Pentraxin-3-medyatè aktivasyon konpleman nan yon modèl kochon nan blesi iskemi/repèfizyon nan ren.

Kontakte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Imèl:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella et al

REZIME

Pentraxins se yon fanmi molekil rekonesans modèl evolisyonèman konsève ak wòl esansyèl nan iminite natirèl ak enflamasyon, tankou opsonizasyon patojèn pandan enfeksyon bakteri ak viral. An patikilye, long Pentraxin 3 (PTX3) yo te montre kontwole plizyè aspè nan enflamasyon vaskilè ak tisi pandan transplantasyon ògàn solid.

Etid nou an te envestige wòl PTX3 kòm yon modilatè posib nan aktivasyon Konpleman nan yon modèl kochon nan blesi iskemi/repèfizyon ren (I/R). Nou demontre ke I/R blesi-induit bonè depo PTX3 nan nivo peritubular ak glomerular kapilè. Mikwoskòp lazè konfokal devwale depo PTX3 ko-lokalize ak CD31 plis selil andotelyo. Anplis de sa, PTX3 te asosye ak enfiltre makrofaj (CD163), selil dendritik (SWC3a), ak myofibroblasts (FSP1). An patikilye, nou te demontre siyifikatif PTX3-medyatè deklanchman nan klasik (C1q medyatè) ak lectin (MBL-medyatè) chemen konpleman. Enteresan, depo PTX3 ko-lokalize ak deklanchman tèminal konpleman konplèks (C5b-9) sou selil andothelial, ki endike ke PTX3-medyatè aktivasyon konpleman te fèt sitou nan nivo vaskilè ren yo. An konklizyon, done sa yo endike ke PTX3 ta ka yon sib potansyèl terapetik pou anpeche blesi I / R ki te pwovoke konpleman.

Korespondans pou:Giuseppe Castellano

Mo kle:blesi ischemi/repèfizyon, sistèm konpleman, pentraxin 3,ren, chemen klasik

Cistanche tubulosa anpeche maladi ren, klike la a pou jwenn echantiyon an

ENTWODIKSYON

Iskemi-reperfusion (I/R) aksidan reprezante kòz prensipal egirenblesiapre transplantasyon epi li karakterize pa yon aktivasyon enpòtan nan sistèm nan konpleman [1, 2]. Nan senaryo sa a, selil endothelial (EC) jwe yon wòl enpòtan nan reparasyon maladaptive apre I/R, ki mennen nan fibwoz bonè pa tranzisyon endothelial a mesenchymal (EndMT) [3]. Pandan faz repèfizyon an, Complement òkestre pwosesis iminolojik ak enflamatwa, kontribye nan divès maladi iminitè ak enflamatwa [2-5]. Lòt eleman esansyèl nan bra umoral nan sistèm iminitè natirèl la reprezante pa pentraxins ke yo panse yo jwe yon wòl esansyèl nan byoloji vaskilè [6].

Pentraxins yo se yon fanmi pwoteyin multimerik idrosolubl [6] ki klase an fanmi kout ak long ki baze sou estrikti yo [7]. Pwoteyin evolisyonèman konsève sa yo se efè faz egi, ki sèvi kòm detèktè pou inisyasyon enflamasyon ak rapidman ogmante nan plasma pandan enfeksyon [8]. Long pentraxin 3 (PTX3) se yon molekil rekonesans modèl idrosolubl ki enpòtan anpil nan pwoteksyon iminitè natirèl epi li ka aktive sistèm konpleman an [9-11].

An patikilye, PTX3 pwovoke deklanchman chemen klasik ak lektin pa lye ak C1q, MBL, Ficolin -2 epi li kapab afekte chemen altènatif la atravè CFH [10-12].

