Pati 2: Molekil aksidan nan ren-1 se yon reseptè potansyèl pou SARS-CoV-2
May 11, 2022
Pou plis enfòmasyon. kontaktetina.xiang@wecistanche.com
Manifestasyon klinik coronavirus
1. Peryòd enkubasyon an long, ak sentòm prensipal yo se lafyèv, fatig, gòj fè mal, ak tous. Lafyèv la ka gwo lafyèv, lafyèv modere, oswa lafyèv ki ba;
2. Tibebe ak granmoun aje yo pa tipik epi yo souvan akonpaye pa souf anlè ak dispne. Nan ka grav, domaj milti-sistèm ka rive;
3. Tous sèk la nan premye etap la se sitou paroksistik ak grav, menm jan ak tous, ki afekte dòmi ak aktivite; nan etap la pita, tous la se krache, krache a se visye, detanzantan gen yon ti kantite san, ak kèk yo akonpaye pa souf anlè;
4. Gen kèk pasyan ki gen sentòm modere epi yo ka pa gen lafyèv. Pifò pasyan yo gen yon bon pronostik, ak yon ti kantite pasyan yo malad grav oswa menm mouri;
5. Sendwòm detrès respiratwa egi, chòk septik, asidoz metabolik refractory, ak malfonksyònman coagulation.
Ki jan yo anpeche nouvo kowonaviris la, amelyore pwòp iminite yon moun se mwayen ki pi efikas pou moun konbat viris la. Cistanche, ki te itilize kòm yon trezò nourisan depi tan lontan, ke yo rekonèt kòm "dezèjinsang" epi li se wa pou ranfòse iminite. Cistanche - Wa a nan ranfòse iminite
Rechèch medikal modèn te pwouve ke nan adisyon a fonksyon yo nan nourisan ak ranfòse kò a, Cistanche gen efè gerizon enpòtan nan anpeche timè, anti-aje, anti-aritmi, anpeche apoptoz, ak amelyore iminite. favè.
Laglikozid total nan Cistancheyo se eleman aktif nan jinsang kontwole fonksyon iminitè, ki ka amelyore fonksyon iminitè pa sèlman pou moun nòmal, men tou pou moun ki gen fonksyon iminitè ki ba.
Obsèvasyon klinik te konfime ke Cistanche gen yon sèten efè guérison sou timè malfezan, e li gen efè evidan pou ogmante lekosit. Lè w pran jinsang pandan radyoterapi ak chimyoterapi ka diminye efè toksik ak segondè nan radyoterapi ak chimyoterapi, akselere reparasyon nan tisi ki domaje, ak anpeche leukopenia;
Diskisyon
Pou goumen kont laCOVID-19 pandemi, yon konpreyansyon pwofon sou koumanSARS-CoV-2anvayi selil imen yo se garanti. Etid yo endike enfeksyon dirèk SARS-CoV-2 nanrenanplis poumon an (Braun et al., 2020; Farkash et al.,2020). Sepandan, ACE2 rete sèlman reseptè ki byen rekonèt ki ka medyatè envazyon sa a. Anplis de sa, tropism ren SARS-CoV-2 ak asosyeblesi nan rensanble eneksplikabl pa nivo relativman diminye nan ACE2 sou envazyon viral (Kuba et al., 2005). Isit la, etid nou an sijere ke KIM1, yon biomarker byen wo regilasyon pou aksidan ren (Yang et al., 2015), medyatè SARS-CoV-2 envazyon ren kòm yon reseptè.
Nou te jwenn tou ke SARS-CoV-2-RBD mare ak KIM1 ak yon afinite ki pi wo pase sa yo ki nan SARS-CoV-RBD ak MERS-COV-RBD, ki pwobableman anba kontajyon pi fò nan SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); Se poutèt sa, enfeksyon nan ren ak wòl yo nan KIM1 nan maladi respiratwa grav sa yo vo revize-ing. Miyò, rezilta nou yo sijere sit obligatwa diferan nan KIM1 ak ACE2 sou RBD viral, kidonk li vo envestige si ak ki jan KIM1 ak ACE2 medyatè envazyon SARS-CoV-2 nan ògàn sa yo. Anplis de sa, depi KIM1 endocytosed atravè chemen clathrin-depandan (Zhao et al., 2016), li ta tou enteresan yo eksplore plis pwosesis la KIM1-depandan apre atachman viral nan manbràn selilè a.
