PRAT 1 Cistanches Deserticola PhG-RE Atravè Mekanis Apoptoz ERS Inibisyon Pou Pwoteje Apoptoz Selil Myokad De H2O2- Estrès Retikul Endoplasmik Enduit

Pou plis enfòmasyon tanpri kontakte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola gen anpil efè, klike isit la pou konnen plis

Depatman famasi, Lachin-Japon Inyon Lopital nan Jilin University, Changchun 130033, Lachin

Korespondans yo ta dwe adrese a Qian Yu; yuqian@jlu.edu.cn

Resevwa 9 jen 2020; Revize 15 Jiyè 2020; Aksepte 24 Jiyè 2020; Pibliye 25 septanm 2020

Editè Akademik: Michel Mansur Machado

Copyright © 2020 Tianwei Lan ak Qian Yu. Sa a se yon atik aksè ouvè ki distribye anba Lisans Creative Commons Attribution, ki pèmèt itilizasyon, distribisyon ak repwodiksyon san restriksyon sou nenpòt mwayen si travay orijinal la byen site.

Zèb laCistanchedeserticolagen kèk efè pwoteksyon myokad. Etid sa a te eseye eksplike mekanis kote PhG-RE pwoteje selil myokad yo epi verifye si pwoteksyon sa a rive nan reglemante mekanis apoptoz ki asosye ak estrès retikul endoplasmik (ERS). Selil myokad rat yo te ekspoze a 150 ug mL-1 PhG-RE pou 24 èdtan ak Lè sa a, nan 100 μmol mL-1 H2O2 pou 18 èdtan pou pwovoke ERS epi etabli yon modèl domaj selil. Thapsigargin (TG), yon activateur ERS espesifik, ak 4- asid fenil butirik (4-PBA), yon inibitè ERS, yo te itilize pou valide presizyon eksperyans la. Rezilta nou yo te demontre ke PhG-RE te amelyore anpil viabilite selil, pwoteje selil yo, epi redwi domaj selil ak apoptoz. PhG-RE te jwe yon wòl ki sanble ak inibitè ERS 4-PBA nan pwoteje selil myokad yo kont apoptoz ak domaj estrès ER pwovoke. Anplis de sa, PhG-RE siyifikativman atenue ekspresyon mRNA faktè apoptotik ki asosye ak ERS GRP78, CHOP, ak Caspase-12 ak ekspresyon pwoteyin nan faktè apoptotik ki asosye ak ERS GRP78, CHOP, Caspase-12, ak p-JNK. Ansanm, rezilta sa yo sijere ke PhG-RE ka efektivman pwoteje selil myokad yo epi redwi apoptoz selil ak domaj, ki ka gen rapò ak règleman ERS ki asosye ak apoptoz.

1. Entwodiksyon

Cistanche deserticola(C. deserticola) se youn nan plant èrbal yo itilize nan medikaman tradisyonèl Chinwa ki grandi nan anviwònman dezè. Lafeniletanoidglikozid-rich ekstrè (PhG-RE) se eleman prensipal aktif nanC. deserticola. Rechèch yo te jwenn ke PhG-RE ka pwoteje myokad la kont aksidan ischemi-reperfusion (I/R) [1].