Kontrèman ak lòt pentraksin ki pwodui nan fwa nan san an (sa vle di CRP), selil rezidan yo ka libere PTX3 nan sit enflamasyon an, pou egzanp nan fagosit mononikleyè, selil dendritik, fibroblast, ak EC [9] ki aji nan yon fason parakrin. [13]. PTX3 tou estoke nan yon fòm pare-fè nan neutrophils, lokalize nan granules espesifik, ak sekrete an repons a rekonesans nan moyet mikwòb [14]. Nan EC, ekspresyon PTX3 fasil pwovoke pa TNF- ak IL-1, ki bay yon tranzisyon soti nan yon fenotip trankil, anti-enflamatwa, nan yon eta procoagulant ak proinflammatory, kidonk fòtman kontwole fonksyon mikwovaskilè a [7, 8. ]. Pou rezon sa a, nivo PTX3 yo te dekri kòmkwonikrenmaladi, ogmantasyon nan nivo pwoteyin nan PTX3 te korelasyon ak GFR bès ak konplikasyon kadyovaskilè, sepandan, ti kras toujou konnen sou wòl nan PTX3 nan anviwònman yo byen bonè kòm I / R-induit egi.renblesi [15, 16].

Wòl PTX3 nan maladi enflamatwa ren se bivalan, ki soti nan yon bò pwoteyin nan ka aktive chemen klasik ak lektin ankouraje enflamasyon inisyal ak blesi [10-12]. Nan lòt bò a, domèn N-tèminal PTX3 modulation konpleman deklanchman atenue rekritman leukozit ak inibit fibwoz entèrstisyèl nan aksidan ren egi ankouraje reparasyon tisi [17-20].

Konpleman jwe yon wòl esansyèl nan fizyopatoloji nan I / R blesi-induit egirenblesi[21, 22]. Nan yon modèl kochon nan ren I / R aksidan, nou demontre wòl esansyèl nan aktivasyon sistèm konpleman nan pwovoke EndMT ak fibwoz bonè, ak patisipasyon nan tou de chemen klasik ak lectin [23]. Anplis, nou te demontre ke anpèchman terapetik nan chemen konpleman sa yo pa recombinant C1-INH (rhC1INH) te pwodui yon rediksyon enpòtan nan depozisyon konpleman, ak diminye rekritman nan enfiltrasyon selil enflamatwa ak domaj tubulointerstitial [23]. Rezilta sa yo te konfime tou pa Delpech PO et al [24]; yo te evalye yon modulasyon enpòtan nan C1q, MASP, ak C4d glomerular ak depo tubulaires apre 30 minit apre repefizyon ki endike yon wòl santral C1-INH pou debat chemen klasik ak lektin.

Nan etid sa a, nou te envestige patisipasyon posib nan PTX3 nan medyatè aktivasyon konpleman bonè nan ren I / R aksidan, karakterize diferan sous selilè PTX3.

REZILTA

PTX3 eksprime pa selil andothelial ak selil iminitè enfiltre nan yon modèl kochon nan blesi I / R.

Premyèman, nou te envestige prezans PTX3 nan yon modèl kochon nan blesi ren cho I/R-induit. Nou obsève depo PTX3 trè limite nan tisi nòmal (Figi 1A). Blesi I/R te lakòz yon depozisyon difize nan PTX3 deja nan 15min apre repèfizyon (Figi 1B, 1C) nan zòn nan tubulointerstitial (Figi 1E), nan kapilè peritubular (Figi 1D; flèch), ak nan nivo glomerular (Figi 1D). Depo PTX3 yo te toujou detekte 1 èdtan apre repèfizyon nan nivo kapilè peritubular (Figi 1G). Nan travay anvan nou an [23] nou te demontre ke karakteristik prensipal yo nan blesi I / R yo se apoptoz selil epitelyal tubulaires ak rekritman nan enfiltre selil enflamatwa tankou monosit, selil dendritik, ak lenfosit. Men, pa evalyasyon istolojik woutin (figi siplemantè 1), nou te demontre ke 30 min nan iskemi cho ki te swiv pa 15 min nan repèfizyon-induit domaj entèstisyèl tib byen bonè, karakterize pa pi gwo konjesyon kapilè ak vakyolasyon fokal sitoplasmik nan epitelyal tubul ren, konpare ak fondamantal. kondisyon.

Pou plis karakterize lokalizasyon selilè depo PTX3 ak evalye efè potansyèl li nan modulation repons enflamatwa ak blesi, nou te fè analiz mikwoskospi konfokal ak doub-immunostaining. Ekspresyon pwoteyin PTX3 te detekte nan pi fò nan EC a nan nivo kapilè peritubular (Figi 2A) ak glomerular (Figi 2B), 15 min apre repèfizyon.