ACE2 se reseptè ki pi byen etidye pou SARS-CoV-2, men li pa yon sib ideyal terapetik pou COVID-19, paske li eksprime lajman nan plizyè ògàn epi li jwe yon wòl enpòtan nan reglemante tansyon. ak anpeche blesi nan kè/ren (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). Kontrèman, KIM1 gen yon asosyasyon pi fò ak fonksyon ren epi li trè eksprime sèlman apre yo finblesi nan ren(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda and Kaplan, 2018), ki fè li yon sib ki pi espesifik e petèt pi an sekirite tou pou pasyan COVID-19 ki gen maladi ren.
An rezime, done nou yo sijere yon wòl enpòtan nan KIM1 nan tropism ren SARS-CoV-2 kòm yon reseptè potansyèl pou SARS-CoV-2. Isit la, nou pwopoze yon modèl yon "sik visye" medyatè pa KIM1 ak ACE2 (Figi 5G), ki ka eksplike tropism ren SARS-CoV-2 nan pasyan COVID-19. Pandan premye etap envazyon SARS-CoV-2, pi wo nivo fizyolojik (Figi Siplemantè S1) ak afinite obligatwa (Tablo Siplemantè S1) fè ACE2 sib prensipal la, ki pa espesifik nan ren. Sepandan, apre aparisyon AKl ki pwovoke viris la, ki kapab lakòz KIM1 byen wo regilasyon rapidman ankouraje yon enfeksyon viral segondè medyatè pa KIM1 ak ACE2, ki se plis espesifik nan ren, epi kidonk agrave domaj nan ren nan yon sik visye (Figi 5G). Apwòch ki ka kraze entèraksyon ki genyen ant SARS-CoV-2 ak KIM1, ki gen ladan antikò anti-KIM1, inibitè ti molekil, ak peptides antagonis ki sòti nan KIM1-, ka fè limyè sou COVID-19 tretman.
Materyèl ak metòd
Materyèl
Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 pousan) te chimikman sentèz pa Genscript. Yo te jwenn antikò anti-sourit-lgG (p/n 18-8816-33) ak anti-kò anti-lapen-lgG (p/n 18-8817-33) nan Rockland. IgG ak SureBeads" Pwoteyin G pèl mayetik (J2112LB-02) te achte nan men Bio-Rad. DAPI (D9542) te soti nan Sigma. Alex Flour 594 make phalloidin (C2205S) te soti nan Beyotimes. Antikò kont KIM1 (NBP{{{{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma), ak ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) yo te itilize.
Akizisyon ak analiz de pwofil ekspresyon nan KIM1 ak ACE2
Pou jwenn transcriptom konplè ak pwofil pwoteyin nan KIM1 ak ACE2 pou tisi imen yo, nou kolekte epi analize done transcriptom yo ak pwofil pwoteyin ki baze sou imunohistochimi nan Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), ki te montre a. ekspresyon ak lokalizasyon nan pwoteyin imen atravè tisi ak ògàn, ki baze sou sekans gwo twou san fon nan RNA (RNA-seq) soti nan 37 tisi nòmal ak imunohistochimi sou mikwo matris tisi ki gen 44 kalite tisi (Uhlen et al., 2015). HPA RNA-seq tisi jèn ki kode pwoteyin yo te anrejistre kòm transkripsyon ki kode pwoteyin pou chak milyon (pTPM), ki koresponn ak valè mwayèn echantiyon ki soti nan chak tisi. Nivo ekspresyon pwoteyin ki baze sou Istoloji yo te analize manyèlman nan kat nivo (pa detekte, ba, mwayen ak segondè). Nan Figi Siplemantè S1, 10 pi wo nivo transkripsyon tisi yo ak nivo ekspresyon pwoteyin ki baze sou istoloji nan KIM1 ak ACE2 yo ki nan lis, respektivman, epi pwofil ekspresyon ki sipèpoze nan KIM1 ak ACE2 yo rezime.