Lè ERS kòmanse rive nan selil myokad yo, nivo pwoteyin 78 ki kontwole glikoz (GRP78) ogmante pou antagonize yon blesi ERS-induit. Pandan ERS ap pwogrese, apoptoz inisye, epi ekspresyon CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP), c-Jun N-terminal kinase (JNK), ak sisteinil aspartat proteinaz espesifik-12 (Caspase{{8). }}) ogmante. Pou egzanp, ekspresyon GRP78, CHOP, ak clived ATF6 (c-ATF6) nan selil myokad rat ak HF ogmante siyifikativman, ak PERK (p-PERK), IRE1 (p-IRE1), ak p-JNK aktive. [2]. Anplis de sa, ERS pwovoke pa aksidan I / R ogmante ekspresyon GRP78 ak CHOP [3]. Nivo fosforilasyon PERK ak eIF2 ogmante [4]. Ekspresyon pwoteyin pro-apoptotik Bax ak Caspase -3 ogmante, sa ki lakòz rupture selil ak renovasyon myokad [5], ak zòn nan enfaktis myokad ak aktivite anzimatik myokad yo ogmante [3]. Li te jwenn pandan rechèch anvan nou yo ke PhG-RE ka pwoteje myokad la kont aksidan ischemi-repèfizyon epi li ka siyifikativman redwi zòn nan enfaktis myokad pwovoke pa I / R [1]. Sepandan, li pa klè si PhG-RE ka anpeche apoptoz ki asosye ak ERS epi kidonk diminye pèt selil myokad ak apoptoz. Nan etid sa a, selil yo te pretrete ak PhG-RE pou obsève si PhG-RE ka anpeche ERS H2O2-pwovoke epi kidonk diminye pèt selil myokad ak apoptoz. Thapsigargin (TG), yon activateur espesifik ERS, ak 4-asid fenil-butirik (4-PBA), yon inibitè ERS, yo te itilize pou plis verifye si medyasyon ERS ka efektivman redwi apoptoz selilè epi si pwosesis sa a. gen rapò ak nivo ekspresyon GRP78, CHOP, JNK, ak Caspase-12, ki te montre yo medyatè ERS ki asosye.apoptoz.

Cistanche ka anpeche apoptoz selil

2. Materyèl ak Metòd

2.1. Reyaktif.

Seksyon materyèl ak metòd yo ta dwe konplè pou tout pwosedi yo ka repete. Li ka divize an sou-seksyon ki gen tèt si yo dekri plizyè metòd. Selil myokad H9c2 rat yo te jwenn nan Bank selilè Akademi Syans Chinwa a (Shanghai, Lachin).C. deserticolaCistanchedeserticolaPhG-RE te jwenn nan Changchun Medicinal Material Co. (Changchun, Lachin), Dr. Zhong-ying Liu (Lekòl Syans famasetik, Jilin University) idantifye epi li depoze nan èrbyòm Depatman Famasi, Jilin University (Echantiyon bon. nimewo: YQCD2014). Mwayen Eagle's modifye Dulbecco a (DMEM) te jwenn nan GIBCO (Grand Island, NY). Thapsigargin ak 4-PBA te jwenn nan Sigma (St. Louis, MO). Yo te achte yon twous tès aktivite laktat de-hydrogenase (LDH) ak twous CCK-8 nan Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japon). Serom fetal bovine (FBS) te achte nan HyClone (Utah, USA). Yon twous tès apoptoz selil Annexin V-FITC te achte nan men Beyotime Biotechnology (Shanghai, Lachin). Trypsin te achte nan men Beijing Solarbio Life Sciences (Beijing, Lachin). Yo te achte yon twous ReverTra Ace qPCR RT nan men TOYOBO (Tokyo, Japon). FastStart Universal SYBR Green master mix (Rox) te achte nan men Roche (Basel, Swis).

2.2. Antikò.

Lapen polyclonal GADD153/CHOP ak lapen polyclonal GRP78/HSPA5 Abs te achte nan men Novus (Colorado, USA). Yo te achte Ab poliklonal sourit/rat kaspase-12 nan men R&D Systems (Minnesota, USA). Fospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) lapen ak -actin (13E5) mAb lapen yo te achte nan men Cell Signaling Technology (Massachusetts, USA). Fluoresan segondè Abs te achte nan LI-COR Biosciences (Nebraska, USA).