Li se byen li te ye ke I / R aksidan karakterize pa ogmante deklanchman nan repons iminitè natirèl ak adaptasyon, ki gen ladan trafik selil enflamatwa nan ògàn malad la ki plis agrave aksidan atravè selil iminitè ak sistèm nan Konpleman [25]. Nan modèl kochon nou an, nou menm tou nou te obsève, deja 15 minit apre repèfizyon, yon enfiltrasyon enflamatwa dans ki konpoze lajman de makrofaj ak selil dendritik nan zòn nan tubul-entèrstitisyal. Nou te jwenn ke tou de selil sa yo ki prezante antijèn yo te karakterize pa ogmante ekspresyon PTX3 lè yo konpare ak T0 depi nou te obsève yon ogmantasyon kantite CD163 plis /PTX3 plis (Figi 2E, 2F, 2K) ak SWC3a plis /PTX3 plis. (Figi 2G, 2H, 2L) selil nan nivo entèstisyèl tubul nan T15.

Ekspresyon PTX3 ka kontribye nan EndMT nan aksidan I / R

Nan obsèvasyon anvan yo, nou te demontre ke blesi I / R te responsab pou EndMT [26, 27], karakterize pa akizisyon de yon fenotip mesenchymal pa EC ak pèt la nan makè espesifik endothelial ak genyen nan makè mesenchymal, tankou fibroblast-espesifik. pwoteyin 1 (FSP-1), kadherin newòn (N-kadherin) ak aktin nan misk alfa-lis (alfa-SMA). Kidonk, nou te envestige si ekspresyon PTX3 pa EC ta ka afekte pwosesis sa a. Kòm espere, lè nou te envestige ekspresyon alfa-SMA, kòm makè myofibroblast aktive, nou pa t jwenn okenn ko-lokalizasyon ant alfa-SMA ak PTX3 (Figi 2C, 2D). Okontrè, nou te obsève yon ogmantasyon nan tubulointerstitial FSP1 plis / PTX3 plis myofibroblasts pandan tout peryòd obsèvasyon an (Figi 2K-2M).

Depo PTX3 yo asosye ak aktivasyon sistèm konpleman an

Finalman, nou te envestige si depo PTX3 yo te asosye ak aktivasyon Konpleman. Vreman vre, menm jan ak lòt konpozan nan fanmi pentraxin la, PTX3 ka kontwole aktivasyon an nan chemen an konpleman klasik [7]. Pou defini relasyon ki genyen ant PTX3 ak aktivasyon Konpleman, nou te fè imunofluoresans doub etikèt pou evalye ekspresyon PTX3 ak tèminal la. Konpleman konplèks, C5b-9, lè l sèvi avèk yon antikò ki dirije kont yon C9-neoepitop. Nou te obsève yon ko-lokalizasyon enpòtan nan depo PTX3 ak C5b -9 (Figi 3A, 3B). Konplèks tèminal Konpleman an te lokalize nan nivo peritubular ak nan kapilè peritubular yo ansanm ak kouch selil andothelial la, jan nou te deja demontre [23, 28]. Depi PTX3 ka aktive sistèm Konpleman an atravè chemen klasik ak lectin, nou evalye depozisyon C1q ak MBL nan parenchyma ren. Enteresan, depo C1q (Figi 3E, 3F) ak MBL (Figi 3C, 3D) yo te jwenn sitou nan nivo entèrstisyèl ak kapilè (Figi 3C jiska 3F), jan yo dekri anvan [23] ak colocalized ak depo PTX3.

C1-enibitè entèfere ak PTX3 obligatwa sou selil andotelyal yo

Nan travay anvan nou an [23] nou te demontre ke C1-inibitè administrasyon te mennen nan yon rediksyon enpòtan nan depo konpleman, ak diminye rekritman nan enfiltrasyon selil enflamatwa ak domaj tubulointerstitis. Se poutèt sa, nou te egzamine nivo ekspresyon PTX3 nan bèt trete rhC1-INH. Nou te jwenn ke perfusion nan C1-inibitè redwi depo PTX3 nan kapilè peritubular ak nivo entèrstisyèl apre 15 min apre-reperfusion (Figi 4A).