Docking molekilè ak simulation dinamik
Dockings yo te fèt atravè Z-Dock (http://zdock.umassmed.edu/). Estrikti kristal SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42), ak KIM1 Ig V domèn (PDB ID 5DZO) yo te itilize pou chèche potansyèl modèl obligatwa. Konplèks pwoteyin ki pi byen bay nòt yo te chwazi pou simulation dinamik molekilè sa yo, ki te fèt pa sèvè Desmond la epi analize pa Pymol2.3 ak Maestro11.8.012.Dyagram simulation dinamik 50 ns yo te aplike pou etidye paramèt dinamik konplèks pwoteyin yo. . MM-GBSA obligatwa enèji gratis te kalkile pa HawkDock (Misini lgnjatovic et al.,2016).
Rasin mwayèn kare devyasyon (RMSD) ak rasin mwayèn kare fluctuation (RMSF)
Yo te itilize RMSD pou estime chanjman mwayèn nan deplasman yon seleksyon atòm pou yon ankadreman patikilye jan sa dekri (Li et al., 2011). RMSF te fèt pou etidye chanjman deplasman yo nan chèn pwoteyin lan (Li et al., 2011) .
Modèl sourit AKI ak qPCR
Yo te fè aksidan I / R sou sourit C57BL / 6 jan nou te dekri deja (Chen et al, 2015, 2017). Pou AKI sisplatin pwovoke, yo te enjekte 30 mg/kg pwa kò cisplatin nan 8- sourit gason ki gen yon semèn, epi yo te sakrifye sourit 3 jou apre. Yo te kolekte echantiyon san ak ren pou plis analiz, ak n=4 pou chak gwoup bèt eksperimantal. Total RNA te izole nan ren pa RNAiso Plus (TaKaRa) ak ranvèse-transkripsyon nan cDNA lè l sèvi avèk sistèm nan sentèz premye strand M-MLV (Invitrogen). Abondans transkripsyon jèn espesifik yo te evalye pa qPCR. Yo bay primè yo itilize nan etid la (Tablo Siplemantè S4).
Konstwi
Plasmid ekspresyon mamifè pou moun KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 résidus aa 20-127), KIM1 △lg V (tronke KIM1 san rezidi aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S résidus aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP, ak TIM4-YFP te konstwi. Pwodwi anplifikasyon PCR nan fragman cDNA korespondan yo te klonaj nan yon vektè ki baze sou pwomotè pRK ki gen swa HA oswa tag FLAG. Plasmid ki gen rapò ak SARS-CoV-2-se te bon kado Dr PHWang nan Shandong University.
Kilti selilè ak transfèksyon
Liy selil tubulaires ren imen HK-2 (yo jwenn nan Lachin Center for Type Culture Collection) te kiltive nan medya DMEM/F12 (Hyclone) ki gen 17.5 mM glikoz ak 10 pousan serom fetis. Pou evalye enpak SARS-CoV-2 sou selil yo, selil HK-2 yo te transfekte ak SARS-CoV-2-S ak SARS-CoV-2-RBD plasmid epi yo te kolekte pou plis deteksyon.
Ko-IP
Selil HK-2/HEK293T ki endike yo (1 × 10) yo te lysed nan 1 ml tanpon pre-liz (25 mM Tris-HCl, pH7.4,150mM NaCl, 1 pousan NP-40, 1mM EDTA, 5 pousan glycerol), ki se fòmile pou pulldown ak tès IP ak kòm yon tanpon lave pou pèl. Pou IP, lisat selil yo te imunoprecipitated ak antikò ki endike a oswa gG respektif ak pèl mayetik SureBeadsTM Pwoteyin G lannwit lan nan 4C. Apre lave ak yon tanpon pre-lysis ki gen 500 mM NaCl, pèl yo te bouyi nan yon tanpon loading epi yo te sibi imunoblot (Wan et al., 2017).