2.3. Gwoupman ak Tretman.

Selil H9c2 nan faz kwasans logaritmik yo te chwazi epi trete nan gwoup sa yo: (1) gwoup kontwòl: selil myokad H9c2 yo te kiltive nan yon mwayen konplè; (2) Gwoup PhG-RE: selil yo te trete pou 24 èdtan nan yon mwayen ki gen 150 ug mL-1 PhG-RE; (3) Gwoup modèl aksidan ERS-induit (gwoup H2O2): selil yo te trete pou 18 èdtan nan yon mwayen ki gen 100 μmol mL-1 H2O2; (4) (PhG-RE) -H2O2 gwoup: selil yo te trete pou 24 èdtan nan yon mwayen ki gen 150 ug mL-1 PhG-RE ak Lè sa a, pou 18 èdtan nan 100 μmol mL-1 H2O2; (5) (4-PBA)

–Gwoup H2O2: selil yo te trete pou 24 èdtan nan yon mwayen kilti ki gen 5 mmol·mL-1 4-PBA epi answit pou 18 èdtan nan 100 μmol·mL-1 H2O2; (6) Gwoup TG: selil yo te trete pou

18 h nan yon mwayen ki gen 50 nmol·mL-1 TG; ak (7) (PhG-RE) -TG: selil yo te trete pou 24 èdtan nan yon mwayen ki gen 150 ug·mL-1 PhG-RE ak Lè sa a, pou 18 èdtan nan 50 nmol·mL-1 TG.

2.4. Kilti Selil.

Selil myokad H9c2 yo te kiltive nan DMEM ki gen 10 pousan FBS ak 1 pousan penisilin-streptomycin nan 37 degre nan yon enkibatè ak 5 pousan CO2. Mwayen konplè a te ranplase chak 2 d. Selil yo te obsève anba yon mikwoskòp, epi yo grandi byen nan yon fòm fusiform. Lè dansite kwasans lan te rive nan 70 pousan -85 pousan, selil yo te kiltive nan yon rapò 1: 4.

2.5. CCK-8 Evalyasyon Viabilite Selil yo.

Selil H9c2 yo te egzamine mikwoskopik, epi yo te chwazi selil yo nan faz kwasans logaritmik. Sispansyon selil la te jwenn nan yon dijesyon tripsin ak santrifuje pou 5 min nan yon tib santrifujeur 5 mL nan 1000 r min-1. Apre yo fin jete likid rezidyèl la, yo te itilize 3 ml medyòm konplè DMEM pou resuspend granules selil yo nan 100 μL pou chak pi, ak

5.0 103 selil yo te konte anba mikwoskòp la. Selil yo te transfere nan yon plak 96-byen epi yo te kiltive nan yon enkibatè (37 degre, 5 pousan CO2) pou 24 èdtan pou jwenn selil konplètman aderan yo. Dansite optik (OD) te mezire nan yon longèdonn 450 nm.

Selil viabilite (pousan) (OD eksperimantal gwoup - OD gwoup vid)/(OD gwoup kontwòl - OD gwoup vid) × 100 pousan.

2.6. Spectrophotometric Mezi nan blesi selil.

Laktat dehydrogenase (LDH) se yon anzim nan sitoplasm ki lage sou blesi selil la, ki answit egziste estab nan mwayen kilti a. Ou ka detèmine degre blesi selil la lè w mezire aktivite LDH nan mwayen an. Eksperyans sa a te fèt dapre enstriksyon yo pou twous la. Yo te mezire OD a nan yon longèdonn 490 nm. Te gen twa pi nan chak gwoup.

2.7. Apoptoz Deteksyon ak Annexin V-FITC / PI tach.

Sipènatant la te retire epi transfere nan yon tib sitometri koule. Yo te prepare yon sispansyon selil ak selil aderan nan pati anba a nan veso dijesyon tripsin la. Apre yo te santrifize sispansyon an pou 6 min nan 1.2 103 r min-1, yo te jete supernatant la, epi granules selil yo te lave twa fwa ak PBS. Eksperyans sa a te fèt dapre enstriksyon yo pou twous apoptoz selil Annexin V-FITC. Apre selil yo te kiltive pou 15 minit nan tanperati chanm nan fè nwa a, selil yo te analize ak yon sitomèt koule.