Anplis, pou sipòte ipotèz ke rediksyon nan depo PTX3 nan bèt trete rhC1-INH te asosye ak anpèchman domaj andotelyal, nou te fè eksperyans nan vitro epi nou evalye rhC1-INH ak PTX3 obligatwa sou kiltive EC nan kondisyon nòmal oswa nan prezans estrès selilè (Figi 4B). Analiz FACS te montre ke EC nan kondisyon nòmal yo pa mare tou de rhC1-INH ak PTX3. Dapre etid anvan nou an [26], nou te obsève yon ogmantasyon selilè rhC1-INH sou H2O2-stimile EC konpare ak kondisyon fondamantal yo. Anplis, nan absans rhC1-INH, PTX3 ta ka mare aktive EC. Enteresan, lè H2O2-aktive EC yo te enkube ak PTX3 ak rhC{1-INH, nou te obsève ke C1INH te kapab pwoteje EC lè yo bloke PTX3 obligatwa.

DISKISYON

Nan etid sa a, nou demontre depozisyon PTX3 nan faz bonè nan ren I / R aksidan ak kontribisyon posib li nan devlopman EndMT. Enteresan, nou te jwenn ke PTX3-medyatè aktivasyon Konpleman fèt sitou nan nivo vaskilè, ko-lokalize ak C1q ak MBL, molekil rekonesans yo nan chemen klasik ak lectin nan kaskad Konpleman an.

Blesi I/R deklannche yon repons enflamatwa ki make ki karakterize pa deklanchman Konpleman, radikal gratis oksijèn, ak pwodiksyon sitokin proenflamatwa, sa ki lakòz deklanchman andotelyòm vaskilè ak leukosit periferik [29, 30]. Pandan aksidan I/R, aktivasyon konpleman mennen nan konpleman depo konpozan sou manbràn sifas EC domaje ak disfonksyonèl, ak jenerasyon an similtane anafilatoksin ak anplifikasyon nan pwosesis enflamatwa [31]. Pandan enflamasyon, PTX3 ogmante rapidman epi li ka egzèse yon wòl santral nan modulation repons andotelyal. Vreman vre, PTX3 te endike kòm yon biomarker potansyèl nan malfonksyònman vaskilè andotelyo nan plizyè maladi, ki gen ladan kwonik.renmaladi, preeklanpsi, ak plizyè maladi vaskilè [7, 16, 17, 32]. Nou te demontre tou ke PTX3 patisipe nan lòt konplikasyon vaskilè tankou echèk nan fistula arteriovenous nan pasyan emodyaliz [33]. Obsèvasyon sa yo sijere ke PTX3 ta ka yon pon ant repons enflamatwa ak malfonksyònman andotelyal [34]. Nan liy ak etid sa yo, nou obsève depo PTX3 nan yon nivo endothelial deja apre 15 minit apre repèfizyon (Figi 2A, 2B). Rezilta nou yo te demontre tou ke nan faz bonè nan aksidan I/R, PTX3 colocalized ak makè myofibroblast, FSP -1 (Figi 2I, 2J) men se pa ak alfa-SMA, yon makè eksprime pa aktive myofibroblast (Figi 2C, 2D). Ansanm, done sa yo ta ka sijere ke malfonksyònman endothelial ak pwosesis EndMT [35], obsève nan bèt I / R [26], premye te fèt nan EC eksprime PTX3.

Se lyen ki genyen ant PTX3 ak selil enflamatwa lajman rekonèt. Nan papye sa a, nou espesyalman konsantre sou efè nannan PTX3 nan enfiltrasyon entèrstisyèl nan leukosit ki se yon gwo sous PTX3 [36]. An patikilye, nou te jwenn makrofaj ak selil dendritik, apre 15 min apre repèfizyon, eksprime pi wo nivo PTX3 (Figi 2E jiska 2H). Done sa yo an akò ak kò a ogmante nan prèv sijere yon wòl enpòtan pou iminite natirèl nan medyatè domaj bonè nan aksidan I / R [23]. Aktivasyon bonè nan Konpleman nan tisi ren apre aksidan I / R mennen nan jenerasyon plizyè medyatè enflamatwa ki ogmante rekritman nan selil iminitè [21, 23, 37, 38]. Etid resan yo te idantifye PTX3 kòm youn nan eleman prensipal yo nan rezo a ki òkestre repons enflamatwa deklanche pa I / R aksidan [39]. Nan diferan modèl eksperimantal nan blesi I / R, PTX3 ka fè egzèsis doub wòl opoze sou tisi espesifik [40, 41]. Pwodiksyon bonè nan PTX3 ki asosye ak domaj ren paske li pwovoke ekspresyon bonè nan molekil adezyon andotelyal ak chemokin ki akselere repons enflamatwa maladaptive lokal la.