FRET esè
Entèraksyon intraselilè ant KIM1 ak SARS-CoV-2-RBD te detekte pa yon tès estanda ki baze sou FRET (Karpova and McNally, 2006) lè l sèvi avèk KIM1-CFP ak SARS-CoV-2-RBD-YFP. . Yon ti tan, plasmid ekspresyon mamifè ki eksprime KIM1-CFP oswa KIM1 Alg V-CFP yo te kotransfekte ak SARS-CoV-2-RBD-YFP nan selil T-293. Pou deteksyon fluoresans ki baze sou espektrofotomèt, selil yo te kolekte epi liz 24 èdtan apre transfeksyon, epi lisat la te detekte pa yon F-2700 Spèktrofotomèt Fluoresans (Hitachi) atravè eskanè longèdonn (500-600nm) ak eskanè tan (435). /527 nm, eksitasyon / emisyon).Pou deteksyon ki baze sou konfokal, selil yo te imajine ak yon mikwoskòp konfokal Leica TCS SP8 anba gwo pouvwa lantiy objektif (40 ×) (CFP kanal: 435/485 nm, eksitasyon / emisyon; YFP kanal : 485/527nm, eksitasyon / emisyon; Chanèl FRET: 435/527 nm, eksitasyon / emisyon) (Li et al, 2020b). Kotransfeksyon nan CFP unkonjige ak YFP te enkli kòm yon kontwòl negatif jan sa dekri (Karpova and McNally, 2006). Entèraksyon ant KIM1 ak ligand TIM4 li yo te detekte pa tès FRET kòm yon kontwòl pozitif (Rong et al, 2011).
CRISPR-Cas9-medyatè knockout nan KIM1
Yo te itilize pwotokòl ki baze sou CRISPR-Cas9- pou jeni genòm jan sa dekri (Zhang et al., 2017). Gid sekans sib RNA pou KIM1 yo bay (Tablo Siplemantè S4).
FITC etikèt ak mikwoskòp konfokal
Te etikèt FITC fèt jan nou te dekri deja (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). Yon ti tan, SARS-CoV-2-RBD te enkube ak FITC (rapò molè 1:5) lannwit lan, epi apre sa yo te ajoute 5 mM NHCl pou sispann reyaksyon an ak pasè FITC ki pa reyaji. Solisyon an te dyalize de fwa epi lyofilize pou plis itilize.
Selil HEK293T (5 × 109) oswa selil HK-2 (1 × 107) yo te enkube ak FITC gratis oswa FITC-SARS-CoV-2-RBD （100ug/ml pou 2. Pou tès entèrnalizasyon ki baze sou peptide, AP1 oswa AP2（50μM）te ko-ajoute ak FITC-SARS-CoV-2-RBD （100 ug/m）. Apre ranje ak 4 pousan (w/v) fòmaldeyid, manbràn selilè yo te tache ak Alex Flour 594 ki make phalloidin （2ug/ml）, epi nwayo yo te tache pa DAPI（1ug/m）, epi answit imajine ak yon Leica TCS. mikwoskòp konfokal SP8. Pou chak gwoup, omwen 100 selil ki soti nan senk jaden anba yon lantiy objektif gwo pouvwa (64 ×) yo te enkli nan evalyasyon an. Imaj reprezantatif yo te prezante. Kantifikasyon imaj yo te fèt pa ImageJ1.8.0.
Esay viabilite selil yo
Selil yo te plake nan 3000-4000 selil pou chak pi nan 96-plak pi. Nan 80 pousan konfluans, selil enkubasyon ak SARS-CoV-2-RBD （100 ug/ml） yo te trete avèk oswa san AP1 oswa AP2（10,50,100 μM）. Apre sa, 10ul MTT （5 mg/ml te ajoute nan chak
byen pou 4h, yo te retire mwayen an, epi yo te ajoute DMSO. Absorbans mezire nan 490nm te nòmalize nan gwoup la kontwòl respektif.
Analiz estatistik
Done yo te eksprime kòm mwayen ± SD. Diferans siyifikatif yo te evalye pa yon tès Etidyan de ke. Yon valè P de bò<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">
