine lè l sèvi avèk yon tès geri blesi. Pou fè tès la, ~ 1 × 10 selil yo te sispann nan 50 μL medya kwasans ak simen nan 2 byen-silicone nan plat 35 mm pou tès geri blesi (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Blesi atifisyèl nan asyèt yo te kreye lè w retire pi silikon yo dousman lè l sèvi avèk yon pensèt esteril (distans espas =500± 100μm). Asyèt yo te ranpli ak 2 mL 50 pousan EGM-2, ak adisyon nan divès kalite. tretman ki gen ladan BM-MSC ki sòti CM, RLX(10 ng/mL), oswa yon konbinezon de CM ak RLX nan 1 oswa 10ng/mL.Ki kantite selil ki te imigre pou fèmen blesi a te evalye lè l sèvi avèk mikwoskòp limyè. selil ki te imigre yo te kaptire nan 0-24 èdtan apre tretman an. Yo te detèmine pousantaj zòn fèmen espas lè l sèvi avèk lojisyèl Image].

2.3.5.Analiz Imaj

Tout analiz imaj pou tès fonksyonèl yo te fèt lè l sèvi avèk ImageJ pou MacOS (Ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Pou potansyèl fòmasyon tib nan EPC yo an reta, imaj yo te analize lè l sèvi avèk Plugin anjyogenesis tès la, ak kat paramèt diferan yo te anrejistre ki gen ladan longè total, kantite may, kantite junctions, ak kantite branch. Pou tès gerizon blesi a, yo te analize zòn fèmen blesi a pa manyèlman make zòn nan san selil nan chak pwen tan yo. Tout mezi yo te fèt omwen 3 fwa pou kontwole varyasyon.

2.3.6. Iminofluoresans

Relaxin Family Peptide Receptor 1(RXFP1; reseptè RLX RLX) lokalizasyon pwoteyin nan kiltive EPCs an reta te detèmine lè l sèvi avèk tach imunofluoresan. Premyèman, yo te fikse ~1 × 1{{20}} selil degre ki te grandi sou yon lamèl vè 13 mm (kouvwi ak poly-D-lizin) nan yon plak 12-byen yo te fikse nan 4 pousan PFA pou 15 minit nan tanperati chanm. Selil fiks yo te bloke pou lyezon pwoteyin ki pa espesifik lè l sèvi avèk 1 pousan albumin serik bovin (BSA) pou 60 minit nan tanperati chanm. Nan fen peryòd enkubasyon an, yo te lave selil yo nan PBS pou 5 minit (3 fwa) epi yo te enkube ak yon antikò poliklonal lapen RXFP1 (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Almay). )nan 0.01 pousan BSA lannwit lan nan 4 degre. Selil yo te lave ak PBS epi yo te enkube ak antikò segondè kabrit-anti-lapen Alexa-fluor 594 (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Ostrali) nan 0.01 pousan BSA pou 2 èdtan nan tanperati chanm. Yo te fè kontrasyon nikleyè lè yo ajoute 40 μL DAPI nan mwayen Vectashield aliye (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ak coverslipped. Pwoteyin imunoreactive RXFP1 te vizyalize lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan nan agrandisman × 40 (Olympus BX51) ak imaj yo te fizyone lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ.

2.4. Analiz estatistik

Tout done yo montre kòm mwayèn ± SEM ak tout analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Yon fason-ANOVA te itilize pou konpare efè plizyè tretman sou pwopagasyon (MTT tès) ak angiogenic (tib fòmasyon tès) potansyèl EPCs yo an reta, ki te swiv pa yon tès post-hoc Tukey a pou pèmèt pou plizyè konparezon ant gwoup tretman yo. Yo te itilize yon mezi repete-de fason-ANOVA pou konpare efè divès kalite tretman yo sou fèmti blesi pa EPCs yo an reta sou tan, ki te swiv pa tès post-hoc Tukey a pou konpare chak gwoup tretman yo. Yon p-valè ki mwens pase 0.05 te konsidere kòm estatistik enpòtan.