Okontrè, pwodiksyon lokal pwolonje PTX3 anpeche twòp enflamasyon ògàn ak malfonksyònman [41].

PTX3 se yon modulatè kaskad Konpleman [9, 42]; sa a se akò ak pwopriyete pleyotropic nan PTX3 ki endike yon wòl doub nan PTX3 kòm yon modulator oswa anplifikatè nan repons iminitè natirèl la [39]. Okòmansman, PTX3 aktive Konpleman pa obligatwa C1q ak MBL [43]; sepandan, byen bonè ogmante enflamasyon bezwen limite nan zòn sib la. Se poutèt sa, PTX3, pa rekrite faktè H oswa anpeche anjojenèz, ta ka tou redwi repons enflamatwa a ak konpleman aktivasyon prezève parenchyma ren soti nan domaj enflamatwa [43]. Malgre ke aktivasyon konpleman nan I / R nan wonjè se sitou lokalize nan nivo tubulaires [44], pandan faz repèfizyon an, andotelyo a se sib prensipal diferan ajan pro-enflamatwa, ki gen ladan medyatè konpleman [2]. Nou te deja demontre ke nan modèl kochon nan blesi I / R kòm byen ke nan pasyan DGF, aktivasyon an nan sistèm nan Konpleman rive nan faz la byen bonè, sou kapilè peritubular, nan entèstisyòm nan, ak sou andotelyo a glomerular [23]. Done nou yo te montre yon ko-lokalizasyon klè nan depo C5b-9 sou PTX3 plis EC apre 15 min apre repèfizyon (Figi 3A, 3B). Se poutèt sa, andotelyòm ren sanble se sit prensipal PTX3-medyatè aktivasyon Konpleman nan faz bonè nan aksidan I/R nan tou de anviwònman preklinik ak klinik.

Entèraksyon nan pentraxins ak C1q ak wòl li nan aktivasyon an nan chemen an konpleman klasik yo byen dekri [45-47]. Nan kontèks repons iminitè natirèl yo, PTX3 ka mare diferan konpozan Konpleman ak modile aktivasyon Konpleman [43, 48]. PTX3 aktive Konpleman pa C1q obligatwa [49]. Rezilta nou yo nan modèl bèt la klèman demontre ke PTX3 ta ka medyatè deklanchman chemen klasik pa kominike avèk C1q (Figi 3E, 3F). Anplis, PTX3 tou modile chemen lectin nan Konpleman an, jan yo montre nan Figi 3C, 3D. MBL mare PTX3 atravè domèn kolagen an tankou [45] ak konplèks MBL/PTX3 rekrite C1q epi fè depozisyon C3 ak C4 sou sifas selil sib yo.

Ansanm, rezilta sa yo sijere wòl santral PTX3 nan medyasyonrendomaj nan blesi I/R, ki ta ka gen enplikasyon enpòtan pou terapi konpleman-dirije nan blesi ren I/R.