2.8. Mezi RT-qPCR nan ekspresyon mRNA relatif GRP78, CHOP, JNK, ak Caspase -12.

Total RNA selilè yo te ekstrè ak yon reyaktif TRIzol. De mikrolit RNA total yo te separe pa elektwoforèz jèl pou evalye entegrite ekstraksyon an. Yo te itilize yon espektrofotomèt pou mezire ak kalkile valè OD (260)/OD (280). Yo te transkri RNA total pou pwodui cDNA dapre enstriksyon yo pou twous TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT la. Tablo 1 montre lis primè yo. Dapre enstriksyon yo pou melanj Roche FastStart Universal SYBR Green mèt (Rox), kondisyon reyaksyon yo te jan sa a: premye denaturasyon nan 95 degre pou 10 minit, 95 degre pou 10 s, 58 degre pou 30 s, ak 72 degre pou 30 s. s pou yon total de 45 cycles.

2.9.Western Blot Analiz ekspresyon Pwoteyin GRP78, CHOP, JNK, p-JNK, ak Caspase-12.

Pwoteyin Lysate (50 ug) te separe pa elektwoforèz sou yon jèl separe 10 pousan, ki te swiv pa transfere nan yon manbràn PVDF. Manbràn PVDF la te bloke nan TBS-Rezolisyon ki gen 5 pousan lèt ekreme nan tanperati chanm pou 90 min. Yo te enkube manbràn PVDF ki bloke lannwit lan ak antikò 1, 2, 3, ak 4 nan 4 degre, ak Lè sa a, pou 90 minit ak kabrit anti-lapen IgG (1: 1000) nan tanperati chanm. Finalman, manbràn la te devlope ak yon sistèm D' lazè enfrawouj de koulè.

2.10. Metòd estatistik ak analiz.

Done etid sa a te trete ak lojisyèl SPSS 24.0, epi rezilta yo prezante kòm mwayen ± SD. Done ki soti nan plizyè gwoup yo te konpare ak ANOVA, pandan y ap done ki soti nan de gwoup yo te konpare ak t-tès. Yo te konsidere yon valè P < 0.05="" ki="" gen="" yon="" siyifikasyon="" estatistik.="" lojisyèl="" imagej="" te="" itilize="" pou="" analize="" kantite="" gri="" valè="" gwoup="" pwoteyin="">

PhenylethanoidGlikozidnansistanch

3. Rezilta yo

3.1. Enfliyans PhG-RE sou viabilite selil.

Jan yo montre nan Figi 1, konpare ak gwoup kontwòl la, viabilite selil H9c2 nan gwoup PhG-RE pa t chanje anpil (P > 0.05), men viabilite nan selil nan tou de H2O2 ak gwoup TG yo diminye anpil. Konpare ak gwoup H2O2, viabilite selil yo nan tou de (PhG-RE)-H2O2 ak (4-PBA)-H2O2 gwoup yo te ogmante anpil. Konpare ak gwoup TG a, viabilite selil nan gwoup (PhG-RE)-TG ogmante anpil. Tout rezilta yo te estatistik siyifikatif (P <>

3.2. Enfliyans PhG-REon Selil Blesi.

Jan yo montre nan Figi 2, byenke selil yo nan gwoup PhG-RE yo te domaje konpare ak sa yo nan gwoup kontwòl la, domaj sa a pa t rive nan siyifikasyon estatistik (P > 0.05). Blesi selilè nan gwoup H2O2 ak TG ogmante anpil. Konpare ak gwoup H2O2, blesi selil nan gwoup (PhG-RE)-H2O2 ak (4-PBA)-H2O2 diminye anpil (P <0.01). konpare="" ak="" gwoup="" tg="" a,="" blesi="" selil="" nan="" gwoup="" (phg-re)-tg="" diminye="" anpil="" (p=""><>