Nan etid anvan nou an [26], nou te envestige patisipasyon konpleman nan medyasyon aktivasyon EC lè nou itilize yon fòm recombinant C1-INH, yon inibitè ki pisan nan proteaz nan chemen konpleman klasik ak lektin (C1r, C1 s, ak MASP2). Nan menm modèl bèt la, nou te montre (Figi 4A) ke anpèchman ka geri tou de chemen pa rhC1INH redwi depo PTX3 nan kapilè peritubular ak nivo entèstisyèl apre 15 min apre repèfizyon. Done sa yo konfime ak rezilta in vitro sou EC (Figi 4B), te mennen nou ipotèz ke rhC1INH a ta ka pwoteje EC domaje lè yo bloke PTX3 obligatwa. Nan literati, gen prèv sou lyezon C1-INH ak molekil adezyon andotelyal, ki eksprime sou andotelyo aktive, yo rele seletin, an patikilye P ak E-selektin [50, 51]. Obligatwa sa a sou EC ka entèfere ak entèraksyon andothelial-leukocyte pandan enflamasyon epi li reprezante yon lòt mekanis anti-enflamatwa enpòtan [50, 51]. Se poutèt sa, nou te sipoze ke rh-C1INH ka mare aktive EC ak medyatè règleman lokal nan aktivasyon konpleman ak pwosesis enflamatwa. Nan etid anvan nou yo, nou te demontre patisipasyon konpleman nan blesi I / R ak lòt maladi ren iminitè [38, 52-54]. Mekanis yo nan aktivasyon Konpleman nan modèl bèt sa a ta ka gen enplikasyon enpòtan pou entèpretasyon done yo espere nan anviwònman imen an. Pou devlope avèk siksè entèvansyon terapetik ki vize nan konpleman-aktivasyon [36, 54], li esansyèl pou etabli validite done kochon an parapò ak sa ki rive nan sikonstans klinik yo. Piske rechèch sa a limite a sa sèlman etid obsèvasyon, yo bezwen plis eksperyans pou delimiter mekanis ki konekte ant PTX3 ak Konpleman ki ta ka mete aksan sou nouvo estrateji terapetik yo. Soti nan rezilta ki anwo yo, done nou yo sipòte ipotèz la ke PTX3 ta ka kontwole plizyè aspè nan blesi I / R ki te fè konpleman-medyatè, kidonk reprezante yon potansyèl sib terapetik.

MATERYÈL AK METÒD

Renal I/R blesi kochon modèl

Modèl bèt nan ren I / R aksidan te devlope jan sa te dekri deja [23]. Apre apwobasyon komite etik Ministè Sante a, 4-fi gwo kochon blan (n=8, n=4 pou gwoup, 20 kg) te sibi eksperimantal pwosedi chirijikal louvri anba anestezi jeneral. Bèt yo te fè jèn pou 24 èdtan anvan endiksyon anestezi a. Elektwokardyogram, batman kè, saturation emoglobin nan oksijèn, konpozisyon gaz respiratwa, to respiratwa, volim mare, presyon nan lè a, tansyon atè sistolik, ak presyon venn santral yo te kontinyèlman kontwole epi anrejistre otomatikman (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Fenlann). . Atè ren gòch la ak venn yo te izole epi yo te pozisyone yon bouk veso alantou atè ren ak yon kranpon ang dwat. Yo te fè yon byopsi ren anvan iskemi (T0). Lè sa a, faz ischemik la te pwovoke (30 min) pa rale sou bouk veso a. Lè sa a, miltip byopsi yo te fèt nan 15, 30, ak 60 min apre repèfizyon; bèt yo te sakrifye 24 èdtan apre pwosedi chirijikal la. Yo te imedyatman jele yon pòsyon nan chak echantiyon byopsi nan yon tanperati ki pi bon (Tissuetek, Pittsburgh, PA) epi yo estoke nan nitwojèn likid. Yo te fikse yon lòt pòsyon nan fòmalin tanpon (4 pousan) pou 12 èdtan epi li te entegre nan parafine lè l sèvi avèk pwosedi estanda.

Etid mikroskopi

Yo te itilize espesimèn ren parafine ki soti nan byopsi ren yo pou tach istolojik konvansyonèl (H&E, peryodik asid-Schiff). Imaj yo te akeri pa aparèy Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, USA). Lezyon tubul-entèrstisyèl ak glomerulè yo te evalye lè l sèvi avèk yon analiz kalitatif pa de obsèvatè (CD, MR) ki pa t konnen orijin nan.

Antikò

Antikò prensipal yo itilize nan etid sa a rekonèt antijèn sa yo: PTX3 (MNB4: dirèk kont PTX3 domèn N-terminal, Exira Life Sciences In., Larsen, Swis); CD163 (monosit/macrophages, US Byolojik, Swampscott, MA); SWC3a (selil dendritik, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (pwoteyin espesifik fibroblast 1, Abcam, Cambridge, UK); aktin nan misk alfa-lis (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Wayòm Ini); MBL (3E7: dirèk kont domèn rekonesans idrat kabòn MBL, Hycult biotechnologie, Uden, Netherlands) ak C9 neoantigen (aE11, Hycult biotechnologie). Kwa-reaktivite a te valide pa pre-enkubasyon antikò espesifik yo, anvan yo itilize yo, ak peptides imen yo itilize pou ogmante yo. Pre-enkubasyon an aboli tach espesifik sou tisi kochon.

Tisi imunofluoresans ak konfokal lazè optik mikwoskòp

Karakterizasyon ak lokalizasyon siyal PTX3 yo te envestige sou tisi nan frizè ki enkli nan mwayen OCT (Tissue-Tek). Glisad yo te enkube ak 5 pousan serom lapen pou 1 èdtan nan 37 degre C. Lè sa a, glisad yo te enkube pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak antikò espesifik. Apre twa lave nan PBS, glisad yo te enkube ak antikò segondè ki apwopriye yo (Alexa Flour 488 ak 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Tout seksyon yo te kontre ak TO-PRO-3 (sond molekilè). Kontwòl negatif yo te prepare ak antikò ki pa enpòtan. Seksyon yo te analize lè l sèvi avèk Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Almay) mikwoskòp konfokal lazè-eskane. Kantite selil enfiltre yo te mezire nan omwen 10 gwo pouvwa (x630) jaden/seksyon pa de obsèvatè endepandan avèg nan orijin nan glisad yo. Konte final yo te vle di de mezi yo. Nan okenn ka, varyasyon ant obsèvatè yo te pi wo pase 20 pousan.

Kilti selil ak analiz sitometri koule

Selil endothelial venn lonbrit imen (HUVEC, EC) yo te achte nan men Koleksyon Kilti Kalite Ameriken (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Itali). EC te grandi nan medya yo rekòmande, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Almay). EC te plake nan yon dansite 1{{10}},000selil/cm2 epi yo te ankouraje ak tretman H2O2 (3 pousan, 1 èdtan). Lè sa a, EC fondamantal ak ankouraje yo te lave de fwa ak PBS epi yo te retire ak PBS-EDTA 2mM ak tripsin 0.001 ×. Lè sa a, selil yo te resuspend nan PBS epi yo te enkubate respektivman ak PTX3 (rekonbinan moun PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Almay) (1ug/ml) oswa/ak ak rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2.5ug). /ml) pou 60 min. Apre yo fin lave twa fwa ak PBS 1X, selil yo te resuspend nan sitometri koule (FACS) tanpon (fosfat-tanpon saline, pH 7.2, 0.2 pousan albumin serom bovin, ak 0.02 pousan azid sodyòm) ak enkubasyon ak FCR bloke reyaktif (Miltenyi Biotec) pou 10 minit nan tanperati chanm. Apre bloke, EC yo te enkube ak lapen anti-moun C1-INH (ki bay pa Prof. M. Daha, University of Leiden, 1//100 dilution) oswa/ak ak rat anti-PTX3 (MNB4, Exira Life). Sciences In., 1/20 dilution) nan tanperati chanm pou 30 min epi lave ak tanpon FACS la. Lè sa a, selil yo te enkube ak kabrit anti-lapen IgG PE (sond molekilè, 1/100 dilution) oswa / ak anti-rat IgG FITC (sond molekilè, 1/100 dilution) nan tanperati chanm pou 30 min epi lave twa fwa. Selil yo te analize ak FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ak lojisyèl Kaluza. Yo te detèmine zòn nan pozitivite lè l sèvi avèk yon mAb ki matche ak izotip, epi, an total, 104 evènman pou chak echantiyon yo te akeri. Twa eksperyans endepandan yo te fèt.

Analiz estatistik

Done yo prezante kòm mwayen ± devyasyon estanda (SD) epi yo konpare yo lè l sèvi avèk analiz divèjans oswa tès t Elèv ki pè, jan sa apwopriye. Diferans yo te konsidere estatistik enpòtan lè valè p yo te mwens pase 0.05. Done yo te analize lè l sèvi avèk pake lojisyèl Statview (vèsyon 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Grafik yo te parèt lè l sèvi avèk GraphPad Prism Software 5.

Abreviyasyon yo

I/R: ischemi/reperfusion; EC: selil andothelial; PTX3: pentraxin 3; FSP-1: fibroblast-espesifik pwoteyin 1; N-kadherin: kadherin newòn; alpha-SMA: Aktin nan misk alpha-lis.