3.3. Enfliyans PhG-RE sou apoptoz selilè.

Jan yo montre nan Figi 3, konpare ak gwoup kontwòl la, apoptoz selil nan gwoup PhG-RE a pa t chanje anpil (P > 0.05), pandan ke nan H2O2 ak TG. gwoup yo te ogmante anpil (P <0.01). konpare="" ak="" gwoup="" h2o2,="" apoptoz="" selil="" nan="" (phg-re)-h2o2="" ak="">

gwoup yo te diminye anpil (P < {{0}}.01).="" konpare="" ak="" gwoup="" tg="" a,="" apoptoz="" selil="" nan="" gwoup="" (phg-re)-tg="" diminye="" anpil="" (p=""><>

3.4. Enfliyans PhG-RE sou ekspresyon GRP78, CHOP, JNK, ak Caspase-12 mRNA.

Ekspresyon mRNA relatif nan chak gwoup eksperimantal te mezire quantitatively ak RT-qPCR. Jan yo montre nan Figi 4, konpare ak gwoup kontwòl la, ekspresyon relatif mRNA GRP78, CHOP, ak Caspase-12 te ogmante anpil (P <0.01) nan="" figi="" a.="" gwoup="" h2o2,="" ak="" ekspresyon="" mrna="" relatif="" jnk="" la="" te="" ogmante="" tou="" (p=""><0.05). nan="" gwoup="" tg="" a,="" ekspresyon="" relatif="" mrna="" grp78,="" chop,="" jnk,="" ak="" caspase-12="" te="" ogmante="" anpil="" (p=""><0.01). konpare="" ak="" gwoup="" h2o2="" a,="" ekspresyon="" relatif="" mrna="" grp78,="" chop,="" ak="" caspase-12="" nan="" gwoup="" (phg-re)-h2o2="" ak="" (4-="" pba)-h2o2="" diminye="" anpil="" (p="">< 0.01),="" pandan="" ke="" ekspresyon="" relatif="" mrna="" jnk="" la="" pa="" t="" chanje="" siyifikativman="" (p=""> 0.05). Konpare ak gwoup TG a, ekspresyon relatif mRNA GRP78, JNK, ak Caspase -12 nan gwoup (PhG-RE)-TG diminye (P <0.01), e="" ekspresyon="" relatif="" mrna="" chop="" pa="" t="" '.="" chanje="" siyifikativman="" (p=""> 0.05).

3.5. Enfliyans PhG-RE sou ekspresyon Pwoteyin GRP78, CHOP, ak Caspase -12.

Figi 5 montre nivo ekspresyon pwoteyin GRP78, CHOP, ak Caspase-12. Konpare ak gwoup kontwòl la, ekspresyon twa pwoteyin sa yo nan gwoup H2O2 ak TG ogmante anpil apre yo fin trete selil yo (P <{6}}.{20}}1). konpare="" ak="" gwoup="" h2o2="" a,="" ekspresyon="" grp78,="" chop,="" ak="" caspase-12="" diminye="" anpil="" nan="" (phg-re)-h2o2="" ak="" (4-pba)-h2o2="" gwoup="" (p=""><0.01) .="" konpare="" ak="" gwoup="" tg="" a,="" ekspresyon="" grp78,="" chop,="" ak="" caspase-12="" nan="" gwoup="" (phg-re)-tg="" diminye="">

3.6. Enfliyans PhG-RE sou JNK ak p-JNK.

Jan yo montre nan Figi 6, konpare ak gwoup kontwòl la, ekspresyon p-JNK nan gwoup H2O2 ak TG ogmante anpil (P < 0.01).="" konpare="" ak="" gwoup="" h2o2="" a,="" ekspresyon="" p-jnk="" nan="" gwoup="" (phg-re)-h2o2="" ak="" (4-="" pba)-h2o2="" diminye="" anpil="" (p=""><0.{{24} }1).="" konpare="" ak="" gwoup="" tg="" a,="" ekspresyon="" p-jnk="" nan="" gwoup="" (phg-re)-tg="" diminye="" anpil="" (p=""><0.01). konsènan="" ekspresyon="" jnk,="" pa="" te="" gen="" okenn="" chanjman="" enpòtan="" nan="" nenpòt="" nan="" gwoup="" eksperimantal="" yo="" (p=""> 0.05).

Cistancheka anpecheselilapoptoz