KONTRIBYON OTÉ

CD kowòdone etid la, li te patisipe nan immunolabeling ak mikwoskòp konfokal nan seksyon ren, epi li te ekri maniskri a. AS ak RF te patisipe nan konsepsyon etid la, kontribye nan analiz done, fè eksperyans nan vitro, ak kritik revize maniskri a. MR ak GSN fè analiz imaj istopatolojik. LL, FS, AMC te fè modèl bèt nan aksidan Ischemia-Reperfusion epi yo te ede revize maniskri a. GL, PD, ak MB te fè tout pwosedi chirijikal sou modèl kochon an epi yo te ede revize maniskri a. MRD, P.vdP., C.vK., ak FS revize maniskri a.

PP, ER, GG, GS, ak LG revize maniskri a yon fason kritik. GC bay nouvo zouti analitik, ki fèt ak sipèvize rechèch la. CD, AS, ak RF egalman kontribye nan etid sa a. Tout otè kontribye nan atik la epi apwouve vèsyon an soumèt.

REKONÈS

Nou remèsye Claudia Curci ki soti nan Inite Renal, dyaliz ak transplantasyon, Depatman Ijans ak transplantasyon ògàn yo.

University of Bari pou ekselan asistans teknik la.

KONFLI ENTERÈ

Otè yo deklare ke yo pa gen okenn konfli enterè.

FINANsman

Etid sa a te sipòte pa University of Bari "Aldo Moro", Ministè Sante Italyen an (GR 2016- 02362239 "Yon apwòch ki baze sou transcriptomics pou idantifikasyon faktè prediksyon ak objektif terapetik pou fonksyon grèf reta nanrenmoun ki resevwa transplantasyon", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD te resevwa yon bousdetid sou pwojè sa a) ak Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori"- AIM-1810057-aktivite 2 yo te bay AS.

REFERANS

1. Bonventre JV, Yang L. Fizyopatoloji selilè nan ischemik egirenblesi. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Repons iminitè natirèl la nan ischemi egirenblesi. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Konpleman: yon sistèm kle pou siveyans iminitè ak omeyostazi. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Wòl santral la nan chemen an konpleman altènatif nan maladi imen. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID:16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Enflamasyon ak sistèm konpleman: yon lyen ant egirenBlesi ak domaj grèf kwonik. Avant Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxins nan iminite natirèl: leson nan PTX3. Tisi selil Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) nan limyè a nan estrikti li yo, mekanis nan aksyon ak enplikasyon klinik. Otoiminite. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): yon modulator andojèn nan repons enflamatwa. Medyatè Enflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxins nan kafou ant iminite natirèl, enflamasyon, depozisyon matris, ak fètilite fi. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Long pentraxin PTX3 a kòm yon reseptè rekonesans modèl umoral prototip: entèraksyon ak iminite natirèl selilè. Immunol Rev 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Synergy ant ficolin -2 ak pentraxin 3 ranfòse rekonesans iminitè natirèl ak depozisyon konpleman. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 modules immunoflogosis nan timè. mikwo-anviwònman epi li se yon faktè pronostik pou pasyan ki gen kansè selil ren selil klè. Aging (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Long pentraxin PTX3 a enpòtan anpil pou enflamasyon tisi apre

iskemi entesten ak repèfizyon nan sourit. Mwen J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Reseptè a rekonesans modèl umoral PTX3 se estoke nan granules neutrophil ak lokalize nan pyèj ekstraselilè. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Plasma pentraxin 3 nan pasyan ki gen kwonikrenmaladi: asosyasyon ak fonksyon ren, pwoteyin-enèji, gaspiye, maladi kadyovaskilè, ak mòtalite. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Nivo sikile wo ak ekspresyon tisi nan pentraxin 3 nan uremi: yon refleksyon malfonksyònman andotelyal. PLoS Youn. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Wòl nan reseptè a rekonesans modèl idrosolubl PTX3 nan byoloji vaskilè. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. pentraxins yo PTX3 ak SAP nan iminite natirèl, règleman nan enflamasyon ak renovasyon tisi. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 inibit egi fibwoz entèrstisyal blesi ren pwovoke atravè repwesyon IL-6/Stat3 chemen. Enflamasyon. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. Bò "dous" nan yon pentraxin long: ki jan glycosylation afekte fonksyon PTX3 nan iminite natirèl ak enflamasyon. Avant Immunol. 2013; 3:407. PMID:23316195